Name: 安培电极的制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 学习制备碳纤维安培电极以检测囊泡儿茶酚胺释放的方法。该方案涵盖纤维填充、玻璃毛细管拉伸、环氧树脂密封及高温固化等关键步骤，为神经化学研究提供可靠的单细胞神经递质检测工具。

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我们感谢芝加哥大学的 Aaron P. Fox 博士，本实验方案最初是在他的实验室设计的；同时感谢圣路易斯大学的 William Roden 对本方案的进一步完善。
感谢怀特霍尔基金会和美国国家科学基金会的支持。

第一部分：碳纤维制备
<ol>
<li>剪取一束碳纤维（我们使用直径为7μm的碳纤维），其长度约为毛细移液管长度的1.25倍。</li>
<li>通过将约100 mL丙酮在容器中煮沸，并将碳纤维加入热的沸腾丙酮中处理30分钟或更长时间，以去除纤维表面的上浆剂。</li>
<li>从温热的丙酮中取出纤维，转移至含有50–100 mL新鲜丙酮的洁净烧杯中。</li>
<li>将纤维束置于敞开的150 mm培养皿中，室温下静置过夜，使其自然干燥。</li>
</ol>
第2部分：火焰抛光玻璃毛细管
<ol>
<li>用火焰将每根毛细管（我们使用微血细胞比容毛细管，外径1.5 mm，内径1.3 mm，长7.5 cm）进行火焰抛光：用镊子夹住管子中部，将一端置于火焰中，同时在火焰中旋转约3次。</li>
<li>将管子倒置，将另一端放入火焰中，同样旋转3次。</li>
<li>将经过火焰抛光的毛细管放入玻璃培养皿中，并转移至烘箱中，待其准备好用于填充碳纤维时取出。</li>
</ol>
第3部分：将碳纤维穿入毛细管
<ol>
<li>参照 Machado 等（2008）和 Mundroff 与 Wightman（2002）的描述，使用连接至带滤膜真空泵的塑料管，将纤维吸入玻璃管中。</li>
<li>使用手术刀切割纤维，使管外留出 ¼ 英寸的纤维长度。</li>
</ol>
第4部分：在电极拉制仪中拉制移液管-光纤
<ol>
<li>将毛细管放入电极拉制仪中（我们使用的是日本Narishige型号PP-830），并拧紧旋钮以固定毛细管。</li>
<li>操作开关，执行两次拉制，设置为最佳拉制参数。</li>
<li>当移液管被拉成两半后，用剪刀从中心切断裸露的光纤部分，使两部分分离。</li>
<li>取下每个电极的一半，拉出突出的光纤以打破玻璃密封，再用剪刀修剪光纤，使管外仅保留约1/8英寸的光纤长度。</li>
<li>重复步骤1至4，直至拉制出约16根光纤电极。</li>
</ol>
第5部分：制备环氧树脂-玻璃封接
<ol>
<li>在通风橱中，将预装好的环氧树脂分装样品置于设定为 55°C 的加热板上加热 6 分钟。</li>
<li>在环氧树脂加热的同时，用胶带将约 16 根拉制好的电极缠绕成束。</li>
<li>Epon 树脂加热 6 分钟后，向热的 Epon 树脂中加入 0.7 克 MPDA（14%，w/v），通过轻轻旋转小瓶混合均匀。</li>
<li>将电极束浸入热的环氧树脂与固化剂混合溶液中。约 20 秒后，足够量的环氧树脂将通过毛细作用进入玻璃尖端。</li>
<li>拆开电极束，将电极放入带槽的纸板上，并将该托盘置于设定为 100°F 的烘箱中。</li>
<li>至少 48 小时后，在解剖显微镜下检查每根电极。丢弃未被环氧树脂填充、尖端压碎、含有多于一根纤维等不合格的电极。检查完每根电极后，将其放回纸板支架中并重新放入烘箱。电极通常在制备后约一个月内可正常使用。</li>
</ol>
第6部分：切割碳纤维
<ol>
<li>将碳纤维电极小心地放置在带有聚四氟乙烯胶带的玻璃载片上。</li>
<li>在解剖显微镜下观察电极尖端。</li>
<li>使用洁净的手术刀片垂直切割碳纤维，以获得平整且洁净的表面，便于将碳纤维紧贴细胞放置。</li>
</ol>

