本文展示了一种在大鼠耳部诱导并记录迟发型超敏反应（DTH）进程的方法，随后展示了为进行双光子成像以观察效应/记忆性T细胞反应而制备大鼠耳部组织的实验步骤。
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本文内容
摘要
摘要
迟发型超敏反应（DTH）是一种免疫反应，其主要效应细胞为CCR7- 效应/记忆性T淋巴细胞。本文中，我们展示了一种在大鼠耳部诱导并记录DTH反应进程的方法，随后演示如何制备大鼠耳组织，以用于双光子成像观察CCR7- 效应/记忆T细胞的反应。
通过腹腔注射表达绿色荧光蛋白（GFP）标记的、Ova特异性的CCR7- 效应/记忆T细胞系（Beeton, C J. 可视化实验，第8期），在大鼠体内诱导过继性迟发型超敏反应（DTH）。细胞注射后使其在大鼠体内平衡48小时，随后进行攻击：一只耳朵注射生理盐水（对照耳），另一只耳朵注射Ova与Texas-Red标记的Ova（Ova-TR）按1:1比例混合的溶液，以便可视化观察组织驻留的抗原呈递细胞。
我们介绍一种组织制备方法，可用于在免疫反应过程中对深层真皮层内细胞的运动性进行成像，同时结合二次谐波生成技术对胶原纤维进行可视化观察。将耳部组织切成 5 x 5 mm 的方块（稍大一些更佳），用 Vetbond™ 将其固定在塑料盖玻片上，然后用硅脂将其固定在成像腔室中，并在 37°C 下以通入氧气的组织培养基进行灌流。
方案
诱导过继性迟发型超敏反应
请参见 JoVE 文章：大鼠过继性迟发型超敏反应的诱导与监测
Christine Beeton, George K. Chandy
加州大学欧文分校生理学与生物物理学系
《视觉化实验杂志》，第8期
在此，我们对该方案进行了改进，使用抗原（卵清蛋白）与德克萨斯红（Texas-Red）以1:1比例偶联，并与未标记抗原混合，以便可视化吞噬性抗原提呈细胞。
耳组织采集
- 根据已批准的动物实验方案，在预定时间点实施安乐死。此处我们采用过量麻醉剂异氟烷进行操作，过程在通风良好的通风橱内的密闭容器中完成。通过断头或打开胸腔并剪断心脏的方式，确认动物已死亡。
- 使用大剪刀进行单次剪切，尽可能贴近动物体部将耳部取下（图1）。
图1. 大鼠耳部的取下 - 将取下的耳组织置于含有约10 ml冰上预冷的1×PBS或RPMI-1640培养基的15 ml锥形管中。将组织样本置于冰上保存，直至准备进行成像处理。
- 应尽快对组织进行成像；然而我们发现，与立即取材并成像的组织相比，组织在冰上保存1至2小时对组织内细胞迁移活性无明显影响。
成像用组织制备
一、表皮层和真皮层的去除
*注意：必须保持深层真皮层的完整性。若操作正确，较大的血管将保持完整，且耳部软骨不会暴露。该技术难度较高，尤其是在无炎症（对照条件）的情况下，建议使用解剖显微镜辅助操作。
- 将锥形管中的组织和培养基一同放入10 cm的组织培养皿中。
- 戴手套后，用手轻轻捏住大鼠耳尖（远端），使耳的背侧朝上（图2）。
图2. 修剪耳部毛发 - 用拇指压住耳部上方以固定组织，同时使用闭合的Dumont #5镊子尖端将表皮与真皮深层分离。或者，如果耳缘存在皮肤/真皮深层的悬垂部分，可用镊子夹住该部分并轻轻拉扯，使其与下方组织分离（图3）。
图3. 去除上层表皮 - 当小片皮肤已与下方组织分离后，交替使用剪刀在真皮层之间剪切，并用镊子轻轻移除并剥离松动的皮肤，重复此分离步骤。
- 暴露一块5 × 5 mm或更大的耳部组织区域，该区域应距离初始抗原注射部位至少3 mm（图4）。
图4. 暴露用于成像的组织
二、将组织固定到成像载物台上
- 将塑料盖玻片裁剪至略大于已制备组织的尺寸。
- 在载玻片上均匀涂抹一层薄薄的3M Vetbond™组织安全胶。
- 捏住已制备组织的一角（选择不用于成像的区域），从培养液中取出，并将组织底面轻压在镜头纸或Kym擦拭纸上，以去除多余液体。
- 将组织边缘接触涂有胶水的载玻片（Vetbond在湿润组织上会立即固化）。轻轻拉平组织，使对侧末端最后接触载玻片（图5）
图5. 将组织固定于盖玻片上 - 通过翻转组织样本/载玻片，并将其浸入液体培养基中，使组织面朝下并与液面呈约45度角，从而固化Vetbond™。将组织倒置并以一定角度保持，有助于防止多余的胶水在组织暴露表面固化。组织表面的胶水会阻挡激光（图6）。
图6. 通过浸入培养基中固化Vetbond组织胶
