Name: 慢性的微型驱动器阵列在体内录音:四极大会 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 19 s
Description: 学习四极电极制备与微型驱动器阵列组装技术，用于大鼠慢性在体电生理记录。该方法通过镀金工艺降低阻抗，实现长期稳定的神经活动监测。

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我们感谢山本淳（Jun Yamamoto）设计并制作了视频中所示的自动电动四极丝扭转装置。此外，我们还要感谢威尔逊实验室（Wilson Lab）所有过去和现在的成员，感谢他们对实验室微型驱动器和四极丝技术发展的贡献。

1. 四极电极的制备
<ol>
<li>通过取一根长50 cm、聚酰亚胺绝缘、直径为12.5微米的镍铬合金丝开始制作一个四极 Recording Wire。将该导线对折，用手指沿导线对滑动使其贴合在一起，确保整段长度上两根导线接触良好。</li>
<li>再次将导线对折，使两端并拢。确保一端形成的环状部分无折痕。在无环的一端将四根导线剪断，使四个尖端对齐。</li>
<li>下一步需要一个改装过的鳄鱼夹、一个电动旋转装置以及位于旋转装置上方的水平杆。改装鳄鱼夹的方法是在其基部粘接一根塑料杆。在导线尖端暴露的位置，用改装后的鳄鱼夹将四根导线夹紧。将导线环悬挂在水平杆上，并将鳄鱼夹放入电动旋转装置中。</li>
<li>在大约三分钟内，先顺时针施加80圈扭绞，再逆时针施加40圈扭绞。这些参数可根据实际需要进行调整。</li>
<li>完成四极 Recording Wire 的扭绞后，使用热风枪（温度420°C或790°F，中低风速）从三个不同角度加热导线束，使其熔合。每个角度加热时，从导线束分叉点下方1-2 cm处开始，以距离导线约2 cm的位置上下移动热风枪，持续约5秒。注意高温会完全熔化绝缘层，导致短路。</li>
<li>导线熔合后，轻轻提起鳄鱼夹以释放四极 Recording Wire 上的张力，从扭绞装置上取下导线，并在靠近鳄鱼夹处将四极 Recording Wire 剪下。在另一端剪开环状部分，得到四根长度相等且未粘连的导线单股。</li>
<li>接下来，使用尖端柔软的镊子轻轻弯曲导线，将顶部的各单股导线分开。</li>
<li>此时四极 Recording Wire 已准备好装入微驱动阵列。再制作21至25根四极 Recording Wire，并将其存放在无尘盒中，直至进行四极 Recording Wire 装载步骤。</li>
</ol>
2. 将四极电极和接地线装入微型驱动阵列
<ol>
<li>开始之前，您需要一个完整的微型驱动阵列。如果您尚未制作，请参考视频《用于慢性体内记录的微型驱动阵列：驱动器制作》。在我们的设计中，四极电极的一端将连接至连接器硬件，并穿过微型驱动器中的聚酰亚胺导管，使电极尖端延伸至微型驱动阵列底部以下。</li>
<li>开始前，制作一个驱动器固定装置：一端可固定在连接板上，另一端可用Panavise夹具夹紧。在本示例中，驱动器固定装置为一个Mill-Max连接器，用胶粘在X-ACTO刀柄的一端（图1c）。</li>
<li>使用尖端柔软的镊子夹持四极电极，并在体视显微镜下操作，将电极尖端推入其中一个微型驱动器的聚酰亚胺导管中。持续推进四极电极，直至各单根电极导线接近驱动阵列顶部的连接板。注意避免导线弯折或扭曲，否则会导致四极电极以倾斜角度而非垂直方向进入脑组织，并削弱其结构完整性。</li>
<li>使用尖端柔软的镊子，将四根导线的另一端分别小心地送入电极接口板上对应的孔中。同样注意避免导线弯折或扭曲。当四根导线均就位后，使用下颚被截短的钳子将金针插入孔中。当金针插入孔内时，会剥离导线绝缘层并形成电连接。</li>
