本视频演示了全基因组平铺阵列比较基因组杂交（CGH）的杂交实验技术，该技术仅需25-100 ng DNA即可扫描整个人类基因组，DNA可来源于多种样本，包括存档的甲醛固定组织材料。
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本文内容
摘要
摘要
基因组拷贝数变异检测芯片（array CGH）是一种用于检测基因组中DNA片段的重复或缺失，以及基因剂量变化的方法1。该技术的最新进展使得能够在全基因组范围内进行高分辨率比较，从而识别癌症及其他遗传性疾病中的遗传变异2。亚兆碱基分辨率平铺阵列（Sub-Megabase Resolution Tiling-set array，简称SMRT阵列）由约三万个覆盖人类基因组、彼此重叠的细菌人工染色体（BAC）克隆组成，以约100千碱基对（kb）的片段形式分布于全基因组2。这些BAC探针各自被独立合成，并在单张载玻片上以双份点样2-4。array CGH基于竞争性杂交原理：将待测样本DNA与参照DNA分别用Cyanine-3和Cyanine-5荧光染料标记后，共同杂交至芯片上。经过孵育后，洗去未结合的样本，再对芯片进行成像。采用一种名为SeeGH（www.flintbox.ca）的免费自定义软件包处理所采集的大规模数据——单次实验可生成53,892个数据点。SeeGH将两个样本在每个BAC探针位置的log2信号强度比值可视化，并按染色体位置垂直排列5,6。SMRT阵列可检测小至50 kb的基因组变异7。该阵列能够识别多种DNA重排事件，包括DNA重复、缺失、扩增以及纯合性缺失。SMRT阵列的一个独特优势在于可使用甲醛固定石蜡包埋（FFPE）样本中提取的DNA。结合其对未扩增DNA较低的起始量需求（25–100 ng），使得微量样本（如显微切割获得的样本）的分析成为可能7,8。这得益于每个BAC杂交探针较大的尺寸，能够结合足够量的标记样本以产生可检测信号。该平台的另一优势是对组织异质性的耐受性较高，从而减少了繁琐的显微切割操作需求8。本视频实验方案为全程逐步指导，涵盖从输入DNA标记到全基因组平铺路径SMRT阵列信号获取的全部流程。
方案
探针标记
注意：始终避免 Cye Dyes 暴露于光照（可通过在避光环境中操作，或使用铝箔等遮盖物覆盖离心管来实现）
- 混合：
（设置1个反应管作为参照，1个反应管作为样品）- DNA（25–400 ng）
- 5 µL 5X 随机引物缓冲液（终浓度：5X Promega Klenow 缓冲液和 7 µg/µL 随机八聚体）
- 用蒸馏 H2O 定容至总体积 17.0 µL
- 在 100°C 下煮沸 10 分钟，立即转移至冰上冷却 1 分钟。
- 加入 4 µL 10X dNTP 混合液（2 mM dATP、dGTP、dTTP，1.2 mM dCTP）。
- 加入 CyeDyes：
- 向样品 DNA 中加入 2 µL（2 nmol）Cy-3 标记的 dCTP
- 向参照 DNA 中加入 2 µL（2 nmol）Cy-5 标记的 dCTP（例如 Novagen 人基因组 DNA）
- 加入 2.5 µL Klenow 酶（9 U/µL，Promega），混匀。
- 在 37°C 下孵育过夜*（约 18 小时）。
*过夜杂交时间可在 14 至 24 小时之间调整，不会对标记过程产生不利影响，可根据实验室工作安排灵活设置。
样品纯化
（合并探针纯化及杂交前准备）
- 使用 Microcon YM-30 柱：
- 向柱中加入 100 µL Cot-1 DNA（1µg/µL）。移液枪头切勿接触膜。
- 合并反应液（参照样本和待测样本），并加入柱中。
- 将柱放入提供的收集管中，在 13000 g 条件下离心 10 分钟。
- 向膜上加入 200 µL 蒸馏水 H2O，重复离心以洗涤。
- 弃去收集管，向柱中加入 45 µL 杂交溶液（Roche DIG Easy）。
- 将 Microcon 柱倒置，放入一个新的标记管中，在 3000 g 条件下离心 3 分钟。
掺入量的计算
- 移取1.5 µL，使用NanoDrop分光光度计测定荧光染料的掺入情况。 使用杂交缓冲液作为空白对照（DIG Easy），按照屏幕上的说明进行操作。（测量后可根据需要从底座上回收样品。）
(注意： 任一通道中掺入量低于 3.0 pmol/µL 时，结果均显示不稳定。 - 85°C 下变性 10 分钟。
- 将探针置于45°C 30分钟至1小时（使Cot-1 DNA退火）。
基因芯片杂交
- 将 44 µL 探针溶液滴加到盖玻片（22 mm × 60 mm）（Fisher Scientific）上。如有条件，将盖玻片置于预热至 45°C 的载玻片加热器或加热块上以维持温度。
- 将载玻片对准盖玻片及探针溶液上方，缓慢放下载玻片的一边，使其与杂交溶液接触。继续缓慢放下，直至盖玻片因表面张力附着于载玻片上。翻转载玻片。
- 将载玻片放入预热至 45°C 的杂交盒（Telechem）中，并在下方凹槽内加入 10 µL 水（用于控制杂交过程中的湿度）。
- 密封杂交盒，并在 45°C 下孵育 36 – 40 小时。
阵列洗涤
注意：所有洗涤溶液的 pH 值均为 7.0
从杂交盒中取出载玻片至关重要。DIG Easy 在室温下会迅速结晶。载玻片应立即浸入洗涤液中，并在洗涤液中移除盖玻片。
- 在打开杂交室之前，向考普林瓶中加入约 60 mL 的 0.1XSSC、0.1% SDS（pH 7.0，45°C）洗涤液。
- 打开杂交室，将玻片放入洗涤液中，并取下盖玻片（应可自然滑落）。
- 在 45°C 条件下，用 0.1XSSC + 0.1% SDS 溶液振荡洗涤玻片，每次 1 分钟，共洗涤 3 次。
- 用新鲜的 0.1XSSC 溶液冲洗玻片 3 次。应无 SDS 洗涤后残留的气泡可见。
*玻片可在最后一次洗涤液中保留，直至准备离心和扫描（约 15 分钟）。 - 将玻片置于 50 mL Falcon 管中，在 700 g 条件下离心 3 分钟。
- 立即扫描玻片（信号强度会随时间减弱）。
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讨论
质量差的DNA无法提供良好的杂交图谱。在开始杂交实验之前，必须确保样本DNA和参照DNA不含可能干扰随机引物标记步骤的污染物，例如苯酚、RNA、盐类等。例如，不建议将DNA重悬于Tris-EDTA（TE）缓冲液而非水中，因为高盐浓度可能抑制标记反应。我们推荐使用Nanodrop分光光度计检测DNA质量，以测定DNA的浓度、吸光度曲线的整体形状以及260/280和260/230的比值。
