早期鸡胚双重整体原位杂交

摘要

本视频展示了双色整体原位杂交技术，该方法可用于在年轻的鸡胚中可视化两种不同基因的空间和时间表达模式。该方法最初由 David Wilkinson、Domingos Henrique、Phil Ingham 和 David Ish-Horowicz 提出。

摘要

鸡胚是研究早期胚胎发育的宝贵工具。其透明性、易操作性和可及性使其成为研究脑、神经管、体节和心脏原基形成过程中基因表达的理想模型。本视频展示了双色整体原位杂交的各个步骤：首先，将鸡胚从蛋中解剖出来，并用多聚甲醛固定；其次，对鸡胚进行预杂交处理；然后，用两种不同的探针进行杂交，一种探针标记地高辛（DIG），另一种标记异硫氰酸荧光素（FITC）。经过 overnight 杂交后，将鸡胚与 DIG 标记的抗体孵育，进行 DIG 底物的显色反应，目标区域呈现蓝色；随后，将鸡胚与 FITC 标记的抗体孵育，并进行 FITC 的显色反应，目标区域呈现红色。最后，将鸡胚固定并进行拍照和切片处理。视频还提供了常见问题的解决方案指南。 关键词：鸡胚，早期胚胎发育，基因表达，原位杂交，双色标记，DIG，FITC，神经管，体节，心脏原基，多聚甲醛固定，显色反应，抗体孵育，切片

方案

第1部分：胚胎固定

1. 用冰冷的DEPC-PBS填充解剖皿，置于冰上。用镊子轻敲蛋壳打开鸡蛋，并移除蛋壳碎片。
2. 用镊子去除浓稠的蛋清。用粗镊子倾斜卵黄囊，使胚胎朝上。
3. 使用剪刀在胚胎周围将卵黄囊剪成方形切口。
4. 用勺子将胚胎从卵黄上取出，放入冰冷的DEPC-PBS中。
5. 在显微镜下剥离膜和卵黄，然后转移至固定皿中。
6. 用大头针固定胚胎，吸除DEPC-PBS，替换为含4% PFA的DEPC-PBS溶液，在4°C条件下过夜固定。
7. 移除固定液，替换为冰冷的DEPC-PBS。使用钝端的微毛细玻璃针或显微解剖刀，在神经系统和心脏腔室上穿孔，以防止探针被困。
8. 用含0.1% Tween-20的DEPC-PBS（PBT）洗涤2次，每次10分钟。在PBT配制的25%、50%、75%甲醇中各脱水10分钟。再用100%甲醇脱水两次。将胚胎保存于-20°C的甲醇中。

第二部分：预杂交

1. 在PBT中分别用75%、50%和25%的甲醇对胚胎进行再水化，每步10分钟。在PBT中洗涤2次，每次10分钟。
2. 同时，配制冰上预冷的固定液（含4%多聚甲醛的PBT）。将PBT替换为蛋白酶K溶液（每管3 ml；终浓度为5 µg/ml，溶于PBT中）。轻轻滚动离心....

讨论

双色整体原位杂交法可用于确定一个或两个目的基因在空间和时间上的表达模式。该方法的应用包括评估新基因的表达模式（例如^1,2），以及在受到损伤后基因表达的变化（如胚胎操作³、珠子植入⁴、RNA或DNA构建体的电穿孔⁵）。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
鸡蛋	动物	Charles River Laboratories	优质受精卵
体视显微镜	显微镜	Leica Microsystems	MZ9.5
Marsh 自动孵育箱	工具	Lyon	RX
杂交孵育箱	工具	Hybaid	Micro-4
Adams Nutator 轨道混合器	工具	Fisher Scientific	14-062
弯头镊子 (1)	工具	Electron Microscopy Sciences	72991-4C
精细剪刀	工具	Fine Science Tools	14161-10
勺子	工具	Fine Science Tools	10370-18
巴斯德毛细移液管		Electron Microscopy Sciences	70950-12
微毛细管		Sigma-Aldrich	P1049-1PAK	使用垂直微移液管拉制仪拉制；用精细镊子钝化末端
显微解剖刀		Fine Science Tools	10056-12	用于原位杂交前刺破腔体
0.2 mm 直径的分钟针		Fine Science Tools	26002-20	使用磁力搅拌器将针固定在一起；
Sylgard 184 硅弹性体固化剂与基础液	试剂	Dow Corning	0001986475	按1份固化剂与9份基础液混合；在37°C下过夜固化
焦碳酸二乙酯（DEPC）	试剂	Acros Organics	10025025	将1 ml DEPC加入1 L PBS中；振荡混匀；高压灭菌
16% PFA	试剂	Electron Microscopy Sciences	15710
Tween-20	试剂	Sigma-Aldrich	P1379-100ML
蛋白酶K		Sigma-Aldrich	P2308-5MG	以10 mg/ml浓度溶于DEPC-H₂O中，分装为10 µl等份；-20°C保存
去离子甲酰胺	试剂	Ambion	9342
酵母tRNA-25 mg	试剂	Invitrogen	15401-011	以20 mg/ml浓度溶于DEPC-H₂O中，分装为125 µl等份；-20°C保存
肝素钠盐	试剂	Sigma-Aldrich	H4784-250MG	以50 mg/ml浓度溶于DEPC-H₂O中，分装为100 µl等份；-20°C保存
SSC ×20 pH5.5	试剂	Fisher Scientific	PR-V4261
EDTA (0.5 M)	PR-V4231	Fisher Scientific
SDS	试剂	Fisher Scientific	BP166-100
马来酸	试剂	Fluka	63189
B–hringer 封闭试剂	试剂	Roche Group	11096176001	在MABT中按2%使用。配制时，与MABT一起在60°C加热20分钟。可配成储备液，分装为1–5 ml等份，在20°C保存
热灭活绵羊血清	试剂	Jackson ImmunoResearch	013-000-121	溶于10 ml H₂O中；55°C加热30分钟。分装为1 ml等份，-20°C保存
抗地高辛-AP，Fab片段	试剂	Roche Group	11093274910
NBT/BCIP 储备液	试剂	Roche Group	11681451001
抗荧光素-AP，Fab片段	试剂	Roche Group	11426338910
2 M Tris	BP1759-500	Fisher Scientific
Vector Red 碱性磷酸酶底物试剂盒	试剂	Vector Laboratories	SK-5100
1,2,3,4-四氢化萘	试剂	Sigma-Aldrich	429325-100ML	在通风橱中操作