全基因组阵列比较基因组杂交技术示范

Summary

这个视频是一个全基因组平铺路径阵列比较基因组杂交，扫描整个人类基因组只用25-100纳克的DNA，可以从多种来源，包括档案福尔马林固定材料隔离​​技术示范的杂交协议。

Abstract

阵列比较基因组杂交（阵列CGH）技术是一种检测DNA片段或基因的基因组中的¹剂量的收益和损失的方法。这项技术的最新进展，使高分辨率的整个基因组的遗传变异在癌症和其他遗传性^疾病 2鉴定比较。小组Megabase分辨率平铺设置阵列（SMRT）阵列是由一组细菌人工染色体（BAC），跨越^2〜100个碱基对的人类基因组（KB）段的克隆约三万重叠。这些BAC的目标是独立的合成和发现重复单一^载玻片 2-4 。阵列比较基因组杂交的基础上有竞争力的杂交的原则。样品和参照DNA差异与菁- 3标记和荧光染料菁- 5，和合作的阵列杂交。潜伏期后，未​​结合的样品从幻灯片冲洗成像阵列。 SeeGH（www.flintbox.ca）免费提供的自定义软件包是用来处理大量的数据收集 - 一个单一的实验产生53892个数据点。 SeeGH可视化之间在每个BAC目标的2样品与^5,6染色体的位置，这是垂直对齐的log2信号强度的比值。 SMRT的阵列，可以检测高达50 KB的^大小 7小的改动。 SMRT的阵列，可以检测多种，包括DNA的收益，损失，扩增和纯合性缺失的DNA重组事件。 SMRT的阵列的一个独特优势是，可以使用从福尔马林固定石蜡包埋样品中分离DNA。当与非放大的DNA（25 - 100ng）的低投入的要求相^结合 ，这使得如7,8显微切割生产的珍贵样品的分析。这要归功于大尺寸每个BAC杂交的目标，让约束力，以生产足够的标记的样品进行检测的信号。这个平台的另一个优势是组织异质性的耐受性，减少繁琐^的组织显微切割8的需要。此视频的协议是一个标签输入DNA，通过对整个基因组的瓦片路径SMRT的阵列信号收购一步一步的教程。

Protocol

探针标记

注:限制接触CYE染料在任何时候都光（这可以通过在黑暗的领域工作，或屏蔽如铝箔盖管）

1. 结合:
   （安装1个反应管样品，以供参考和1个反应管）
   • DNA（25-400纳克）
   • 5μL5X缓冲随机引物（终浓度:5X Promega公司的Klenow缓冲和7微克/μL，随机八聚体）
   • 稀释到17.0μL，用蒸馏水H _{2 O}的总体积
2. 煮沸10分钟，在100 ° C。立即转移到1分钟的冰。
3. 加入4μL10X dNTP混合液（2MM的dATP，dGTP，dTTP的，1.2mm的dCTP）。
4. 新增CyeDyes:
   • CY - 3标记的dCTP 2μL（2 nmoles）样品DNA
   • CY - 5标记的dCTP 2μL（2 nmoles）参考DNA（例如，Novagen公司人类基因组DNA）
5. 添加2.5μL的Klenow（9 U /μL，Promega公司）和混合。
6. 在37 ° C孵育过夜*（〜18小时）。
   
   *杂交过夜时间可以调整14至24小时之间，无不良影响贴标过程，以适应实验室时间表。

样本数据库

（探头的清理和准备杂交组合）

1. 使用一个单片机YM - 30柱:
   • 添加100μLCOT - 1 DNA（1μg/μL）列。请勿触摸膜与枪头。
   • 游泳池的反应（参考样本），并添加到列。
   • 将列在提供管和旋转10分钟，在13000克。
   • 加入200微升蒸馏水₂ 0膜和重复旋转洗。
   • 丢弃管，添加45μL杂交液:（罗氏辛易）
   可选:添加5μL剪切鲱鱼精子DNA（10μg/μL单位，Promega公司）
   
   • 反转单片机，在一个新的标记管的地方，并在3000克3分钟旋转。

的法团的计算

1. 卸下1.5μL和使用NanoDrop分光光度计测量荧光法团。使用您的杂交缓冲液作为空白（辛轻松）按照屏幕上的指示。 （您可以从底座中恢复过来的样品，测量后，如果必要的。）
   