注意：步骤2–5可能需要少量练习才能掌握。建议在首次正式操作前，先使用废弃或多余的组织样本进行练习。 - 在载玻片底部涂抹少量硅脂。
- 将载玻片放入灌流室中。在加入组织前，请确保灌流液正在流动，且温度维持在37°C并已充分氧合。轻轻按压载玻片边缘，使硅脂在灌流室底部与塑料盖玻片之间形成密封。
三、双光子成像
- 使用明场透射光，将焦点对准组织顶部。随后关闭所有光源。
- 根据多光子显微镜系统的要求，打开激光器和光电倍增管（PMTs）。
- 高度有序的纤维蛋白（如胶原蛋白和肌球蛋白）中的二次谐波产生（SHG）会在激发激光波长的一半处产生信号。我们使用900 nM的激发光，从而在450 nm处产生SHG信号，该信号可通过显微镜的“蓝色”通道进行观察。SHG的产生是一种非线性（双光子）过程，因此可提供类似于荧光双光子激发的光学“断层”效应。当纤维垂直于激光方向时，SHG信号效率达到峰值；而与激光方向平行的纤维则无法被观察到。1
- 寻找一个细胞丰富的良好成像区域，设置采集区域，使大多数细胞位于中心位置，然后开始成像。注意：在迟发型超敏反应（DTH）中，T细胞及其他浸润细胞常集中分布，而其他区域则缺乏浸润细胞2。因此，可能需要花费一定时间在组织中搜寻最佳成像区域。
- 在成像过程中通过评估细胞运动速度和极性来检查细胞活力。使用能够提供可接受图像质量的最低激光功率，以确保光损伤最小化。
- 根据需要更换新的组织样本。
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参考文献
- Koo, G. C., et al. Blockade of the voltage-gated potassium channel Kv1.3 inhibits immune responses in vivo. J Immunol. 158, 5120-5128 (1997).
- Gaga, M., Frew, A. J., Varney, V. A., Kay, A. B. Eosinophil activation and T lymphocyte infiltration in allergen-induced late phase skin reactions and classical delayed-type hypersensitivity. J Immunol. 147, 816-822 (1991).
- Flugel, A., Odoardi, F., Nosov, M., Kawakami, N. Autoaggressive effector T cells in the course of experimental autoimmune encephalomyelitis visualized in the light of two-photon microscopy. J Neuroimmunol. 191, 86-97 (2007).
- Kawakami, N., et al. Live imaging of effector cell trafficking and autoantigen recognition within the unfolding autoimmune encephalomyelitis lesion. J Exp Med. 201, 1805-1814 (2005).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Matheu, M. P. B., A, C. G. arcia, Chi, V., Rangaraju, S., Safrina, O., Monaghan, K., Uemura, M. I., Li, D., Pal, S., Monuki, E., Flugel, A., Pennington, M. W., Parker, I., Chandy, G. K., Calahan, M. D. In Situ Imaging of Effector/Memory T Cells During DTH and Suppression by Kv1.3 Channel Block. Immunity. , In Press (2008).
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