在自由活动动物的不同脑区中监测细胞外神经递质水平，有助于揭示神经递质释放与行为之间的关联。结合电化学检测的活体微透析技术可提供优异的解剖学和化学分辨率，并可用于研究药理学或生理学干预如何改变基础神经递质传递。
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本文内容
摘要
摘要
在清醒动物的大脑中测量神经递质细胞外基础水平的能力，使得研究人员能够确定不同全身性干预（药理学或生理学刺激）对中枢神经系统（CNS）所产生的影响。例如，可以直接观察动物中脑多巴胺投射系统对多巴胺释放类药物（如d-苯丙胺）或自然刺激（如食物）的反应。在本视频中，我们将展示如何将引导套管植入大鼠脑内的特定靶点，如何插入并植入微透析探针，以及如何使用高效液相色谱结合电化学检测法（HPLC-EC）来测定可氧化神经递质及其代谢物的细胞外浓度。通过微透析探针局部精确给药，可深入研究化合物作用机制的部位特异性。该技术具有优异的解剖和化学分辨率，但时间分辨率相对有限，因为微透析样本通常每20至30分钟收集一次，以确保神经递质水平可被检测。互补的离体工具（例如脑片和细胞培养电生理技术）可辅助实时监测神经传递活动。
方案
摘要
使用氯胺酮（大鼠：60 mg/kg，腹腔注射；小鼠：100 mg/kg，腹腔注射）和赛拉嗪（两种物种均为10 mg/kg，腹腔注射）对平均年龄为两个月的C57BL/6J小鼠或相当品系，或平均年龄为三个月的Sprague Dawley大鼠或相当品系进行麻醉。通过轻柔的脚趾夹捏回缩反射监测镇静程度，该方法见于Walantus 等（JoVE，6，2007）和Szot 等（JoVE，9，2007）的研究。 可通过恒温调节加热垫（ALA Instruments Inc.）维持体温，并使用直肠温度计进行监测。手术切口前，头部毛发被剃除并用碘液清洁。皮肤切口（大鼠长约2 cm，小鼠长约1 cm）后，清除颅骨表面所有软组织，根据前囟位置确定引导套管的植入位点。使用专为啮齿类动物手术设计的电池驱动钻孔器（Fine Science Tools, Inc.）在颅骨上钻出直径6 mm的孔洞。操作时需注意避免钻头穿透脑膜或损伤血管。将双侧5 mm长、21号规格的不锈钢引导套管植入颅骨，靶向后侧伏隔核、背侧纹状体或前额叶皮层。立体定位坐标参照Franklin和Paxinos（1997）《The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates》（Academic Press）或Paxinos和Watson（2006）《The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates》（Academic Press）确定。植入物用牙科水泥固定。手术结束时，皮下注射乳酸林格氏液或0.9%生理盐水（大鼠5 ml，小鼠1 ml，液体需预热至正常体温）以防止脱水。若动物表现出疼痛迹象，术后每日两次皮下注射布托啡诺（0.1–0.5 mg/kg），之后按需给药。如出现术后感染，则给予局部抗生素治疗（杆菌肽软膏）和全身性抗生素治疗（青霉素，100,000 IU/kg，肌内注射，术后前48小时内每12小时一次）。
手术后，动物被单独饲养，自由摄取食物和水。至少留出一周时间让动物恢复，然后进行微透析和安乐死。手术恢复后，将动物转移至微透析笼具中，并将微透析探针插入术中植入的导向套管并用牙科水泥固定。由于探针通过导向套管穿过皮肤、肌肉和脑膜组织，避免了直接损伤，因此探针插入过程不会引起疼痛或不适。因此，探针插入无需麻醉，从而避免了麻醉药物对神经化学或行为的干扰。探针置入后，我们让其稳定12小时，随后根据实验需要，每隔30分钟收集一次透析液样本，持续8至12小时。通过光电细胞或实验人员手动记录动物的运动情况，以监测其运动行为。微透析样本经高效液相色谱-电化学检测（HPLC-EC）仪器进行神经化学物质的检测与分析。我们主要观察对基础神经化学水平和运动行为的影响。实验结束后，通过腹腔注射过量的氯胺酮（200 mg/kg，i.p.）和赛拉嗪（20 mg/kg，i.p.）对动物实施安乐死。随后经心脏灌注0.9%生理盐水，接着灌注4%多聚甲醛。取出脑组织，冷冻后沿微透析探针轨迹切片，以确认探针位置的准确性。
实验步骤
- 设置立体定位仪及所需的所有材料。确保操作区域和仪器已清洁并灭菌。
- 使用电动剃刀剃除毛发，范围从双耳之间延伸至两眼正中。以不同方向移动剃刀，有效清除该区域的毛发。在剃净的区域涂抹聚维酮碘/碘液，但需保护眼睛免受接触。
- 将动物固定在立体定位仪上，将耳杆插入耳道并拧紧固定。先将一侧耳杆插入耳道，用手固定该侧，再滑入另一侧耳杆。当动物头部无法左右移动时，表明已正确就位。使用立体定位仪的前部固定装置固定动物口鼻部，并用直尺确认头部水平（将直尺垂直于立体定位仪平台放置，检查直尺与动物头皮中线之间是否呈90°角）。若立体定位仪具备相应功能，可通过其进一步确认。
- 使用无菌手术刀在头皮上做前后方向切口，从人字缝延伸至两眼之间。使用无菌止血钳夹住皮肤并保持切口开放。用数根无菌棉签擦干暴露的颅骨表面。
- 将引导套管安装至其固定架上，找到颅骨上的前囟点，并将引导套管准确定位于该位置上方。记录前后方向和左右方向的坐标。根据立体定位图谱，从前囟点出发确定探针植入所需的正确坐标，并通过相对于前囟点的加减调整引导套管位置。将引导套管缓慢下降至接触颅骨表面，记录此时的腹侧坐标。使用无菌铅笔在颅骨上标记该位置，此即后续钻孔的位置。
