大鼠颈上神经节（SCG）交感神经元培养方案

摘要

本方案描述了如何从新生大鼠的颈上神经节（SCG）中分离并培养原代交感神经元。

摘要

大鼠的颈上神经节（SCG）是微小、有光泽、呈杏仁状的结构，内含交感神经元。这些神经元为头颈部区域提供交感神经支配，且构成一个特征明确、相对均一的细胞群体（4）。交感神经元的存活、分化及轴突生长依赖于神经生长因子（NGF），而NGF的广泛可获得性使其培养和实验操作更为便利（2, 3, 6）。因此，培养的交感神经元已被广泛应用于多种研究，包括神经元发育与分化、程序性及病理性细胞死亡机制，以及信号转导等（1, 2, 5, 6）。从新生大鼠中分离SCG并培养交感神经元的操作并不复杂，可较快掌握。本文将详细描述如何从新生大鼠幼崽中分离SCG，并利用其建立交感神经元的培养体系。同时，本文还将介绍实现该过程所需的准备步骤以及各种试剂和设备。

方案

1. 解剖前的准备：

1. 根据实验性质选择合适的培养皿（10 cm 或 6 孔、24 孔板等），并在解剖前 24 小时用大鼠尾胶原进行包被。大鼠尾胶原的制备方法及其用于包被培养皿的操作已在其他文献中描述（1）。
2. 在磷酸盐缓冲液（PBS）中配制 0.25% 胰蛋白酶溶液（不含 EDTA），过滤除菌。分装成每份 1 ml，于 -20ºC 保存。
3. 在去离子/蒸馏水 H₂O 中配制含有 2.5 mM 尿苷（Uridine）和 5-FDU 的混合溶液。过滤除菌后分装为 50 µl 每份，于 -20ºC 保存。
4. 配制完全培养基：RPMI 1640 培养基，添加 10% 热灭活马血清（在 56ºC 水浴中孵育 30 分钟以热灭活）和 5% 胎牛血清。
5. 配制终末培养基：RPMI 1640 培养基，含 1% 热灭活马血清 + NGF（终浓度 100ηg/ml）+ 青霉素/链霉素（1/250）+ 1/250 的尿苷/5-FDU 溶液（终浓度 10 µM）。注意：该培养基每次使用前均需新鲜配制。以 24 孔板实验为例，需配制 12 ml 此培养基，建议额外多准备少量。NGF 可从多种商业来源购买（见本方案末尾的表格）。
6. 设备：需要体视显微镜及光源。推荐使用带聚焦头的双蛇形光纤照明器。此外，还需清洁并灭菌以下解剖工具（通过高压灭菌或在 70% 乙醇中浸泡至少 20 分钟）：两对不锈钢显微解剖镊子，以及一把解剖剪刀（均为 Roboz 公司产品，不锈钢材质）。还需准备两支无菌注射针头（26 号 × 1½ 英寸或类似规格）。必须设置一个解剖板，即一块 3”×3” 的泡沫板，外包铝箔并覆盖一张 Kimwipe 纸。用 70% 乙醇喷洒解剖板以去污染。最后，准备一支火焰抛光的玻璃巴斯德移液管。进行火焰抛光时，取玻璃移液管，将其尖端在火焰中旋转数秒。检查时可见尖端更光滑，开口更窄。此步骤对后续细胞解离操作至关重要。火焰抛光应在细胞培养超净台内进行，以保持移液管无菌状态。

2. 颈上神经节的解剖：

1. 收集出生后第0天（P0）或第1天（P1）的新生大鼠幼崽。
2. 用70%乙醇快速擦拭幼崽以进行解剖，减少污染风险。
3. 用一把锋利的剪刀迅速将幼崽断头（此步骤不会在视频中展示）。使用无菌镊子将头部固定在无菌纱布上，短暂引流多余血液。
4. 将头部置于解剖垫上，腹侧朝上，尾端朝向操作者。切断的气管应清晰可见。使用无菌注射器针头以以下方式将断开的头部固定在解剖垫上：将一根针从口腔顶部穿入垫中，另一根针从切断的气管穿入垫中。将垫置于解剖显微镜下，开始解剖。
5. 用两把镊子（每只手各持一把）清除气管周围的皮肤和脂肪，注意不要过深。这样做会暴露出位于气管两侧、几乎相互平行的一对肌肉。注意：在解剖过程中，需要用无菌巴斯德移液管滴加冷的无菌PBS或冷的无血清RPMI 1640培养基进行灌注，以冲洗掉多余血液并保持操作区域清洁湿润。根据操作速度，该步骤可进行一次或多次。对于有经验的操作者，分离一对神经节仅需约两到三分钟。
6. 用镊子先剪除并移除一侧的肌肉。
7. 一旦肌肉被移除，颈动脉将变得可见。它通常呈淡粉红色并含有血液。其颜色可能比周围其他血管更浅，因此可能不会立即被识别。该动脉沿气管走行，并分叉成“Y”形带状结构。此分叉是一个重要的解剖标志，一旦找到，就相对容易定位颈上神经节（SCG）。
8. 在颈动脉最尾端将其切断，并用镊子轻轻提起（另一端仍附着）。完成此操作后，你会看到一个杏仁状、有光泽的小组织团块，松散地附着在动脉分叉处，并带有细线样的节前和/或节后连接纤维。这就是颈上神经节。用另一只手中的第二把镊子轻轻将其分离，并放入含有冷的无血清RPMI 1640培养基的小培养皿（35 mm）中。
9. 接下来，按照相同的操作流程，提取气管另一侧的神经节。

