本视频展示了双色整体原位杂交技术，该方法可用于在年轻的鸡胚中可视化两种不同基因的空间和时间表达模式。该方法最初由 David Wilkinson、Domingos Henrique、Phil Ingham 和 David Ish-Horowicz 提出。
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摘要
摘要
鸡胚是研究早期胚胎发育的宝贵工具。其透明性、易操作性和可及性使其成为研究脑、神经管、体节和心脏原基形成过程中基因表达的理想模型。本视频展示了双色整体原位杂交的各个步骤：首先，将鸡胚从蛋中解剖出来，并用多聚甲醛固定；其次，对鸡胚进行预杂交处理；然后，用两种不同的探针进行杂交，一种探针标记地高辛（DIG），另一种标记异硫氰酸荧光素（FITC）。经过 overnight 杂交后，将鸡胚与 DIG 标记的抗体孵育，进行 DIG 底物的显色反应，目标区域呈现蓝色；随后，将鸡胚与 FITC 标记的抗体孵育，并进行 FITC 的显色反应，目标区域呈现红色。最后，将鸡胚固定并进行拍照和切片处理。视频还提供了常见问题的解决方案指南。
关键词：鸡胚，早期胚胎发育，基因表达，原位杂交，双色标记，DIG，FITC，神经管，体节，心脏原基，多聚甲醛固定，显色反应，抗体孵育，切片
方案
第1部分：胚胎固定
- 用冰冷的DEPC-PBS填充解剖皿，置于冰上。用镊子轻敲蛋壳打开鸡蛋，并移除蛋壳碎片。
- 用镊子去除浓稠的蛋清。用粗镊子倾斜卵黄囊，使胚胎朝上。
- 使用剪刀在胚胎周围将卵黄囊剪成方形切口。
- 用勺子将胚胎从卵黄上取出，放入冰冷的DEPC-PBS中。
- 在显微镜下剥离膜和卵黄，然后转移至固定皿中。
- 用大头针固定胚胎，吸除DEPC-PBS，替换为含4% PFA的DEPC-PBS溶液，在4°C条件下过夜固定。
- 移除固定液，替换为冰冷的DEPC-PBS。使用钝端的微毛细玻璃针或显微解剖刀，在神经系统和心脏腔室上穿孔，以防止探针被困。
- 用含0.1% Tween-20的DEPC-PBS（PBT）洗涤2次，每次10分钟。在PBT配制的25%、50%、75%甲醇中各脱水10分钟。再用100%甲醇脱水两次。将胚胎保存于-20°C的甲醇中。
第二部分：预杂交
- 在PBT中分别用75%、50%和25%的甲醇对胚胎进行再水化，每步10分钟。在PBT中洗涤2次，每次10分钟。
- 同时，配制冰上预冷的固定液（含4%多聚甲醛的PBT）。将PBT替换为蛋白酶K溶液（每管3 ml；终浓度为5 µg/ml，溶于PBT中）。轻轻滚动离心管，确保整个管内样品均暴露于蛋白酶K溶液中；暴露时间参见故障排除部分。
- 使用无RNase的巴斯德吸管移除蛋白酶K溶液，并加入固定液（2 ml）。立即置于冰上固定，精确持续20分钟。
- 所有室温洗涤步骤均在振荡器上进行。在PBT中洗涤2次，每次10分钟，随后在含50%杂交缓冲液的PBT中洗涤1次，持续10分钟。
- 在杂交缓冲液中洗涤1次。于65°C下在2 ml杂交缓冲液中孵育4–5小时。
第3部分：将胚胎与探针杂交
- DIG 和 FITC 标记探针的合成方法见附录。预期产生强信号的探针应使用含 FITC 的核苷酸进行合成；较弱的探针则应使用含 DIG 的核苷酸进行合成。
- 将探针在杂交缓冲液（每种 500 ng/ml）中预热，使用 2 ml 小瓶。立即用探针溶液替换杂交缓冲液，注意防止胚胎干燥。在 65°C 下孵育 16 小时。
- 用杂交缓冲液替换探针溶液，65°C 下洗涤两次，每次 30 分钟。再在杂交缓冲液与 MABT 混合液（1:1 v/v）中 65°C 洗涤 15 分钟。
第4部分：DIG抗体孵育与显色反应
- 在 MABT 中清洗 2 次，每次 20 分钟。在 2% BBR/MABT 中清洗 1 小时。在 2% BBR/20%HISS/MABT（封闭缓冲液）中清洗 5 小时。将 DIG 抗体按 1:2000 比例稀释于封闭缓冲液中，于 4°C 在摇床上孵育过夜。
- 在 MABT 中清洗 3 次，每次 10 分钟，再在 MABT 中清洗 3 次，每次 1 小时。
- 在 NTMT 中清洗 2 次，每次 20 分钟。将 200 µl NBT/BCIP 底物加入 10 ml NTMT 中。立即从瓶中移除 NTMT，并替换为 1–2 ml NBT/BCIP 缓冲液。置于避光环境中。在 20 分钟后开始观察显色反应，之后每 20 分钟观察一次。
- 显色反应完成后（应呈现蓝色），在 PBS 中清洗 10 分钟，将样品固定于盛有 PBS 的固定皿中，并更换为含 4% PFA 的 PBS 溶液。于 4°C 固定过夜。
- 转移至新的闪烁瓶中。在 PBST（含 1% Tween-20 的 PBS）中清洗 2 次，每次 10 分钟。在 MABT 中清洗 2 次，每次 10 分钟。
- 在 MABT 中于 63°C 孵育 30 分钟。
第5部分：FITC抗体孵育与显色反应
- 在 MABT 中清洗 2 次，每次 10 分钟，然后在 2%BBR/MABT 中清洗 1 小时，再在封闭缓冲液中清洗 5 小时
- 在 4°C 下，用碱性磷酸酶偶联的抗 FITC 抗体（1:500）孵育过夜
- 在 MABT 中清洗 3 次，每次 10 分钟，然后再在 MABT 中清洗 3 次，每次 1 小时
- 在含 0.1% Tween-20 的 TBS（pH 8.45）中清洗 2 次，每次 20 分钟
