Name: A型流感病毒的核蛋白复合物的分离纯化及可视化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 学习使用离心分离和透射电子显微镜技术纯化并可视化A型流感病毒核蛋白复合物的方法。该技术有助于病毒学研究中的病毒结构分析。

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本研究得到了加拿大创新基金会（CFI）、加拿大卫生研究院（CIHR）以及加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）的资助。

第一部分：甲型流感病毒颗粒的破坏
<ol>
<li>将750 µl MNT缓冲液（20 mM MES、150 mM NaCl、30 mM Tris，pH 7.5）加入一个Beckman聚碳酸酯离心管（11 mm × 34 mm）中，该离心管专为TLA-120.2转子设计，用于Beckman Optima Max-E超速离心机。</li>
<li>向该离心管中加入500 µl甲型流感病毒（H3N2 X-31 A/AICHI/68毒株；2 mg/ml）。通过反复吹打数次，将病毒与MNT缓冲液混匀。</li>
<li>在Beckman Optima Max-E超速离心机中，使用TLA-120.2转子，于4 °C条件下以109,000 × g离心10分钟。</li>
<li>弃去上清液，并将沉淀重悬于500 µl裂解缓冲液（100 mM KCl、5 mM MgCl2、5% (w/v) 甘油、50 mM 辛基葡萄糖苷、10 mg/ml 溶血卵磷脂、1.5 mM 二硫苏糖醇、100 mM MES，pH 5.5）中。</li>
<li>剧烈涡旋振荡，然后在Eppendorf Thermomixer中于31 °C振荡孵育20分钟。</li>
</ol>
第二部分：甘油梯度沉降速度离心
<ol>
<li>通过将以下体积的甘油加入贝克曼超清晰离心管（13 mm × 51 mm）中来制备甘油梯度：1 ml 70% (v/v) 甘油、0.75 ml 50% 甘油、0.375 ml 40% 甘油和 1.8 ml 33% 甘油。甘油溶液通过将纯甘油与NM缓冲液（150 mM NaCl，50 mM MES，pH 5.5）混合配制而成。同时制备一支含有甘油和缓冲液的平衡管。</li>
<li>再次涡旋振荡破碎后的病毒样品，并将其加样至甘油梯度上。</li>
<li>在贝克曼MLS-50摆桶转子中，以217,000 × g、4 °C离心3.75小时。</li>
<li>离心结束后，从离心管顶部开始手动收集250 µl的梯度组分。将各组分置于冰上或4 °C保存。</li>
</ol>
第3部分：通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析甘油梯度组分
<ol>
<li>从每份组分中取出 20 µl 至新离心管中。</li>
<li>加入 5 µl 的 5x SDS-PAGE 上样缓冲液。</li>
<li>在 95 °C 下加热 5 分钟。</li>
<li>短暂离心样品后，将样品上样至 10% 聚丙烯酰胺凝胶中，并在其中一个泳道加入分子量标记物。</li>
<li>电泳运行样品，直至溴酚蓝上样染料迁移至凝胶底部附近。</li>
<li>用考马斯亮蓝对凝胶进行染色。</li>
</ol>
第4部分：vRNP组分的浓缩
<ol>
<li>选择主要含有核蛋白（NP）的甘油组分，合并后分装至两个Beckman聚碳酸酯离心管（11 mm × 34 mm）中。</li>
<li>用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的超纯水充满每个离心管，并反复吹打数次以混匀。</li>
<li>在Beckman TLA-120.2转子中，于4°C条件下以157,000 × g离心4.5小时。</li>
<li>弃去上清液，将沉淀物重悬于50 µl DEPC处理的水中。</li>
<li>如有需要，可测定浓缩vRNP的A280值。由于NP是合并组分中的主要成分，可利用其消光系数55,350 M-1 cm-1（通过ProtParam3测定）估算NP的摩尔浓度。</li>
<li>将纯化的vRNP分装后于-80 °C冷冻保存，以备后续使用。</li>
</ol>
第5部分：vRNP的负染色
<ol>
<li>将1 µl纯化的vRNP加入9 µl新鲜配制并经过两次过滤的MNT缓冲液（20 mM MES、150 mM NaCl、30 mM Tris，pH 7.5）中进行稀释。也可使用其他缓冲液稀释vRNP或洗涤样品载网（步骤5.5），但如果使用醋酸铀进行负染色，则不得使用PBS。</li>
<li>对预先覆盖有火棉胶和碳膜的样品（铜质透射电镜）载网进行30秒的辉光放电处理。</li>
<li>用镊子夹住刚完成辉光放电的样品载网，将5 µl稀释后的vRNP液滴加至载网表面。</li>
<li>让样品液滴在载网上静置8分钟。</li>
<li>在等待期间，将一小条Parafilm置于实验台面上，分别加入两滴各10 µl的MNT缓冲液（用于洗涤载网），以及一滴80 µl的新鲜配制染色液（1%钼酸铵或1%醋酸铀）于Parafilm上。</li>
<li>吸附8分钟后，用裁成三角形的滤纸从样品载网上吸去部分溶液，注意勿使载网干燥。</li>
<li>将样品载网依次浸入两滴各10 µl的MNT缓冲液中洗涤，总洗涤时间为1分钟。操作时小心将载网放入液滴中，随后用滤纸吸去部分液体（过程中避免载网干燥）。</li>
<li>在吸去最后一滴缓冲液后，立即将样品载网完全浸入染色液滴中，静置1分钟。</li>
<li>用滤纸将染色液从样品载网上彻底吸干。</li>
<li>将样品载网在空气中干燥数分钟，随后置于透射电子显微镜下观察。</li>
</ol>
第6部分：代表性结果：
<img src="/files/ftp_upload/old/1105_2009_1_22_1/1105_Figure2.png" alt="SDS-PAGE 凝胶电泳图；蛋白质条带分析，泳道标注，分子量标记物。" width="600" height="215" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2">
图1
由于甲型流感病毒NP（约56 kDa）是病毒核糖核蛋白复合物中的主要蛋白，因此在含有vRNP的组分中，NP条带通常是最强的条带（图1）。除了NP外，每个甲型流感病毒vRNP还包含一个三聚体RNA聚合酶（分子量分别为82、86和86.5 kDa）复合物。由于这些聚合酶的丰度远低于NP，因此在考马斯亮蓝染色中可能无法观察到。然而，若改用银染对凝胶进行染色，则可检测到这些聚合酶。在NP蛋白洗脱峰所在的组分中，甲型流感病毒基质蛋白M1（约28 kDa）应仅有微量存在。
<img src="/files/ftp_upload/old/1105_2009_1_22_2/1105_3.png" alt="生物分子结构的电子显微镜；纳米尺度，结构分析。" width="600" height="360" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3">
图2
在透射电子显微镜下观察到的负染色vRNP应呈现为杆状颗粒，长度可变，约为30 nm至120 nm（图2a）。寡聚化的NP以NP分子链的形式排列，并进一步折叠成双螺旋重复结构，因此这些杆状颗粒两端有时可见环状结构（图2b）。

