一种在小鼠中通过大池进行脑脊液连续采集的技术

摘要

阿尔茨海默病（AD）的转基因（Tg）小鼠模型为研究疾病进展过程中人脑脊液（CSF）内Aβ或tau蛋白水平变化的机制和原因提供了极佳的机会。本文中，我们展示了一种改良的大脑池穿刺技术，用于对小鼠进行系列脑脊液取样。

摘要

阿尔茨海默病（AD）是一种进行性神经退行性疾病，其病理特征为细胞外沉积β-淀粉样肽（Aβ）和神经元内聚集过度磷酸化的tau蛋白。由于脑脊液（CSF）与大脑的细胞外空间直接接触，因此能够反映脑内生化变化对病理过程的响应。AD患者的脑脊液中，Aβ的42个氨基酸形式（Aβ42）水平降低，总tau蛋白和过度磷酸化tau蛋白水平升高，但导致这些变化的机制尚未完全阐明。AD转基因（Tg）小鼠模型为研究疾病进展过程中脑脊液中Aβ或tau水平变化的原因和机制提供了极佳的机会。本文展示了一种改良的大脑池穿刺技术，用于从小鼠中采集脑脊液。这种极为温和的采样技术允许在2-3个月的间隔内对同一只小鼠进行多次脑脊液取样，从而极大程度地减少了不同小鼠间Aβ或tau水平差异带来的干扰，使得检测随时间发生的细微变化成为可能。结合Aβ和tau的ELISA检测，该技术将有助于研究AD小鼠模型中脑脊液Aβ42和tau水平与其脑内代谢之间的关系。在转基因小鼠中开展的研究可为脑脊液Aβ或tau水平作为监测疾病进展的生物标志物的潜力提供重要验证，并可用于评估治疗干预的效果。由于小鼠可在实验后被处死，其脑组织可进行生化或组织学分析，因此能够更深入地评估脑脊液变化背后的机制。这些数据可能对解读人类AD患者脑脊液变化具有重要参考价值。

方案

拉制玻璃毛细管

1. 玻璃毛细管购自 Sutter Instrument Inc（硼硅酸盐玻璃，B100-75-10）。
2. 使用 Sutter P-87 Flaming 微量移液器拉制仪拉制毛细管，加热指数设为 300，压力指数设为 330。
3. 用剪刀修剪玻璃毛细管尖端，使锥形尖端的内径约为 0.5 mm。

脑池穿刺脑脊液采集技术

采用先前已发表的方法¹，从小脑延髓池（图1）采集脑脊液样本。



图1

1. 通过腹腔注射给予小鼠氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）进行麻醉。在麻醉诱导期间，将小鼠置于37^oC的培养箱中。

2. 剃除小鼠颈部皮肤的毛发，然后将其俯卧固定于立体定位仪上，并与加热垫直接接触。将直肠温度探针插入直肠，以便根据体温变化调节加热垫产生的热量。使用头部适配器固定头部。手术区域用10%聚维酮碘棉签擦拭消毒 碘，随后是 70% 乙醇（重复 3 次），并在枕骨下方做一矢状切口。

3. 在解剖显微镜下，用镊子进行钝性分离，将皮下组织和肌肉（m. biventer cervicis 和 m. rectus capitis dorsalis major）分开。使用一对微型牵开器将肌肉牵开。

4. 将小鼠平放，使其头部与身体形成接近135^o的角度。

5. 在解剖显微镜下，小脑延髓池的硬脑膜呈现为一个有光泽且透明的倒三角形结构，可通过其观察到延髓、一条主要血管（脊髓后动脉）以及脑脊液腔（图2）。



图2

6. 使用无菌棉签将硬脑膜擦干。将毛细管穿过硬脑膜，插入小脑延髓池，位置位于脊髓背动脉外侧（图2）。当感觉到毛细管插入阻力明显变化时，脑脊液便会流入毛细管中。

7. 小心移除毛细管，并通过内径为1 mm的聚乙烯管将其连接至3 ml注射器。将脑脊液注入预先标记的0.5 ml离心管中，立即在干冰上速冻，随后转移至-80°C冰箱中保存。

8. 脑脊液采集后，将肌肉复位，皮肤缝合（4-0，Ethicon，Johnson & Johnson）。皮下注射约1 ml的0.9% NaCl以防止脱水。将小鼠置于培养箱中以维持体温直至其恢复；术后1天和1周时监测小鼠体重。

结果与讨论

我们描述了一种高度可靠的从小鼠中连续采集脑脊液的方案，且无明显血浆污染。

1. 整个操作过程通常每只小鼠需要10分钟（包括麻醉时间）。所获得脑脊液的体积取决于小鼠品系。在我们使用的PS/APP双转基因小鼠²中，平均体积约为5 μl（3至7 μl），而P301L（JNPL3）小鼠³的产量约为10 μl至15 μl。对于连续取样，每次可安全采集的最大体积为7-8 μl，采集间隔为2-3个月。

2. 手术过程中，重要的是将小鼠的头部和身体在立体定位仪上正确放置，以便充分暴露小脑延髓池的硬脑膜。使用毛细管穿刺硬脑膜时应小心避开血管，以防止血浆蛋白污染，这种污染可通过针对ApoB⁴的免疫印迹法在脑脊液样本中检测到。

3. 每次手术过程中尽量减少组织损伤非常重要，因为组织粘连可能会增加后续取样时出血的风险，从而加大操作难度。

4. 手术期间需要良好维持体温，因为麻醉引起的低体温会迅速显著影响脑内磷酸化tau蛋白的水平⁵。

5. 我们所使用的 Ab ELISA 方案及抗体在 Refolo 等人的研究中已有详细描述⁶。将来自 PS/APP 小鼠的 2 μl 脑脊液按 1:50–1:60 稀释后，即可获得满意的结果。对于 tau ELISA，来自 P301L（JNPL3）小鼠的 4–5 μl 脑脊液足以用于总 tau 或在苏氨酸 231 位点 磷酸化的 tau 检测（试剂盒购自 Bio-Source）。

6. 该技术可应用于其他神经疾病的小鼠模型，对于这些模型，少量脑脊液即可满足所需检测的要求。

讨论

我们描述了一种高度可靠的从小鼠中连续采集脑脊液的方案，且无明显血浆污染。

整个操作过程通常每只小鼠需要10分钟（包括麻醉时间）。所获取脑脊液的体积取决于小鼠品系。在我们使用的PS/APP双转基因小鼠2中，平均体积约为5 μl（3至7 μl），而P301L（JNPL3）小鼠3每次可获得约10 μl至15 μl。对于连续取样，每次可安全采集的最大体积为7–8 μl，采样间隔应为2–3个月。

2. 手术过程中，重要的是将小鼠的头部和身体在立体定位仪上正确放置，以便充分暴露小脑延髓池的硬脑膜。使用毛细管穿刺硬脑膜时应小心避开血管，以防止血浆蛋白污染，这种污染可通过针对ApoB⁴的免疫印迹法在脑脊液样本中检测到。

3. 每次手术过程中尽量减少组织损伤非常重要，因为组织粘连可能增加后续取样时出血的风险，从而加大操作难度。

4. 手术期间需要良好维持体温，因为麻醉引起的低体温会迅速显著影响脑内磷...