我们开发了视觉-运动反应方法，用于定量分析幼年斑马鱼对光强增加和减少的运动输出。我们还研究了斑马鱼的视觉突变体，包括在另一种视觉检测方法——视动反射检测中被认为完全失明的无视动反应（nrc）突变体。
本文内容
摘要
摘要
视动反射（OKR）是大多数脊椎动物表现出的一种基本视觉反射，在稳定眼球相对于视觉场景的位置方面起着重要作用。然而，OKR要求动物能够检测移动的条纹，因此未能表现出OKR的鱼类可能并非完全失明。一种斑马鱼突变体——无视动反应c型（nrc）——在所有测试的光照条件下均无OKR，曾被报道为完全失明。此前，我们已证明在这些突变体中仍可记录到OFF型神经节细胞的活动。为了确定像nrc突变体这样缺乏OKR的突变鱼是否仍能感知简单的光强增加和减少，我们开发了视觉运动行为检测法（VMR）。在此检测中，将单个斑马鱼幼体置于96孔板的各个孔中，利用自动视频追踪系统同时监测多个幼体。记录并量化每个幼体在30分钟光照开启和30分钟光照关闭期间的运动反应。野生型（WT）鱼在光照开启时会出现短暂的运动活动激增，称为惊吓反应，随后活动水平降至基线以下，称为“冻结”状态。野生型鱼在光照关闭后也会立即显著增加运动活动，并在数分钟内逐渐恢复至基线活动水平。nrc突变体对光照关闭的反应与野生型鱼相似，但其平均活动水平略低于野生型鱼。nrc突变体对光照开启的运动反应则延迟且迟缓，其反应上升时间比野生型鱼对光照开启的反应更慢。结果表明，nrc鱼并非完全失明。由于硬骨鱼类可通过非视网膜组织感知光线，我们通过使用chokh（chk）突变体验证了对光强变化的即时行为反应需要完整的眼睛，chk突变体从发育最早阶段起就完全缺乏眼睛。在我们的VMR检测中，chk突变体对光照开启或关闭均无惊吓反应，表明侧眼介导了这一行为。本文所述的VMR检测方法是对已建立的OKR检测的补充，后者无法检测斑马鱼幼体对光强变化的响应能力。此外，VMR检测的自动化特性使其适用于高通量筛选由光强驱动的视觉反应缺陷。
方案
本方案概述了在您自己的实验室中进行斑马鱼幼鱼对光强增加和减少的视觉-运动反应实验的步骤。斑马鱼是行为学研究的理想模型系统。它们易于饲养，产卵量大，且发育迅速。例如，斑马鱼幼鱼在发育第3天时眼睛已能对光产生反应，并在此时表现出惊吓反应。
第1部分：将单条斑马鱼接种至96孔板
- 将野生型幼鱼在28°C的黑暗/光照循环条件下培养至受精后至少4天（dpf）。我们通常的光照：黑暗循环为上午9:00开始14小时光照，晚上11:00开始10小时黑暗。为获得最佳行为学实验结果，应避免过度拥挤；我们通常在单个培养皿中饲养不超过50条幼鱼。
- 受精后4天（4 dpf）后，斑马鱼即可转移至96孔板中。为给幼鱼提供更多游泳空间，我们通常使用每孔容积为650 µl的大孔型96孔板；但标准规格的96孔板同样适用。使用塑料移液管，轻柔地将每孔转移一条幼鱼。
- 将鱼转移至各孔后，加入足够的养鱼用水，使液面接近孔板上缘，几乎与孔顶齐平。孔内液体过多或过少均可能导致记录摄像机出现光学问题。同时，注意避免向孔内引入气泡。
第二部分：记录设备的概述
对于本部分实验步骤，请参考视频以识别各组件，并熟悉我们记录装置的设置。
- 记录室内设有明确的位置用于放置96孔板。
- 摄像头位于后方，通过箱体内的反射镜对准培养板进行聚焦。通过调节固定反射镜的螺丝，可调整这些反射镜的角度。
- 记录室底部由红外LED照明，使摄像头即使在黑暗环境中也能观察到鱼类。幼鱼无法感知红外光，因此持续的红外照明不会影响实验结果。底部还配有白色LED光源，其控制独立于红外光源。虽然也可从上方或侧面用白光照明记录室，但必须注意避免水面产生强烈反光，以免干扰摄像头成像。
- 对于持续数小时以上的实验，应向室内通入缓慢流动的水，以在整个实验期间维持恒定温度。实现稳定水流的一种方法是使用小型水族泵，将储水槽中的水通过普通水下加热器加热至28°C后泵入室内。
- 为尽量减少来自房间的杂散振动，整个记录装置应放置在厚重的防震台面上。
第3部分：将96孔板与视频追踪系统的计算机网格对齐
- 将含有斑马鱼的96孔板放入记录室中。
