用于免疫突触与运动突触研究的支撑性平面双层膜的构建

摘要

支撑性平面双层膜是用于模拟免疫突触中分子相互作用的有力工具。本文中，我们展示了将已知可调控突触形成的细胞黏附蛋白锚定于脂质双层膜上层，并利用全内反射荧光显微镜（TIRF）观察突触形成的方法。

摘要

支撑性平面双层膜是用于模拟免疫突触中分子相互作用的有力工具。为模拟淋巴细胞与抗原呈递细胞之间的相互作用，我们利用Ni²⁺-螯合脂质将带有聚组氨酸标签的重组细胞黏附分子和MHC蛋白锚定在双层膜的上层叶。平面双层膜的制备包括脂质准备、处理用于形成双层膜的玻璃表面，并在含有流动池的特制腔室中形成双层膜，随后将淋巴细胞加入流动池。接着，向双层膜中加入Ni²⁺，再引入带有his标签的重组蛋白。最后，将淋巴细胞注入流动池，利用全内反射荧光显微镜（TIRF）观察免疫突触的形成过程，以及调控T细胞运动、受体分选位点和受体降解位点的机制。 关键词：支撑性平面双层膜，免疫突触，Ni²⁺-螯合脂质，聚组氨酸标签，重组蛋白，全内反射荧光显微镜（TIRF），T细胞运动，受体分选，受体降解

方案

1. 准备脂质

1. 为了将蛋白质连接到双层膜的上层，我们使用 Ni²⁺ 螯合脂质，以锚定带有聚组氨酸标签的重组蛋白。某些细胞类型可能会非特异性地黏附于 Ni²⁺ 包被的双层膜，但 T 细胞通常不会，因此该 方法是研究 T 细胞活化的理想选择。
2. 通过在玻璃试管中将 20% 的 Ni²⁺ 螯合脂质和 80% 的磷脂酰胆碱溶于 1–2 ml 氯仿-甲醇中，配制脂质双层溶液。
   1. 在温水浴（30–37°C）中，用氮气流吹干溶剂，通常需要约 15 分钟。
   2. 使用冻干机在高真空条件下除去残留溶剂，持续 90 分钟。
3. 将脂质溶解于含 2% N-辛基-葡萄糖苷去污剂的 Tris-生理盐水缓冲液中，从而 形成混合去污剂/磷脂胶束溶液。最终磷脂浓度应为 0.4 mM。为形成脂质体，需将此溶液在 Tris-生理盐水中透析三次以去除去污剂并形成脂质体。我们通常使用约 1 ml 体积，配合截留分子量约为 10 kDa 的 Spectra/Por #2 透析管（直径 6 mm）。夹紧透析管时需注意排除任何气泡s。通常对该溶液进行无菌过滤，并在洁净条件下进行透析，操作时佩戴经 70% 乙醇灭菌的手套。
4. 该溶液应呈透明澄清状，并在氩气环境中储存以防止氧化。若溶液浑浊，则表明已 形成多层囊泡，需重新制备。

2. 确定有多少 ICAM-1 和 MHC 被沉积在平面双层膜上

1. 为了建立实验体系，首先需要确定在给定浓度的可溶性蛋白条件下，有多少 ICAM-1 和 MHC 分子会沉积在特定表面积的 Ni²⁺ 螯合双层膜上。为此，将双层膜沉积于直径为 5 微米的玻璃小球上，在接近成像所用流动池条件的环境下，将玻璃小球与蛋白溶液共同孵育，然后通过流式免疫荧光测定法检测结合蛋白的密度。
2. 使用每分子标记已知数量荧光素的 FITC 标记抗体来检测表面结合的蛋白。采用荧光素标准微球对流式微荧光仪进行校准。
3. 我们将建立接近抗原呈递细胞条件的实验体系，其中 ICAM-1 的密度为 200 个分子/μm²，I-Ek-MCC91-103 复合物的密度为 0.2–20 个分子/μm²。
   