<li>为便于后续参考，请记录微型驱动器与电极接口板上各引脚位置之间的对应关系。</li>
<li>继续加载，共加载18根四极电极。阵列上剩余的三个微型驱动器将用于安装参考电极。每个参考电极由一根四极电极构成，但仅使用其中一根未连接的导线末端。安装参考电极时，遵循相同的加载流程，但仅将四根电极中的一根连接至连接板上对应的参考电极引脚。</li>
<li>如果您计划进行多部位记录，建议提前规划四极电极与连接板之间的连接方式，以最大限度减少实验过程中误调电极的可能性。</li>
<li>完成四极电极加载后，制作两根接地导线：一根用于动物，另一根用于保护罩。取一根6英寸长的绝缘钢丝（直径0.005英寸），使用金属镊子去除两端各3 mm的绝缘层；另取一根4英寸长的绝缘钢丝（直径0.005英寸），在一端去除3 mm绝缘层，在另一端去除1 cm绝缘层。</li>
<li>将6英寸长的接地导线穿过微型驱动阵列侧面的孔，并向上引至接口板。使用金针将裸露的导线连接至电极接口板上指定的接地孔。该导线将连接至动物颅骨。</li>
<li>将4英寸长的接地导线与已安装的接地导线平行布线。使用金针将3 mm裸露端连接至电极接口板上另一个指定的接地孔。该导线后续将连接至一个保护罩，该保护罩将作为小型法拉第笼以减少噪声干扰。至此，导线连接工作已完成，接下来可进行四极电极的优化处理。</li>
</ol>
3. 设置四极电极的长度
<ol>
<li>本步骤的目标是将所有四极 Recording 电极（tetrodes）剪裁至略长于目标脑区深度的长度。以本实验为例，微型驱动装置的设计最大行程为 5-6 mm，足以到达成年大鼠的多数新皮层区域及背侧海马。首先，将所有微型驱动装置下调，使四极 Recording 电极完全暴露。随后使用一把锋利的精细剪刀，一次性将所有四极 Recording 电极剪至比目标最终长度长约 5 mm 的位置。</li>
<li>进行最终剪裁前，将一把带锯齿的剪刀固定于万能夹具（panavise）中。将其中一个手柄以略微向下倾斜的角度夹紧，并使锯齿面朝上，另一个手柄则保持自由悬垂状态。</li>
<li>现在通过向上旋转微型驱动装置，将所有四极 Recording 电极完全回撤至其导引套管内。</li>
<li>在体视显微镜下，将其中一根四极 Recording 电极完全从其套管中伸出。使用刻度尺，将带锯齿剪刀准确定位于距离导引套管目标长度的位置。缓慢而轻柔地以一次平稳动作剪断该 Recording 电极。剪断后，将微型驱动装置再向上回撤 3-4 mm。对每一根四极 Recording 电极重复此操作，直至全部完成剪裁。至此，即可进入金镀膜步骤。</li>
</ol>
4. 簇电极的镀金及质量检查
对镍铬四极导线进行镀金对于长期稳定的记录至关重要。它可以防止腐蚀并提高生物相容性。
<ol>
<li>将阻抗仪设为外部模式，电流发生器设为带音频输出的直流检测模式（图1d）。将电流发生器的两个探针依次接触每个四通道电极内的六种可能的通道组合，利用音频反馈判断通道间是否存在短路。若存在短路，使用锯齿剪刀重新剪切四通道电极并再次测试。若问题仍然存在，丢弃该四通道电极并更换新的。</li>
<li>当所有四通道电极内部均无短路时，将所有微型驱动装置向下移动，使四通道电极尽可能完全伸出。</li>
<li>调整设备配置以检测电极阻抗（图1e）。将所有四通道电极的尖端浸入标准镀金溶液浴中。镀金液槽与阻抗仪的正极导线电气连接。通过将阻抗仪的负极导线接触连接板上对应的引脚，测量电极的阻抗。</li>
<li>测量并记录微型驱动阵列上每根导线的阻抗。正常值范围为1-3 MΩ。</li>
<li>在电流发生器上，将电流设置为1-3 μA。随后，将阻抗仪的负极导线牢固连接至连接板上的对应引脚。将设备置于电镀配置状态（图1f）。在阻抗仪上快速从正常模式切换至旁路模式，再返回正常模式。在旁路模式期间，电流将通过四通道电极和镀金溶液，使金沉积到电极尖端。每次电镀后的阻抗应低于之前。若阻抗未降至1 MΩ以下，需重复施加电流脉冲。可接受的阻抗保守范围为250 kΩ至350 kΩ。若阻抗低于200 kΩ，可能表明存在短路。</li>