<ol><li>Mundorf, M. L., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amperometry+and+cyclic+voltammetry+with+carbon+fiber+microelectrodes+at+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protocols+in+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Amperometry and cyclic voltammetry with carbon fiber microelectrodes at single cells.</a> Curr Protocols in Neurosci. 6 (14), 1-6 (2002).</li>
<li>Machado, D. J., Montesinos, M. S., Borges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Good+practices+in+single-cell+amperometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molec.+Biol%22%5BJournal%5D)">Good practices in single-cell amperometry.</a> Methods in Molec. Biol. 440, 297-313 (2008).</li>
</ol>

本方案介绍了如何制备和切割安培电极。在进行安培法记录时，将碳纤维电极置于分泌细胞表面。胞吐活动表现为安培尖峰，反映出儿茶酚胺氧化后电子转移所产生的电化学电流。通过练习制备和切割安培电极，其噪声水平可显著优于许多 commercially available electrodes。

<table><tbody><tr><td>环氧树脂固化剂 1,3-苯二胺薄片</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P23954-100G04 716AJ</td><td>分装后应保存在干燥器中，避免光照。</td></tr><tr><td>碳纤维</td><td>材料</td><td>Goodfellow</td><td>C005725</td><td></td></tr><tr><td>微量血细胞比容毛细管</td><td>材料</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9836768</td><td></td></tr><tr><td>环氧树脂</td><td>试剂</td><td>Miller-Stephenson</td><td>Epon Resin 828</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>仪器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>电极拉制仪</td><td>仪器</td><td>Narishige International</td><td>PP-830</td><td>第一次拉制 = 24.8 摄氏度；第二次拉制 = 62.7 摄氏度</td></tr><tr><td>烘箱</td><td>仪器</td><td></td><td></td><td>设定为 100 华氏度</td></tr><tr><td>加热板</td><td>仪器</td><td></td><td></td><td>设定为 55 摄氏度</td></tr></tbody></table>

安培电极的制备

Fabrication of Amperometric Electrodes

碳纤维电极对于单细胞囊泡中儿茶酚胺释放的安培法检测至关重要。本文描述了制备低噪声（<0.5 pA）电极所需的技术，这些技术在先前研究者发表的方法（1,2）基础上进行了改进。电极的制备首先通过准备碳纤维，并在真空与滤膜辅助下，将每根纤维单独穿入毛细管中。随后，使用电极拉制仪将含纤维的毛细管拉制，形成两个各具尖端的半电极。接着，将电极浸入加热熔化的环氧树脂与固化剂混合物中，形成环氧-玻璃密封结构。最后，将电极置于烘箱中使环氧树脂固化。在整个过程中，对电极的小心操作至关重要，以确保其制备的一致性并避免损伤。本方案详细展示了用于单细胞记录的安培电极的制备与切割方法。