洗涤：将载玻片从杂交盒中取出并转移至预热的洗涤液是杂交过程中的关键步骤，因为 DIG Easy 杂交液会迅速结晶。洗涤液需保持中性 pH，其温度对于去除未结合探针时的严谨性至关重要。在干燥载玻片后，若不立即扫描，或计划在将来重新扫描，应将其避光保存。
臭氧：在进行阵列比较基因组杂交（array CGH）时，臭氧已成为全球关注的问题。当臭氧浓度超过5 ppm时，已被证明会对Cye染料产生不利影响。其中，Cye 5尤其容易受到臭氧降解的影响。在扫描前及扫描过程中，最大限度减少臭氧暴露是防止Cye染料降解和信号损失的关键。例如，在夜间进行扫描（此时...
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致谢
我们谨向Wan Lam实验室BAC芯片团队的成员表示感谢，特别是Miwa Suzuki和Bryan Chi，感谢他们为本文撰写所做的准备工作。本研究得到了加拿大卫生研究院、Genome Canada/Genome British Columbia以及美国国立卫生研究院口腔与颅面研究所资助项目RO1 DE15965-01的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 5X Klenow 缓冲液 | 试剂 | Promega Corp. | ||
| 随机八聚体 | 试剂 | Alpha DNA | ||
| 10X dNTP 混合液 | 试剂 | Promega Corp. | 2 mM dATP、dGTP、dTTP，1.2 mM dCTP | |
| Cy-3 标记的 dCTP | 试剂 | GE Healthcare | ||
| Cy-5 标记的 dCTP | 试剂 | GE Healthcare | ||
| 人基因组 DNA 参考品 | 试剂 | Novagen, EMD Millipore | 可能的参考品示例 | |
| Klenow 酶 | 试剂 | Promega Corp. | ||
| YM-30 柱 | 试剂 | EMD Millipore | ||
| Cot-1 DNA | 试剂 | Invitrogen | ||
| DIG Easy | 试剂 | Roche Group | ||
| 剪切的鲱鱼精子 DNA | 试剂 | Promega Corp. | ||
| 盖玻片 | 试剂 | Fisher Scientific | 22 mm × 60 mm | |
| 杂交盒 | 工具 | Telechem |
参考文献
- Lockwood, W. W., Chari, R., Chi, B., Lam, W. L. Recent advances in array comparative genomic hybridization technologies and their applications in human genetics. European Journal of Human Genetics. 14, 139-1x`48 (2006).
- Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Watson, S. K., deLeeuw, R. J., Chi, B., Coe, B. P., Snijders, A., Albertson, D. G., Pinkel, D., Marra, M. A., Ling, V., MacAulay, C., Lam, W. L. A tiling resolution DNA microarray with complete coverage of the human genome. Nature Genetics. 36, 299-303 (2004).
- Watson, S. K., DeLeeuw, R. J., Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Lam, W. L. Methods for high throughput validation of amplified fragment pools of BAC DNA for constructing high resolution CGH arrays. BMC Genomics. 5, 6(2004).
- Watson, S. K., DeLeeuw, R. J., Horsman, D. E., Squire, J. A., Lam, W. L. Cytogenetically balanced translocations are associated with focal copy number alterations. Human Genetics. 120, 795-805 (2007).
- Chi, B., DeLeeuw, R. J., Coe, B. P., MacAulay, C., Lam, W. L. SeeGH -- a software tool for visualization of whole genome array comparative genomic hybridization data. BMC Bioinformatics. 5, 13(2004).
- Chi, B., DeLeeuw, R. J., Coe, B. P., Ng, R. T., MacAulay, C., Lam, W. L. MD-SeeGH: a platform for integrative analysis of multi-dimensional genomic data. BMC Bioinformatics. 9, 243(2008).
- Coe, B. P., Ylstra, B., Carvalho, B., Meijer, G. A., Macaulay, C., Lam, W. L. Resolving the resolution of array CGH. Genomics. 89, 647-653 (2007).
- Garnis, C., Coe, B. P., Lam, S. L., MacAulay, C., Lam, W. L. High-resolution array CGH increases heterogeneity tolerance in the analysis of clinical samples. Genomics. 85, 790-793 (2005).
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