   （ 注:低于3.0 pmol /μL在任一通道的法团有不同的结果。 ）
   
   
2. 变性在85 ° C 10分钟。
3. 将探头放置在45 ° C 30分钟至1小时（允许COT - 1 DNA退火。）

阵列杂交

1. 广场44μL到盖玻片探头解决方案（22毫米× 60毫米）（尔科技）。如果可以，盖玻片放在幻灯片温暖或热块预热至45 ° C，保持温度。
2. 对齐滑动盖玻片和探头解决方案，低的一个幻灯片的边缘，使杂交液接触。继续降低，直到盖玻片表面张力的幻灯片。反向滑动。
3. 放置到杂交带（Telechem）的幻灯片，预热至45 ° C，并添加10μL的水，在低槽（控制杂交过程中的湿度）。
4. 密封的纸盒和孵育36 - 40小时在45 ° C。

阵列洗涤

注:所有的清洗解决方案，在pH 7.0

从杂交盒去除幻灯片是至关重要的。辛轻松快速晶体在室温下。幻灯片，应立即浸入和盖玻片，在洗涤液中删除。

1. 加入约60毫升0.1XSSC，0.1％SDS（pH值7.0，45℃）洗一个Coplin JAR的解决方案之前，开放的杂交室。
2. 开放室，添加幻灯片洗涤液，取出盖玻片（应滑出）。
3. 洗净幻灯片0.1XSSC 3倍+ 0.1％SDS在45℃，各1分钟与躁动。
4. 冲洗幻灯片新鲜0.1XSSC的3倍*。应无残留的气泡从SDS洗可见。
   
   *幻灯片可以保持在最后的洗涤液，直到准备离心机和扫描（〜15分钟）。
   
   
5. 离心3分钟，在700克50毫升猎鹰管的幻灯片。
6. 立即扫描幻灯片（信号强度会随着时间的推移减弱。）

Discussion

质量差的DNA，将不会提供一个良好的杂交个人资料。它是必不可少的，以确保样品和参照DNA污染物，如苯酚，RNA，盐等可能与干预的随机总理标签步骤之前开始杂交实验。例如再悬浮的DNA在Tris - EDTA代替水（TE）是不建议高盐浓度能抑制标记反应。我们建议使用Nanodrop分光光度计测量DNA的数量以及吸光度曲线的整体形状和260/280，二百三十分之二百六十零比例化验DNA的质量。

洗衣机:从杂交盒中删除的幻灯片，并转移到加热洗涤液是在杂交过程中关键的一步，掏轻松杂交液的结晶速度非常快。重要的是清洗解决方案，在中性PH值和洗涤液的温度是重要的紧缩的，同时去除未结合的探针。干燥后的幻灯片，它是重要的，以保持他们在黑暗中，如果不马上扫描，扫描后，如果你想在稍后的时间重新扫描。

臭氧:臭氧已成为全世界关注的执行阵列比较基因组杂交时。 5PPM以上的臭氧水平已经表明，产生不利影响CYE染料。 CYE 5是特别敏感，臭氧降解。防止CYE染料退化和扫描之前和期间的信号损失，最大限度地减少臭氧接触是关键。扫描晚上例如，当环境臭氧是通常较低，是一个可行的选择。市售的冲洗和扫描的自动幻灯片和各种化学幻灯片治疗无臭氧罩。耐臭氧CYE染料最近也得到了发展。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5X Klenow 缓冲液	试剂	Promega Corp.
随机八聚体	试剂	Alpha DNA
10X dNTP 混合物	试剂	Promega Corp.		2mM dATP、dGTP、dTTP、1.2mM dCTP
Cy-3 标记的 dCTP	试剂	GE Healthcare
Cy-5 标记的 dCTP	试剂	GE Healthcare
人类基因组 DNA 参比	试剂	Novagen、EMD Millipore		可能的参比试剂示例
Klenow	Reagent	Promega Corp.
YM-30 色谱柱	试剂	EMD Millipore
Cot-1 DNA	试剂	Invitrogen
DIG Easy	试剂	Roche Group
剪切鲱鱼精子 DNA	试剂	Promega Corp.
盖玻	片试剂	Fisher Scientific		22 mm x 60 mm
杂交盒	工具	Telechem