<ol><li>Kemler, I., Whittaker, G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+import+of+microinjected+influenza+virus+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Nuclear import of microinjected influenza virus ribonucleoproteins.</a> Virology. 202, 1028-1033 (1994).</li>
<li>Wu, W. W. H., Weaver, L. L., Panté, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+the+nuclear+localization+sequences+on+influenza+a+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of the nuclear localization sequences on influenza a ribonucleoprotein complexes.</a> J Mol Biol. 374, 910-916 (2007).</li>
<li>Gasteiger, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGasteiger%2C+E+%22The+Proteomics+Protocols+Handbook%22">The Proteomics Protocols Handbook</a>. Walker, J. M. , Humana Press. 571-607 (2005).</li>
<li>Wu, W. W. H., Sun, Y. H. B., Panté, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+import+of+influenza+A+viral+ribonucleoprotein+complexes+is+mediated+by+two+nuclear+localization+sequences+on+viral+nucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Nuclear import of influenza A viral ribonucleoprotein complexes is mediated by two nuclear localization sequences on viral nucleoprotein.</a> Virol J. 4, 49-49 (2007).</li>
<li>Babcock, H. P., Chen, C., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+single-particle+tracking+to+study+nuclear+trafficking+of+viral+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Using single-particle tracking to study nuclear trafficking of viral genes.</a> Biophys J. 87, 2749-2758 (2004).</li>
</ol>