<li>若经过多次脉冲后阻抗仍未充分下降，可能是电极尖端被堵塞。重新剪切四通道电极，检查是否存在短路，并重复镀金过程。若重新剪切无效，则更换四通道电极并重新开始。</li>
<li>完成所有四通道电极的电镀后，将电极尖端短暂浸入乙醇中，并静置干燥3至5分钟。</li>
<li>使用电流发生器在四通道电极尖端暴露于空气的条件下检测是否存在短路。若四通道电极的两个或多个电极之间存在直流连接，则需重新剪切该四通道电极，并再次进行镀金处理。</li>
<li>完成所有四通道电极的镀金后，在每个四通道电极与其聚酰亚胺管之间的接口处添加一滴中等粘度的氰基丙烯酸酯胶水。这将固定四通道电极在微型驱动装置上的位置，并保持其长度不变。</li>
<li>最后一步，通过将所有螺钉向上旋转，将所有四通道电极收回驱动装置内。</li>
</ol>5. 安装保护锥
保护锥的作用是屏蔽微型驱动装置和暴露的四极导线免受环境影响。它还能在实验过程中提供操作支撑，并减少电噪声。我们使用3D打印的塑料锥体（参考第一部分：驱动装置的制作）。然而，也可以使用其他材料制作该锥体，例如弯曲的饮料罐碎片。
<ol>
<li>取塑料锥体，并在其内表面或外表面固定一些铝箔胶带。</li>
<li>接着，在锥体上钻一个直径为1.5 mm的小孔，并在锥体内部用垫圈和螺母松散地安装一颗螺丝，作为接地线的导电通路。我们推荐使用0-80规格的螺丝与垫圈组合。</li>
<li>首先，将三颗1-72规格（长度为3/16英寸）的螺丝插入锥体侧面并部分旋紧。将驱动阵列悬挂后，将锥体套在驱动器上。确保两根接地线均从驱动阵列底部引出。将4英尺长接地线裸露的一端在其中一颗1-72螺丝上缠绕数圈，然后将该螺丝拧紧。通过拧紧其余两颗锥体螺丝，将锥体牢固固定在驱动基座上。</li>
<li>最后，取短接地线剥去1 cm绝缘层的一端，将其缠绕在铝箔胶带与垫圈之间的螺丝上，并拧紧螺丝以固定接地。至此，我们已制备好一个可用于手术植入的微型驱动阵列。</li>
</ol>6. 典型结果
<ol>
 <li>微型驱动阵列的制作现已完成。您的微型驱动阵列装载有18根四极电极和3个参考通道。为增强耐用性，阵列外部包裹有保护锥和顶盖。完成后的微型驱动阵列连同保护锥的平均重量为20g至25g。</li>
 <li>使用标准手术程序植入完成的驱动阵列。如图所示，驱动装置连接至前置放大器芯片和一束导线，用于将信号传输至数据采集硬件和软件。</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/1098/CompositeFigure1_highqualityn.jpg" alt="电镀装置流程；图A-F显示电极连接、溶液流动和分析。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="figure 1"> 图1： A) 四极电极绞合构型示意图。一根水平杆将未粘合的四极电极导线悬挂在自动四极电极绞合装置上方。 B) 四极电极阻抗测量与电极电镀的装置设置。检测短路时电路连接不同：黑色导线连接至连接板上的另一个电极通道。 C) 自制微驱动阵列固定工具的特写图。圆柱形杆为X-Acto刀柄。连接器为26针双排Mill-max连接器。两个部件使用牙科丙烯酸树脂粘合在一起。 D) 短路检测构型。通道X和通道Y为四极电极的任意两个不同通道。 E) 电极阻抗测量构型。电流源处于“关闭”状态。阻抗仪设置为“开启”和“测试”模式。 F) 电极尖端镀金构型。电流源设置为“开启”，音频“开启”，模式为“单极”，直流测试“开启”，电流设定为2 µA。