3. 清洁用于形成平面双层膜的玻璃盖玻片

1. 当脂质体融合到玻璃表面时，会自发形成平面双层膜，但前提是玻璃必须经过适当清洁。
2. 使用Piranha溶液时，我们需穿戴全套防护服，包括耐酸围裙和厚重的耐酸手套。务必小心地将 废液与有机废物分开，并妥善处理。
3. 配制酸性Piranha溶液时，将75 ml浓硫酸加入一个干燥的烧杯中，再小心加入25 ml 30%过氧化氢。该溶液会迅速升温至超过100°C。
4. 将干燥的盖玻片浸入溶液中15分钟。取出后，用纯化水每面冲洗约一分钟。使用真空源吸干盖玻片上的纯化水。待Piranha溶液冷却后，倒入专用的Piranha废液容器中，容器应留有松动的瓶盖，并在通风橱内明显标记。当所有脂质体、盖玻片和蛋白质准备就绪后，即可构建免疫突触。
   

4. 形成双层膜

1. 为了形成双层膜，本实验室使用Bioptechs FCSII腔室，其优点在于集成了加热功能。FCSII系统安装在不锈钢基座上，通过夹具将微流控歧管、顶部0.5 mm垫片、一侧涂有氧化铟锡用于加热的微通道载玻片（另一侧带有流体沟槽）、定义流动腔高度的无尘0.25 mm垫片，以及用于形成双层膜的经Piranha溶液清洗的40 mm圆形盖玻片固定在一起。
2. 双层膜形成的盖玻片表面必须高度亲水且洁净，而微通道载玻片则在更疏水的条件下效果更佳。通过在室温下用1% HSA处理60分钟，随后用纯水清洗并彻底干燥（此条件化处理过程以及每次使用之间均需执行），可使微通道载玻片变得更疏水。该过程留下的变性蛋白涂层可使1 μl脂质体悬浮液形成一个圆形、半球状液滴，其高度>0.25 mm。
3. 为组装流动池并形成平面双层膜，先将带有管道朝上的歧管放置于平坦表面上。然后将0.5 mm厚带孔垫片对准流体管放置，并确保其平整贴合。轻轻将微通道载玻片面朝上置于垫片上，注意在确认载玻片上的孔与微流控管道对齐之前，不要施加任何向下的压力。接着将无尘0.25 mm矩形开孔垫片放置在微通道载玻片上方，使通道与流体通道对齐，且无明显气隙。
4. 在微通道载玻片表面以中心间距2.5 mm的模式放置最多5个1 μl脂质体悬浮液滴。这5个脂质体液滴可具有不同组分，但在本实验中仅形成两个双层膜：一个不含Ni²⁺螯合脂质，另一个含10% Ni²⁺螯合脂质。
5. 液滴放置完毕后，应一次性小心地将盖玻片整体压下覆盖于表面，并尽快将其夹紧固定。脂质体液滴应与盖玻片接触，且该接触一旦建立即不可中断，因为双层膜很可能已经形成；任何扰动均可能导致双层膜缺陷。
6. 务必记住在微通道载玻片上用少量墨点标记双层膜的位置，以便在显微镜下准确定位盖玻片。静置20分钟以确保系统达到平衡。使用连接约20 cm柔性管和三通阀的20 ml注射器转移所有溶液。将三通阀的另一端通过短段管路连接至流动池，以尽量减少三通阀与流动池之间的死体积。向注射器中注入含2 mM MgCl₂、1 mM CaCl₂、5 mM葡萄糖和1%人血清白蛋白的HEPES缓冲盐水。
7. 预先排空管路和三通阀中的空气，确保无气泡残留。将装置连接至流动池，并一次性推动5 ml溶液，同时观察确保无气泡经过双层膜区域。此时，双层膜即已制备完成。

本视频文章支持《从猎手到采集者再回归：免疫突触与免疫滑突作为变形虫运动主题的变体》一文，作者为 Michael L. Dustin, 细胞与发育生物学年度评论第24卷，2008年