- 使用试剂盒中提供的试剂 1、2 和 3，在 TBST 中配制 5 ml Vector Red 工作液。立即从管中移除 TBST，并替换为 Vector Red 缓冲液。置于避光环境中。在 40 分钟后开始观察显色反应，之后每 30 分钟观察一次
- 显色反应完成后（应呈现红色），将胚胎转移至 PBS 中
第6部分：固定与处理
- 转移至含有 PBS 的固定皿中，在室温下用 4% 多聚甲醛固定 20 分钟，或在 4°C 过夜固定。
- 用 PBS 洗涤，每次 10 分钟，共洗涤 2 次。若需进行拍照处理，将样品转移至含 20% 甘油的 PBS 溶液中（此步骤可使胚胎变为半透明）。若需制作观察腔室，取两条 PVC 胶带叠加贴于载玻片上，用刀片在中央切割出一个方形，再用镊子将该方形移除。
- 若需进行石蜡切片处理，将样品重新转移至 PBS 中，洗涤 2 次，每次 10 分钟；随后用梯度甲醇溶液脱水（分别为 25%、50%、75% 和 100% 的 PBS 溶液，每次 10 分钟）。
- 用丙醇置换 3 分钟；再用 1,2,3,4-四氢化萘置换 20 分钟，接着用 Histoclear 处理 2 次，每次 1 小时；然后用 Histoclear/石蜡（1:1，v/v）在 60°C 下置换 1 小时；最后用纯石蜡置换并进行组织学常规处理。
第7部分：溶液
杂交缓冲液，在 Falcon 50 ml 管中配制，-20°C 保存：25 ml 甲酰胺；3.25 ml (20×SSC)；0.5 ml (0.5 M EDTA)；1 ml (10% Tween-20)；2.5 ml (1% SDS)；125 µl (20 mg/ml tRNA)；100 µl (50 mg/ml 肝素)。MABT 缓冲液，配制 100 mM 马来酸，用 NaOH 颗粒调节 pH 至 7.5，加入 150 mM NaCl 和 0.1% Tween-20。
NTMT（使用前配制，50 ml）：5 M NaCl 1 ml；2 M Tris-HCl（pH 9.5）2.5 ml；2 M MgCl2 1.25 ml；10% Tween-20 5 ml。
TBST：0.1 M Tris-HCl，0.15 M NaCl，pH 8.45，0.1% Tween-20。
第8部分：故障排除
| 问题 | 原因 | 补救措施 |
| 胚胎呈蜷曲状 | 脱水/再水化不足 | 在连续的脱水/再水化步骤中，保持10分钟的时间间隔 |
| 没有探针信号 | 探针因瓶中RNase污染而降解 | 在1%琼脂糖凝胶上电泳检测探针 确保在第2步中整个小管均接触蛋白酶K溶液 |
| 探针标记心脏和神经管的腔隙 | 探针被捕获 | 在步骤2中，确保使用显微解剖刀或微毛细管刺穿所有腔室 |
| 杂交后（步骤3）胚胎解体 | 蛋白酶K处理时间过长 杂交温度过高 | 蛋白酶K的处理时间不应超过1分钟（步骤3+ 以及4），2分钟（第5至7阶段），3分钟（第8至10阶段），4分钟（第11至13阶段）。不要在T下进行杂交o 高于 65 o C |
第9部分：代表性结果
以下显示的是代表性胚胎：（A）胚胎（HH7 期）用 DIG-Sox 探针（蓝色）和 FITC-delta-1 探针（红色）标记。（B）胚胎（HH8 期）用 DIG-Pax6 探针（蓝色）和 FITC-Shh 探针（红色）标记。Nf，神经褶；anp，前部神经板；psm，前体节中胚层；n，脊索；nt，神经管。探针由 C. Tabin 博士、M. Goulding 博士、D. Henrique 博士和 J. Briscoe 博士实验室惠赠。
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讨论
双色整体原位杂交法可用于确定一个或两个目的基因在空间和时间上的表达模式。该方法的应用包括评估新基因的表达模式（例如1,2），以及在受到损伤后基因表达的变化（如胚胎操作3、珠子植入4、RNA或DNA构建体的电穿孔5）。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由Margaret M. Alkek基金会资助RHF。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 鸡蛋 | 动物 | Charles River Laboratories | 优质受精卵 | |
| 体视显微镜 | 显微镜 | Leica Microsystems | MZ9.5 | |
| Marsh 自动孵育箱 | 工具 | Lyon | RX | |
| 杂交孵育箱 | 工具 | Hybaid | Micro-4 | |
| Adams Nutator 轨道混合器 | 工具 | Fisher Scientific | 14-062 | |
| 弯头镊子 (1) | 工具 | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| 精细剪刀 | 工具 | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| 勺子 | 工具 | Fine Science Tools | 10370-18 | |
| 巴斯德毛细移液管 | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | ||