<ol><li>Gray, C. M., Maldonado, P. E., Wilson, M., McNaughton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrodes+markedly+improve+the+reliability+and+yield+of+multiple+single-unit+isolation+from+multi-unit+recordings+in+cat+striate+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Tetrodes markedly improve the reliability and yield of multiple single-unit isolation from multi-unit recordings in cat striate cortex.</a> J. Neurosci. Methods. 63 (1-2), 43-54 (1995).</li>
</ol>

本方案是分为两部分的系列方案中的第二部分：“用于慢性在体记录的微型驱动阵列”。微型驱动阵列与四极记录电极的结合，是在清醒且行为自由的动物模型中同步记录大量神经元活动的有力工具。希望我们已为您提供了在您自己的实验室中开展或改进电生理记录工作所需的全部必要信息。
电动四极丝扭转装置为定制设计和制作。我们提供了一家供应商及其产品编号，可供您订购功能类似的设备。或者，也可通过将电动旋转条形磁铁与连接鳄鱼夹的磁化搅拌棒组合，自行搭建电动旋转装置；但这种配置很可能需要手动计数旋转次数、手动反转旋转方向，以及手动启动和停止。
某些电极接口板没有用于连接电极导线的针孔式结构。相反，您可能获得的是带有从连接板伸出的金属引脚的接口板；这类金属引脚类似于标准电子元件上常见的引脚。我们简要概述一种将四极记录通道连接至金属引脚的方法。首先，去除每个四极记录电极四根导线末端的绝缘层。可通过手持丁烷喷灯，以火焰短暂灼烧每根电极的末端来实现去绝缘。准备一段能够轻松套在金属引脚上的热缩管，并确保加热后能紧密包裹引脚。将热缩管裁剪至与金属引脚等长。利用毛细作...

<table><tbody><tr><td>Panavise</td><td>工具</td><td>Panavise</td><td>型号 301</td><td>用于固定微驱动阵列或带锯齿的剪刀</td></tr><tr><td>改装的 Xcelite 378M 钳子</td><td>工具</td><td>Newark Inc</td><td>96F8903</td><td>用于插入连接器板引脚。制作方法：将钳子一端的尖端去除 2 mm。</td></tr><tr><td>慢固化胶水</td><td>材料</td><td>Great Planes (Champaign, IL)</td><td>GPMR6015</td><td>用于将四极电极粘接到微驱动装置上</td></tr><tr><td>镀金溶液</td><td>材料</td><td>Neuralynx Inc.</td><td>Sifco Selectron Gold NC</td><td>含有用于电镀的金颗粒</td></tr><tr><td>电流发生器</td><td>工具</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>A365D-B</td><td>又称刺激隔离器，用于将镀金溶液电镀到电极尖端</td></tr><tr><td>阻抗计</td><td>工具</td><td>BAK Electronics</td><td>IMP-1 / 6662 / 2788</td><td>用于检测电极的阻抗</td></tr><tr><td>热风枪</td><td>工具</td><td>Steinel (德国)</td><td>HG 3002 LCD</td><td>用于熔合电极以制成四极电极</td></tr><tr><td>Accu-Tek Carbofib 尖头镊子</td><td>工具</td><td>Aven</td><td>18768 (型号 304)</td><td>用于操作四极电极</td></tr><tr><td>鳄鱼夹</td><td>工具</td><td>Fine Science Tools</td><td>18050-35</td><td>又称 Bulldog serrefine，用于在绞合过程中夹紧四极电极</td></tr><tr><td>显微解剖剪刀</td><td>工具</td><td>Biomedical Research Instruments</td><td>25-1000</td><td>用于四极电极/电极导线的一般切割</td></tr><tr><td>Iris Toughcut 带锯齿剪刀</td><td>工具</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td>用于四极电极的最终切割</td></tr><tr><td>聚四氟乙烯涂层不锈钢导线</td><td>材料</td><td>A-M Systems</td><td>790500</td><td>接地导线</td></tr><tr><td>12.5 微米镍铬导线</td><td>材料</td><td>Kanthal Palm Coast</td><td>Rediohm-800 1/4 HARD PAC COATING</td><td>聚酰亚胺涂层微导线，用于制作四极电极</td></tr><tr><td>四极电极绞合器</td><td>工具</td><td>Neuralynx Inc.</td><td>Tetrode Assembly Station</td><td>提高四极电极制作的速度和一致性</td></tr><tr><td>银漆</td><td>材料</td><td>GC International</td><td>22-023</td><td>用于将四极电极的微电极导线连接至连接器引脚（见讨论部分）</td></tr><tr><td>X-Acto 刀柄</td><td>材料</td><td>MSC Direct</td><td>X3001</td><td>用于构建微驱动装置的固定装置</td></tr><tr><td>26 针双排连接器</td><td>材料</td><td>Mill-Max</td><td>852-10-026-30-001000</td><td>用于构建微驱动装置的固定装置</td></tr></tbody></table>