- 若使用水浴，应缓慢地将孔板放入水中，使水位得以平稳调整，避免水溢出至孔板上。或者，可先关闭水流，放入孔板后再恢复水流。同时，务必使用弹簧或橡皮筋将96孔板固定到位。
- 在 Viewpoint Videotrack 软件中，检查实验中所有幼鱼是否均能在计算机屏幕上清晰可见。使用软件的控制功能，将视频追踪软件的网格与孔板的孔位对齐，确保每条鱼位于网格的一个方格内。追踪计算机会对每个方格独立计算运动数据，因此若网格未正确对齐，部分鱼的运动可能无法被记录；更严重的情况是，两条相邻的鱼可能被识别为同一区域内的单个个体，从而被计为一条鱼。此步骤对所有记录均极为关键。
- 对齐完成后，设置灯光开启与关闭的时间程序。我们通常在记录箱内设置3小时的光照或黑暗适应期，以获取基础活动水平，同时也让幼鱼在移液和操作后有机会恢复平静。在基础期结束后，我们通常交替设置30分钟灯光开启，随后30分钟灯光关闭，并重复多次。
- 接下来，关闭记录室的门，开始记录。
- 实际操作中，我们以每秒为单位记录每条鱼的活动，但 Viewpoint 软件实际上记录的是逐帧数据（可参考视频演示数据采集过程）。设定每帧最小像素变化的阈值时，需根据所使用的特定相机和光照装置进行调整。在我们的实验设置中，通常采用4像素的阈值：即若每帧中变化的像素少于4个，则视为背景噪声；若超过4个像素发生变化，则判定为鱼体运动。我们通过实验验证，该阈值可检测到几乎所有幼鱼的游动和转向动作。
- 尽管记录箱已较好地隔离了外界干扰，仍需关闭房间内的灯光，并注意尽量减少机械噪声的干扰，例如避免频繁开关房门、举办舞会或进行锻炼活动。
第4部分：分析数据
- 实验完成后，将收集的数据导入 Excel 表格或您常用的数据分析软件中。
- 附带的 Excel 表格展示了数据可能呈现的形式：其中包含从实验开始起以秒为单位的时间，以及在整个实验过程中每条幼鱼每秒的活动量（参见本页面“文件”部分的补充文件 示例数据）。
- 图 1 展示了单条幼鱼活动情况的示例。图 2 为 40 条野生型斑马鱼幼鱼平均活动的代表性轨迹，其平均的开灯（ON）和关灯（OFF）响应显著且一致。
图 1：单条鱼的活动情况。 一条野生型斑马鱼在受精后第 5 天（5 dpf）对交替的 30 分钟光照（ON）和黑暗（OFF）周期的活动响应。开灯响应由黑色箭头指示，关灯响应由红色箭头指示。
图 2：40 条鱼的平均活动情况。 40 条野生型斑马鱼在受精后第 5 天（5 dpf）对交替的 30 分钟光照（ON）和黑暗（OFF）周期的平均活动响应。平均的开灯响应（黑色箭头）和关灯响应（红色箭头）显著且一致。
5. 代表性结果
图3是我们所有实验所用实验设计的示意图。
图3. 视觉运动反应（VMR）测试的实验设计。 A) 将单条鱼放入记录室中的96孔板内，每秒测量每条鱼的活动量。B) 让鱼经历一段黑暗或光照适应期，以使其稳定并获得基础活动水平；随后连续施加30分钟光照开启和30分钟光照关闭的刺激，共持续3小时。该示意图改编自Prober等，2006年。
视觉-运动反应图呈现什么形态？
我们测量了野生型（WT）斑马鱼对光照增强和减弱的ON和OFF反应。为确认这些反应依赖于眼部功能，我们同时测量了不发育眼睛的chk突变体的活动性。图4展示了来自野生型动物以及chk突变体的平均活动性数据。
图4：野生型鱼具有由侧眼介导的明显ON和OFF反应。 记录5日龄斑马鱼幼鱼在30分钟光照开启和30分钟光照关闭期间每秒的运动行为。每条曲线代表在3次实验中记录的120只野生型（蓝色曲线）或chk突变体幼鱼（橙色曲线）共480次反应的平均值。chk突变体对光照增强或减弱均未表现出显著的活动性增加，且基础活动水平较低。本图改编自Emran等，2007年。
来自 nrc 突变体鱼的视觉-运动反应。
根据OKR实验结果，nrc 突变体被认为完全失明。nrc 突变体中，光感受器终末无法正常形成，且视觉的On通路严重受损1。对这些突变体鱼的视网膜神经节细胞记录显示，它们主要表现出OFF型神经节细胞反应，部分为异常的ON-OFF反应，但无纯粹的On型反应2。
通过 VMR 实验，我们发现 nrc 突变体具有正常的光 OFF 反应，而光 ON 反应则表现出延迟且迟缓（见图 5）。因此，nrc 突变体并非如先前所认为的完全失明2。