关键词：碳纤维电极，安培法，单细胞检测，儿茶酚胺释放，电极制备，低噪声电极，环氧-玻璃密封

本方案描述了如何制备碳纤维电极。随后可利用这些电极通过碳纤维安培法检测囊泡中儿茶酚胺的释放。

碳纤维电极对于单细胞囊泡中儿茶酚胺释放的安培法检测至关重要。本文中，我们……

本方案描述了如何制备碳纤维电极。首先，我们将把去除表面涂层的碳纤维填充到玻璃毛细管中。接着，将纤维-毛细管组件拉制成两个电极，并切断碳纤维。然后将电极浸入环氧树脂中。为了将纤维密封到电极内，我们将把纤维电极放置在热烘箱中的支架上进行固化。这些电极随后用于通过碳纤维和压力测定法检测单个细胞中囊泡的儿茶酚胺释放。成功的记录表现为记录轨迹上的噪声较低，并能清晰分辨出向上的尖峰。大家好，我是来自圣路易斯大学医学院药理学与生理科学系Amy Harkins博士实验室的Carrie Pike。我将向您演示一种用于制备低噪声碳纤维电极的操作流程，该电极可用于热天平法测量单个细胞中儿茶酚胺的释放。开始准备用于制备电极的碳纤维。首先，在通风橱中将一束碳纤维剪成约等于毛细移液管长度1.25倍的长度。通过将约100毫升丙酮在容器中煮沸，并将碳纤维加入热的沸腾丙酮中处理30分钟或更长时间，以去除纤维表面的上浆剂。煮沸后，将纤维从加热的丙酮中取出，转移至一个洁净的烧杯中，烧杯内含有50至100毫升新鲜丙酮。再次将纤维转移至铝箔上，并可将铝箔移出通风橱。将纤维束置于一个敞开的150毫米培养皿中，于空气中静置过夜，使其自然干燥。现在碳纤维已准备就绪，接下来准备玻璃毛细管并进行火焰抛光。使用微血细胞比容玻璃毛细管，其长度为 7.5 厘米，外径为 1.5 毫米，内径为 1.3 毫米。将毛细管从中间夹持，将其一端暴露于火焰中。将毛细管在火焰中旋转约三圈。将毛细管倒置，使另一端进入火焰中，再次旋转三圈。毛细管的两端现在均已进行火焰抛光。将火抛光管放入玻璃皿中，并转移至烘箱内，待其准备就绪后用于填充碳纤维。在开始将碳纤维穿入毛细管之前，务必佩戴防护面罩。然后使用连接有滤膜的真空塑料管，将纤维吸入玻璃管中。接下来，使用手术刀切割光纤。注意在玻璃管两端各留出四分之一英寸的光纤长度。此时，已穿入碳纤维的玻璃管即可用于牵拉，以制备移液管纤维电极。将毛细管插入电极极片中，并拧紧旋钮以固定毛细管。接着，将极片调节至最佳设置，操作开关以实现双极拉制。当移液管被拉成两半后，通过在中心处切断裸露的光纤部分，将两半分开。使用剪刀。取下每个电极的一半，拉住突出的光纤以打破玻璃密封。用剪刀修剪光纤，使管外仅保留八分之一英寸的光纤长度。重复这些步骤，直至获得约16根纤维电极。在进行电极密封以形成环氧玻璃封接之前，首先将一份预先配制的环氧树脂置于设定为55摄氏度的加热板上，在通风橱中加热六分钟。在环氧树脂加热的同时，将约16根已拉制的电极缠绕成一束。环氧树脂加热六分钟后，使用胶带，向热的环氧树脂中加入0.7克固化剂。通过旋转小瓶混合均匀。将电极束浸入热的环氧树脂与固化剂的混合液中。每次将束状电极浸入约五秒钟，重复两次，使足量的环氧树脂通过毛细作用进入玻璃尖端。解开电极束，将电极放入带有插槽的纸板支架上。将此托盘置于设定为100华氏度的烘箱中。至少 48 小时后，在解剖显微镜下检查每个电极。丢弃未充满环氧树脂的电极。制备尖端破碎的电极。若含有不止一根纤维或因其他原因无法使用，则需剔除。检查完每根电极后，将其放回纸板支架上，并放回烘箱中。电极在制备完成后通常可保存约一个月，但在用于细胞热测定前需对碳纤维进行切割处理。为了切割碳纤维，将碳纤维电极小心地放置在带有聚四氟乙烯胶带的玻璃载片上。在解剖显微镜下观察其尖端。接着，使用洁净的手术刀片垂直于碳纤维切割，以获得一个平整且洁净的表面，便于将碳纤维与细胞接触放置。记录前立即操作。使用填充注射器将毛细管回填入三摩尔氯化钾，并确保擦干与光纤相对的一端，以去除多余的盐。将电极放置在电极架的银/氯化银小球上，并将其与测温头支架进行电连接。拧紧电极架以保持电极稳定。将电极置于细胞附近，开始记录电阻（RO）指标事件。本方案描述了如何制备和切割三电极（tric）电极。在三电极记录过程中，将碳纤维电极紧贴分泌细胞表面。胞吐活动表现为三重峰，这表明儿茶酚胺氧化后电子转移所产生的电化学电流。通过练习制作和切割EmPro度量电极，其噪声水平可显著优于许多 commercially available 电极。我刚刚向您演示了在此过程中如何制备和参数化碳纤维电极。为了获得稳定且低噪声的电极，仔细关注实验方案的每个细节非常重要。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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