用于慢性体内记录的微型驱动阵列：四极电极组装

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly

四电极阵列（tetrode）作为一种由四根电极组成的电极束，已被证实是体内同时记录多个神经元活动的有力工具。动作电位信号在四电极各通道间的振幅差异，使得研究者能够从多单元信号中分离出单个神经元的活动。精确控制四电极在脑内的立体定位坐标与植入深度，对于研究不同脑区之间神经活动的协调性至关重要。结合微型驱动阵列（micro-drive array），可在数天至数周的时间内实现多个四电极的精确定位与稳定调控。本实验方案将演示如何使用基本工具和材料制备并处理四电极，将其安装至用于大鼠慢性体内记录的多通道驱动四电极阵列中，完成微驱动阵列的接地导线连接，并在微驱动阵列上安装保护锥，以防止四电极与外界环境发生物理接触。

本方案中，我们演示了如何制备和处理用于微驱动阵列的四极电极，该微驱动阵列专为在大鼠中进行慢性电生理记录而设计。此外，我们还展示了微驱动阵列构建的最后阶段，包括安装接地导线和保护锥。

四电极（tetrode）是一种由四个电极组成的束状结构，已被证实是在体同步记录多个神经元活动的有力工具。其差分……

在本方案中，我们描述了用于清醒啮齿类动物慢性在体记录的四极电极束（Tetrode bundle）的制备与安装步骤，以启动四极电极的制作。将一根微电极丝对折两次，形成由四根平行导线组成的电极束。随后将这些导线绞合在一起，并用热风枪加热处理。每个制作完成的tero被放入储存盒中。在继续制作更多tero的同时，每个tero会通过线性致动器上的开口，沿一条专用通道插入，并从微驱动阵列的底部穿出。tero的四根导线分别连接至固定在微驱动阵列顶部的输出连接板上的独立引脚。通过金电镀工艺降低每个teros通道的阻抗。在所有teros安装并完成电镀后，将两根接地导线连接至连接板上的相应引脚，并在接地后的保护锥固定到微型驱动阵列框架上，以提供保护。至此，一个功能完好的Tero微型驱动阵列已准备就绪，可用于植入。大家好，我是来自皮考特学习与记忆研究所Nat Wilson实验室的Dave Nian。今天在麻省理工学院，我们将向您展示一种制造teros、装载teros以及完成微驱动重建最后阶段的实验流程。我们实验室采用该方法研究清醒且行为活跃的动物模型中大规模神经元群体之间的协调神经活动。现在让我们开始吧。为了构建标准微型驱动阵列的tero，我们首先取一段50厘米长的带绝缘层12微米微丝。将导线对折，用手指沿成对的导线滑动，使其紧密贴合。确保这对导线在其整个长度上保持良好的接触。再次将这一对线材的两端捏合在一起进行折叠。确保一端形成的环状部分没有弯折。将无环一端的四根导线剪齐，使四个端头对齐。下一步需要使用一个经过改装的鳄鱼夹、一个电动旋转装置以及位于旋转装置上方的水平杆。改装鳄鱼夹的方法是在夹子底部粘接一根塑料杆。当夹子尖端暴露时，用改装后的鳄鱼夹将四根导线夹在一起。将金属丝环挂在水平杆上。将鳄鱼夹放入电机驱动的载物台上。在大约三分钟内，对金属丝束顺时针扭转80圈，然后逆时针扭转40圈。这些参数可根据您的需求进行调整。在完成三股绞合后，使用热风枪从三个不同角度对绞合处进行加热融合，每个角度采用中至低风量，起始位置位于线束分叉点下方一至二厘米处。随后，在距离导线约两厘米的范围内上下移动热风枪，持续加热约五秒钟。请注意，高温会完全熔化绝缘层，导致短路。导线熔合后，轻轻抬起鳄鱼夹以释放 tero 上的张力，然后将 tero 从扭绞装置上取下，并在靠近鳄鱼夹处剪断 tero。在另一端，剪开线圈，使得到四根长度相等且无标识的裸线。接下来，用尖端柔软的镊子轻轻弯曲导线，将顶部的各单根线 strand 分开。现在可以将tero装入微驱动阵列中了。再制作21至25根Tet探针，并将其存放在无尘盒中，直至进行tero装载操作。如果你尚未制备完整的微驱动阵列，则需要先完成该阵列的组装。请参考我们的设计计划中用于慢性在体记录的视频微电极驱动阵列，了解微驱动阵列的制备方法。tero 的一端将连接至连接器

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