肢体缺血小鼠模型

在美国，外周动脉疾病主要影响约 1000 万人，包括吸烟者、糖尿病患者和 70 岁以上的人。该手术的总体目标是通过结扎股动脉的近端和远端段来诱导后肢缺血。该过程从麻醉剃须和将鼠标以仰卧位放在手术台上开始。

然后从膝盖向大腿内侧切开皮肤，露出下面的股动脉。接下来，然后小心地将股动脉与股静脉分开。在远端结扎部位和近端结扎部位打双结。

然后切除股动脉段。切口部位通过缝合线闭合，并允许动物从麻醉中恢复。为了确认后肢缺血的诱导，将麻醉的小鼠置于仰卧位。

然后用激光多普勒扫描两个后肢。然后保存图像并评估灌注。大家好，我是 John Cook。

我是斯坦福大学心血管医学系的医学教授。我们的实验室对血管生成和血管再生感兴趣。在本视频中，我的两位博士后研究员 Nan Wong 博士和 Hir Niyama 将向您介绍 Muren 后肢缺血制剂，这是外周动脉疾病的重要模型，我们实验室经常用于评估生长因子和细胞疗法对血管生成的影响。

我们在实验室使用这些程序来研究干细胞衍生的内皮细胞对血管修复的作用。那么让我们开始吧。该手术所需的手术工具包括细尖镊子、尖头镊子、弹簧剪刀、手术剪刀、持针器和牵开器。

我们使用回形针制作自己的卷收器，因为它比市售的要小。牵开器在手术前使用热珠消毒器对这些工具进行消毒，此手术还需要烧灼工具和无菌细尖棉签。工具准备好后，将鼠标以每分钟 1 升的流速放入含有 1% 至 3% 异氟的 100% 氧气中的麻醉诱导室中。

将鼠标留在感应室中，直到它对外部刺激没有反应。然后将动物从诱导室中取出。然后将仰卧位的动物放在手术台上，并将其连接到连续的异氟醚流中。

使用电动剃须刀去除后肢的毛发。涂抹脱毛霜以彻底去除毛发。给老鼠剃毛后，用一条胶带伸展并固定后肢。

固定后肢后，用 3 次交替的 Betadine 和酒精磨砂膏擦拭皮肤。使用细镊子和手术剪刀，使用磷酸盐缓冲盐水从膝盖向大腿内侧切开约一厘米长的皮肤。PBS 湿润而清晰的尖头棉签。

轻轻刷去大腿肌肉周围的皮下脂肪组织。接下来，将烧灼剂横向应用至大小，并解剖皮下脂肪组织，露出下面的股动脉。接下来，使用牵开器打开伤口并获得更好的下肢脉管系统视图。

使用细尖棉签中的细镊子，轻轻刺穿膜股骨鞘，露出神经血管束。然后使用一套干净的细镊子和棉签，在腹股沟附近近端位置解剖股动脉与股静脉和神经。解剖后，在股动脉近端下方通过一股 7 oh silk 缝合线。

使用双结闭塞股动脉近端。将扎带放在血管上，尽可能靠近伤口，以便为第二根扎带和将要横切的中间段留出长度。在靠近膝盖的远端位置将股动脉与股静脉分开。

在腘动脉近端的股动脉远端下方穿过一条 7 oh 缝合线。使用双结封闭血管。用第二组双结闭

第二组缝合线将用于在交易过程中夹住动脉。同样，为了抓握目的，用第二组双结闭塞近端 fal 动脉，就在第一组结的远端。用细尖棉签和一把弹簧剪刀横切远端和近端结之间的股动脉段。

小心不要刺穿股静脉壁。取下牵开器并使用五根 oh quil 缝合线闭合切口。切口闭合后，将动物放回恢复笼并监测直至清醒 动物恢复一小时后，继续进行激光多普勒血液灌注。

步骤以确认缺血诱导。要开始激光多普勒灌注步骤，请将鼠标放入麻醉诱导室中，该麻醉室以每分钟 1 升的流速在 100% 氧气中含有 1 至 3% 异氟。将鼠标留在感应室中，直到它对外部刺激没有反应。

然后将动物从诱导室中取出，并将其放在连接到 isof 氟连续流动的预作台上。然后使用电动剃须刀去除后肢的毛发，然后根据需要涂抹脱毛霜。去除毛发后，将动物放在 37 摄氏度的加热表面上，在异氟的连续流动下放置 5 分钟。

五分钟后，将动物仰卧放在不反光吸收的表面上，例如连接到连续的异氟流的绿色布。伸展后肢。接下来，打开激光多普勒成像仪和采集软件并初始化软件。

指定视野的大小和分辨率。最好保持动物之间的视野和像素密度一致。为了便于将来的分析，请打开一个新文件。

按 start 开始获取图像数据。出现提示时，指定动物与成像器的距离。激光将显示视野的边界，然后开始采集数据。

采集完成后，图像将开始显示一系列颜色，这些颜色表明血液流向腿部的程度。颜色可以设置为特定的 profusion 范围。为了在数据采集完成后更好地比较动物之间的数据，请保存文件，然后将动物放回恢复笼并持续监测动物直到醒来。

要分析数据，请使用分析软件中的阈值调整来减去任何背景噪声。阈值 0.2 通常是一个合理的值。选择两个感兴趣的区域或覆盖每个后肢区域的 ROI。

可以使用各种标志来标准化肢体和动物之间的 ROI，然后确定 ROI 的平均灌注和变异性。然后可以很容易地确定缺血肢体和对照肢体之间的灌注差和灌注比。可以重复此过程以跟踪后肢灌注的变化。

随着时间的推移，在所需的时间点，可以对动物实施安乐死以评估组织功能。与灌注图像数据相比，此处显示了股动脉解释后后肢的代表性图。缝合线标记了近端和远端结扎部位的位置。

当仔细进行手术时，出血量很小，手术可以在不到一小时内完成。以下是激光多普勒灌注图像分析的结果。左图显示了缺血性诱导前双肢的丰富。

而右边的图片显示了双肢的丰富。左 hin 肢体经历缺血性诱导后。图像中的颜色强度表示血流量。

与对照组相比，缺血性肢体显示的颜色非常少，这表明血流量急剧减少。利用这些数据，该软件可以量化缺血性和对照肢体的平均灌注，以确定灌注差异和灌注比率。因此，这些结果证实了后肢缺血的诱导。

我们刚刚向您展示了如何在小鼠模型中诱导单侧后肢缺血，并通过激光多普勒血液富集确认缺血的诱导。具有激光多普勒成像分析的后肢缺血模型是研究血管病变和评估治疗候选药物的出色系统。该程序之后可以进行细胞移植和非侵入性追踪，这在 Huang 等人的另一段 jve 视频中得到了证明。

在进行此程序时，请务必记住，用扭伤剪刀切除股动脉时要小心，不要刺穿股静脉壁。还要对实验中的所有动物使用类似的连接位点，以确保高度缺血模型的一致性。就是这样。

感谢您的观看，祝您的实验好运。