人类胚胎干细胞：从冻存细胞开始培养

摘要

本文展示了我们的实验室如何从冻存株开始培养HuES人类胚胎干细胞系。

摘要

在此，我们演示本实验室如何从冻存细胞开始建立HuES人胚胎干细胞系的培养。首先，取一至两天前制备的、直径10 cm、含有约一百万（至二百万）经辐照处理的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层的培养皿，用HuES培养基冲洗以去除残留血清和细胞碎片，随后加入HuES培养基，并置于细胞培养孵箱中平衡。接着，从长期液氮储存或-80°C冰箱中取出一支冻存细胞管，迅速浸入37°C水浴中快速解冻。将冻存液中的细胞从冻存管中移出，转移至大量HuES培养基中。大量HuES培养基有助于去除过量的血清和二甲基亚砜（DMSO），这些成分可能诱导HuES人胚胎干细胞发生分化。细胞经轻柔离心沉淀后，重新悬浮于少量新鲜HuES培养基中，用于接种MEF饲养层培养皿。接种时应以逐滴方式轻柔加入HuES细胞，使其在培养皿中均匀分布，此步骤被认为至关重要。新建立的HuES细胞培养皿在更换培养基前需放回孵箱培养48小时，之后每24小时更换一次培养基。 关键词：HuES人胚胎干细胞，冻存细胞复苏，小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层，细胞解冻，培养基更换，DMSO去除，细胞接种

方案

从冻存菌种中解冻：

1. 在解冻HuES细胞之前，请确保您已准备好的MEF培养板接种良好且状态正常。切勿使用状态不佳或超过三天的培养板。建议预先标记所有将要使用的锥形管和孔板孔位。
   
   
2. 将HuES培养基预热至37°C。为每种细胞系将HuES培养基分装至无菌锥形管中。从-80°C取出HuES冻存管，立即将管底一半浸入37°C水浴中。约需45-60秒，直至细胞解冻约80%（仍残留少量冰晶）。
   
   
3. 迅速将冻存管转移至超净工作台，用70%酒精喷洒消毒，然后小心地将细胞转移至预热的培养基中。轻轻混匀后离心，弃去上清液，并用适量新鲜预热的HuES培养基重悬细胞。
   
   
4. 吸除将要接种细胞的各个MEF孔中的原有培养基。迅速将预热的HuES培养基重新分装至培养板的每个孔中，注意不要扰动已贴壁的MEF细胞。将培养板暂置于超净台内。与MEF培养类似，若液滴在培养板上分布均匀，则效果最佳。小心地将培养板放回37°C培养箱过夜，以使HuES细胞充分贴附于MEF细胞层上。解冻后约48小时更换培养基，换用新鲜的HuES培养基。

讨论

在本视频中，我们展示了实验室如何从冻存细胞中常规建立HuES人类胚胎干细胞培养体系。如果细胞以DMSO溶液冻存，则该过程适用于任何哺乳动物细胞的常规操作。高效地解冻对于从冻存细胞中成功建立新的HuES细胞培养体系至关重要，并且对实验结果的一致性具有重要意义。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HuES 培养基 651.5 ml KO-DMEM，500 ml 青霉素-链霉素，6.5 ml 谷氨酰胺，6.5 ml 非必需氨基酸，6.5 ml β-巯基乙醇–乙醇 0.5 µl KO 血清替代物 65 ml，Plasmanate 65 mL，bFGF2（终浓度 10 ng/mL）0.65 ml