3. 清洁神经节：

1. 所有神经节解剖取出后，应尽可能去除多余的组织。
2. 在解剖显微镜下，可见神经节附着有颈动脉、脂肪或其他组织碎片。使用双手持镊子小心分离并去除这些不需要的材料。将清理干净的神经节放入含有 RPMI 1640 培养基的无菌 15 ml 锥形聚丙烯管中。
3. 前节和/或后节神经连接组织也应一并剪除。每个神经节约含有 10,000 个神经元。神经元接种后将重新生长出神经突。

4. 建立交感神经元培养：

1. 以200×g离心神经节2分钟，弃去上清液。
2. 将神经节重悬于0.5至1 ml的0.25%胰蛋白酶溶液中，置于37˚C水浴或培养箱中孵育30分钟，以促进神经节内细胞的解离。
3. 30分钟后，加入10 ml完全培养基以稀释并中和胰蛋白酶，随后在200×g下离心2分钟。
4. 弃去上清液，用2 ml终末培养基重悬。
5. 使用火焰抛光的玻璃巴斯德移液管上下吹打神经节，进一步解离细胞。吹打神经节20次后，将试管置于冰上静置数分钟。
6. 同时，再次用火焰抛光移液管，使其开口更窄（直径约2/3至1/2 mm）。等待数分钟至冷却后，再将神经节吹打20次。随着操作进行，溶液将逐渐变得浑浊，表明细胞正在解离。根据细胞解离情况，重复此步骤一至两次。一段时间后，可观察到所有神经节均已解离为神经元，管中不再可见完整神经节。可能会有少量组织无法解离。此时，将离心管置于冰上数分钟，使未解离的碎片沉降至管底。随后小心吸取上层大部分液体，转移至另一管中。为避免吸取未解离的碎片，管底保留约50 µl液体。向含有解离细胞的管中加入适量终末培养基：具体体积取决于用于培养神经元的培养板类型。例如：若使用24孔板，则每孔接种0.5个神经节（约每孔10,000个神经元），每孔加入0.5 ml终末培养基。一窝典型的大鼠幼崽约有12只，可获得24个神经节，足够接种一个24孔板，终末培养基总体积为12 ml。注意：神经节中还含有少量胶质细胞及其他细胞类型，这些细胞将存在于培养物中。在终末培养基中加入尿苷/5-FDU可抑制其增殖并促进其死亡。
7. 每48小时更换一次培养基，用新鲜的RPMI + 1% 马血清 + NGF以及尿苷/5-FDU替换原培养基的2/3。注意：最初，培养物中的交感神经元呈圆形，无神经突起。解剖后24小时可见短的神经突起，随后随时间推移逐渐变得更加密集且分支增多。

讨论

我们使用 Sprague Dawley 大鼠进行培养。

清洁神经节时需仔细并花费足够时间，彻底清除所有碎屑、血管和脂肪组织。此步骤对于获得基本均一且不含无关细胞类型的培养物至关重要。加入尿苷/5-FDU 可基本消除污染培养物的残留非神经元（有丝分裂）细胞，或至少抑制其增殖。

此外，在解离步骤中，需保持耐心，充分分离神经元，以确保接种到培养板上时不会形成大的细胞团块。细胞团块过大将无法获得理想的实验结果。例如，大的细胞团块会阻碍神经元的转染或感染效率。免疫染色也可能受到影响，同时任何需要对神经元进行计数的实验也将难以准确实施。

每次换液时无需在培养基中添加青霉素/链霉素。细胞初次接种时添加一次青霉素/链霉素即可。每次更换培养基时，必须加入新鲜的尿苷/5-FDU。

我们采用交感神经元培养来研究撤除神经生长因子（NGF）后引发的细胞凋亡。例如，在Biswas等2007年（2）的研究中，交感神经元被转染了针对多种在促进细胞凋...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
镊子，不锈钢 #5	工具	Roboz Surgical Instruments Co.	RS4976
剪刀，DEAVER 直型尖钝头 - 43 mm 刀片 - 5.5	工具	Roboz Surgical Instruments Co.	RS6760
RPMI 1640 培养基，含 L-谷氨酰胺	试剂	Cellgro	10-040-CV
胎牛血清	试剂	SAFC Global	12103c
供体马血清	试剂	JRH Biosciences	12449	在 56°C 水浴中孵育 30 分钟以进行热灭活。
青霉素/链霉素	试剂	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
不含 EDTA 的胰蛋白酶	试剂	Difco Laboratories	MT 25-050-CI
尿苷	试剂	Sigma-Aldrich	U3003
5-氟-5’-脱氧尿苷	试剂	Sigma-Aldrich	F-8791
神经生长因子（NGF）	试剂	Harlan Laboratories	BT-5025
解剖显微镜及光源	显微镜
15 ml 聚丙烯管	工具	BD Biosciences	352096
细胞培养皿	工具	Corning