vRNPs 的纯化基于 Kemler 描述的方法 等 (1994).1 我们及其他研究者也已采用该方案分离vRNP，以研究其核输入过程。2,4,5
在操作vRNP时，我们建议使用无RNase的枪头和离心管，因为病毒基因组由RNA组成，因此在RNase存在下容易降解。此外，所有缓冲液均应使用无RNase的水配制。本文所述方案采用酸性提取条件（例如，裂解缓冲液和甘油梯度的pH值为5.5）。类似地，也可进行碱性提取（如Kemler et al. (1994)1所述），将MES（pH 5.5）替换为Tris（pH 7.8）即可。

<table><tbody><tr><td>H3N2 X-31 A/AICHI/68 甲型流感病毒</td><td>Charles River Laboratories</td><td>490715</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-8250</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-1</td><td></td></tr><tr><td>辛基葡萄糖苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O-8001</td><td></td></tr><tr><td>溶血卵磷脂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-4129</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9779</td><td></td></tr><tr><td>考马斯亮蓝 G-250</td><td>Kodak</td><td>1367796</td><td></td></tr><tr><td>焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水</td><td>Invitrogen</td><td>750024</td><td></td></tr><tr><td>醋酸铀酰</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>19481</td><td></td></tr><tr><td>钼酸铵</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-674</td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX-E 超速离心机</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>434491</td><td></td></tr><tr><td>MLS-50 转子组件，摆桶式</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>367280</td><td></td></tr><tr><td>TLA-120.2 转子组件，固定角转子，钛材质</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>362046</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer</td><td>Lauda Brinkmann</td><td>022670000</td><td></td></tr></tbody></table>

甲型流感病毒核糖核蛋白复合物的纯化与可视化

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

甲型流感病毒基因组由八条负链单链RNA分子组成，每条RNA分子均与多个甲型流感核蛋白（NP）拷贝结合，分别包装成病毒核糖核蛋白复合物（vRNPs）。这些vRNPs被包裹在病毒包膜内。然而，在病毒进入细胞的过程中，这些vRNP复合物会被释放到细胞质中，并由此进入宿主细胞的核转运系统。为了研究甲型流感vRNPs的核输入过程以及流感病毒基因组的复制机制，使用分离纯化的vRNPs进行实验非常有益，这样可以避免病毒其他组分对相关过程的干扰。本文描述了一种从甲型流感病毒中纯化vRNPs的实验方法。该方法首先使用去垢剂裂解甲型流感病毒颗粒，以释放出vRNP复合物。随后，通过33–70%的不连续甘油梯度速度沉降法，将vRNPs与其他病毒组分分离。收集甘油梯度各组分后，经考马斯亮蓝染色后进行SDS-PAGE分析。合并含有NP蛋白的峰值组分，并通过离心浓缩。浓缩后，采用负染色透射电子显微镜观察vRNPs形态，以验证其结构完整性。本甘油梯度纯化方法是在Kemler方法基础上改进而来的。等(1994)1，负染色由 Wu 完成等(2007年)2

甲型流感病毒的基因组由八个独立的RNA和蛋白质复合物组成，称为病毒核糖核蛋白复合物（vRNPs）。本文介绍了甲型流感病毒vRNPs的甘油梯度纯化及其透射电子显微镜观察方法。