| 微毛细管 | Sigma-Aldrich | P1049-1PAK | 使用垂直微移液管拉制仪拉制；用精细镊子钝化末端 | |
| 显微解剖刀 | Fine Science Tools | 10056-12 | 用于原位杂交前刺破腔体 | |
| 0.2 mm 直径的分钟针 | Fine Science Tools | 26002-20 | 使用磁力搅拌器将针固定在一起； | |
| Sylgard 184 硅弹性体固化剂与基础液 | 试剂 | Dow Corning | 0001986475 | 按1份固化剂与9份基础液混合；在37°C下过夜固化 |
| 焦碳酸二乙酯（DEPC） | 试剂 | Acros Organics | 10025025 | 将1 ml DEPC加入1 L PBS中；振荡混匀；高压灭菌 |
| 16% PFA | 试剂 | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Tween-20 | 试剂 | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| 蛋白酶K | Sigma-Aldrich | P2308-5MG | 以10 mg/ml浓度溶于DEPC-H₂O中，分装为10 µl等份；-20°C保存 | |
| 去离子甲酰胺 | 试剂 | Ambion | 9342 | |
| 酵母tRNA-25 mg | 试剂 | Invitrogen | 15401-011 | 以20 mg/ml浓度溶于DEPC-H₂O中，分装为125 µl等份；-20°C保存 |
| 肝素钠盐 | 试剂 | Sigma-Aldrich | H4784-250MG | 以50 mg/ml浓度溶于DEPC-H₂O中，分装为100 µl等份；-20°C保存 |
| SSC ×20 pH5.5 | 试剂 | Fisher Scientific | PR-V4261 | |
| EDTA (0.5 M) | PR-V4231 | Fisher Scientific | ||
| SDS | 试剂 | Fisher Scientific | BP166-100 | |
| 马来酸 | 试剂 | Fluka | 63189 | |
| B–hringer 封闭试剂 | 试剂 | Roche Group | 11096176001 | 在MABT中按2%使用。配制时，与MABT一起在60°C加热20分钟。可配成储备液，分装为1–5 ml等份，在20°C保存 |
| 热灭活绵羊血清 | 试剂 | Jackson ImmunoResearch | 013-000-121 | 溶于10 ml H₂O中；55°C加热30分钟。分装为1 ml等份，-20°C保存 |
| 抗地高辛-AP，Fab片段 | 试剂 | Roche Group | 11093274910 | |
| NBT/BCIP 储备液 | 试剂 | Roche Group | 11681451001 | |
| 抗荧光素-AP，Fab片段 | 试剂 | Roche Group | 11426338910 | |
| 2 M Tris | BP1759-500 | Fisher Scientific | ||
| Vector Red 碱性磷酸酶底物试剂盒 | 试剂 | Vector Laboratories | SK-5100 | |
| 1,2,3,4-四氢化萘 | 试剂 | Sigma-Aldrich | 429325-100ML | 在通风橱中操作 |
参考文献
- Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. 406, 74-78 (2000).
- Rodríguez Esteban, C., Capdevila, J., Economides, A. N., Pascual, J., Ortiz, A., Izpisúa Belmonte, J. C. The novel Cer-like protein Caronte mediates the establishment of embryonic left-right asymmetry. Nature. 401, 243-251 (1999).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
- Kawakami, M., Nakanishi, N. The role of an endogenous PKA inhibitor, PKIalpha, in organizing left-right axis formation. Development. 128, 2509-2515 (2001).
- Basch, M. L., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. I. Specification of the neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).
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