- 取下引导套管，对钻头进行灭菌。小心地在铅笔 标记处钻孔，直至穿透颅骨厚度。用引导套管检查钻孔是否通畅，确保其可无接触地通过孔道。持续钻孔并反复检查，直至套管能沿直线顺利通过。钻孔完成后，使用无菌针头轻柔刺破脑膜，以便引导套管无障碍插入。
- 接下来，使用手钻钻出六个用于颅骨螺钉的孔：两个位于套管孔前方，两个位于套管孔两侧，两个位于套管孔后方。将六枚螺钉灭菌后植入颅骨，直至牢固固定。
- 用乙醇和生理盐水清洁引导套管，将其安装并缓慢下降至预定的腹侧坐标。确保套管侧壁不与孔壁接触，且插入方向完全垂直。
- 将锚定螺钉置于后方颅骨螺钉内侧并用镊子固定。调配少量稀薄的牙科水泥，用无菌刮刀覆盖引导套管、螺钉及颅骨其余部分。再配制一批较稠的水泥，完全覆盖整个区域、引导套管及锚定螺钉，确保固定牢固。
- 在牙科水泥逐渐变稠但尚未固化前，用刮刀将皮肤与水泥杯分离，并修整水泥杯边缘，确保水泥帽表面光滑，避免日后刺激皮肤。
- 待牙科水泥完全干燥后，方可将动物从立体定位仪上取下。移除止血钳，并在水泥帽周围涂抹杆菌肽。
- 动物脱离立体定位仪后，立即肌内注射0.25 ml青霉素，随后皮下注射1 ml生理盐水。
- 将动物单独置于笼中，密切观察直至其恢复意识，之后送回饲养室继续恢复。
- 在手术当天监测动物从麻醉中恢复的情况，并在术后每日观察，直至实验结束，包括周末和节假日，注意有无感染迹象及疼痛/痛苦表现。低水平自主活动、触碰时发出痛苦叫声、弓背姿势、腹泻、头部固定装置区域肿胀或分泌物、进食饮水减少等均为疼痛和痛苦的表现。若动物出现疼痛，给予布托啡诺（0.1–0.5 mg/kg，皮下注射），每日两次，之后根据需要给药。若发生术后感染，给予局部抗生素治疗（杆菌肽软膏）和全身抗生素治疗（青霉素，100,000 IU/kg，肌内注射，术后前48小时内每12小时一次）。若在术后12小时内给予布托啡诺、补液及抗生素治疗后，上述症状仍持续存在，则实施安乐死。
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讨论
在活体动物特定脑区同时测定多种神经递质及其代谢物时，活体微透析是首选工具。然而，该方法仅能监测神经化学物质的细胞外水平，且无法提供实时监测神经递质胞吐作用所需的时间分辨率。通过一种称为“净通量”（net-flux）的技术变体，可计算出特定部位的实际神经递质浓度，进而准确测量神经递质通过质膜转运体的再摄取速率。
微透析技术非常适合用于阐明不同动物组（例如不同基因型）之间基础细胞外神经递质水平的差异，并解析药物或其他干预手段对神经递质释放的影响。
引入毛细管区带电泳（CZE）结合荧光检测等替代高效液相色谱-电化学检测（HPLC-EC）的分析方法，已将活体微透析的检测时间分辨率提高至每几分钟即可获得一个样本。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
由 DK065872（ENP）、史密斯家族基金会生物医学研究卓越奖（ENP）和 F31 DA023760 资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 材料在实验方案文档中描述。 |
参考文献
- Bungay, P. M., Newton-Vinson, P., Isele, W., Garris, P. A., Justice, J. B. Microdialysis of dopamine interpreted with quantitative model incorporating probe implantation trauma. J. Neurochem. 86, 932-946 (2003).
- Chen, K. C. Effects of tissue trauma on the characteristics of microdialysis zero-net-flux method sampling neurotransmitters. Journal of Theor. Biology. 238, 863-881 (2006).
- Geiger, B. M., Behr, G. G., Frank, L., Caldera-Siu, A. D., Beinfeld, M. C., Kokkotou, E. G., Pothos, E. N. Evidence for defective mesolimbic dopamine exocytosis in obesity-prone rats. FASEB Journal. 8, 2740-2746 (2008).
- Pothos, E. N., Creese, I., Hoebel, B. G. Restricted eating with weight loss selectively decreases extracellular dopamine in the nucleus accumbens and alters dopamine response to amphetamine, morphine and food intake. The Journal of Neuroscience. 15, 6640-6650 (1995).
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