图 5：nrc 突变体对光强变化产生活动性增加的反应。 野生型（WT）和 nrc 突变体幼鱼在 5 dpf 时对光开启和关闭的行为反应。每条曲线代表来自每种基因型的 120 条个体鱼的 480 次反应的平均值。nrc 突变体的平均运动行为（粉红色曲线）相较于野生型鱼（蓝色曲线）略有降低，但在光关闭刺激后仍保持较强的活动性。请注意，nrc 突变体对光开启的反应上升时间较野生型鱼明显缓慢。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
我们在视频中展示的实验操作均以野生型鱼为代表。然而，这些实验同样可类似地在突变型鱼上进行（参见代表性结果部分）。我们建议将野生型鱼和突变型鱼以棋盘式布局接种在同一块培养板上，以达到最佳的对照效果。
当在同一块板上使用突变型鱼和野生型鱼时，请务必记录每个孔中所接种鱼的类型。以下是一种记录各孔中接种鱼类型的方法建议（展示带有数据表的实验记录本）。
此外，最好在每天的同一时间重复特定实验。例如，如果您在中午12点开始进行3小时的暗适应以获得基线活性，则应在后续数据集的相同时间重复该实验。
此外，应在白天进行实验，因为鱼类在白天比在夜间更活跃，且对光强度变化的反应更明显。
我们使用了Viewpoint Lifesciences公司Videotrack软件的量化模式。然而，还有其他 commercially available 的追踪系统，包括Noldus公司的EthoVision。或者，像其他实验室所做的那样，您可以...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院基金 EY0081 和 5T32UY07145 以及骑士圣殿眼科基金会资助。Jason Rihel 是生命科学研究基金会的百时美-施贵宝研究员。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 微量滴定板装置 | 工具 | Whatman, GE Healthcare | 7701-1651 | |
| 移液管 | 工具 | VWR international | 202205 | |
| 斑马鱼养殖用水 | 试剂 | 参见参考文献 #4 | ||
| 记录室（Zebrabox） | 工具 | Viewpoint Lifesciences | ||
| Videotrack 软件 | 工具 | Viewpoint Lifesciences |
参考文献
- Allwardt, A. B., Lall, B. A., Brockerhoff, S. E. Synapse formation is arrested in retinal photoreceptors of the zebrafish nrc mutant. J Neurosci. 21, 2330-2330 (2001).
- Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R. OFF ganglion cells cannot drive the optokinetic reflex in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 19126-19126 (2007).
- Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A. Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish. J Neurosci. 26, 13400-13400 (2006).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish. , University of Oregon Press. Eugene, OR. (2000).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表
申请许可