甲型流感病毒基因组由八条负链单链RNA分子组成，每条RNA分子均与多个甲型流感病毒...拷贝分别包装在一起

本实验首先通过离心去除甲型流感病毒溶液中的任何碎片。然后使用去污剂破坏病毒膜，并通过甘油梯度分离释放出的病毒核蛋白复合物（vR NPs）。从梯度中收集离心后的各组分，并取每种组分的等分试样进行SDS-PAGE分析。使用考马斯亮蓝对凝胶染色，以确定含有VNPs的峰值组分。含有VNPs的组分随后通过离心浓缩，将纯化的VRPs加样至铜制透射电镜载网，然后进行负染色，以便通过透射电子显微镜观察VRPs。大家好，我是WinCo Wu，来自不列颠哥伦比亚大学动物学系Nellie Pane博士的实验室。我是Lindsay Weaver，曾就职于Pane实验室。今天我们将向您展示一种纯化流感病毒核糖核蛋白复合物的实验方法。在我们的实验室中，该方法用于研究甲型流感病毒在组织培养细胞中的核内输入过程。下面我们开始实验。首先，将750微升MNT缓冲液加入一支11毫米×34毫米的Beckman聚碳酸酯离心管中。接着，向管中加入500微升浓度为2毫克/毫升的甲型流感病毒溶液，用移液器上下吹打数次，使病毒与MNT缓冲液充分混匀。混匀后，将离心管放入TLA120.2转子中，在Beckman Optima max E离心机中于4°C、109,000 ×g条件下离心10分钟。离心结束后，弃去上清液，将沉淀重悬于500 µL裂解缓冲液中，充分涡旋混匀，然后在Eppendorf Thermomixer中于31°C振荡孵育20分钟。振荡完成后，进行甘油梯度沉降速度离心。制备甘油梯度时，将以下液体加入贝克曼（Beckman）UltraClear 13 毫米 × 51 毫米离心管中：1 毫升 70%（体积比）甘油、0.75 毫升 50% 甘油、0.375 毫升 40% 甘油，以及 1.8 毫升 33% 甘油。这些甘油溶液通过将纯甘油与 NM 缓冲液混合配制而成。同时准备一支含有甘油和缓冲液的平衡管。然后再次涡旋振荡已破碎的病毒样品，并将其加样至甘油梯度中。将离心管放入贝克曼MLS 50 摆动桶转子中，在4°C条件下以217,000 ×g离心3小时45分钟。离心结束后，从离心管顶部开始，手动收集250微升的梯度组分。将各组分置于冰上或4°C保存。收集完所有组分后，即可使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对其进行分析。开始进行SDS-PAGE分析时，从每份组分中取出20 µL转移至新的离心管中。然后加入5 µL的5倍浓度SDS-PAGE上样缓冲液，将样品在95 °C加热5分钟。加热后，短暂离心样品，随后将其上样到10%聚丙烯酰胺凝胶中，并在其中一个加样孔中加入分子量标记物。接着电泳运行样品，直至溴酚蓝上样染料迁移至凝胶底部附近。从SDS-PAGE装置中取出凝胶，并用考马斯亮蓝对凝胶进行染色。根据染色结果，鉴定主要含有甲型流感病毒核蛋白的组分。流感病毒A型NP的分子量约为56千道尔顿，是病毒核糖核蛋白复合物中的主要蛋白。因此，在含有VRNP的组分中，NP条带通常是条带最强的一条。在下一部分中，我们将对这些VRNP组分进行浓缩。合并主要含有NP的甘油组分，并将其分装到两个Beckman 11毫米×34毫米的聚碳酸酯离心管中，每管用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的超纯水或乙基焦碳酸酯填充。然后上下吹打数次以混匀。将离心管放入Beckman TLA 120.2转子中，在4°C条件下以157,000 ×g离心4.5小时。离心结束后，弃去上清液并重悬沉淀。用 50 µL 经 DEPC 处理的水将纯化的 V NPS 分装，其中一份留作备用，其余分装样品于 -80 °C 保存。现在我们已准备好进行 VRPs 的负染色操作。将一微升纯化的病毒核糖核蛋白（VRNP）加入九微升新鲜配制并经过两次过滤的PBS缓冲液中进行稀释，随后对铜制透射电镜样品载网进行30秒的辉光放电处理。该载网先前已镀有帕洛伊丁（Parlow Dion）和碳膜。用镊子夹住经辉光放电处理后的样品载网，将五微升稀释后的VRNP溶液滴加到载网上。等待期间，让液滴在载网上吸附八分钟。将一小条滤纸放入托盘中，然后在滤纸上滴加两滴 PBS 缓冲液，每滴 10 微升，以及一滴 80 微升的新鲜配制染色液，染色液由 1% 的甲胺银溶液组成。接着，将样品载网小心地浸入 PBS 的两滴液滴中，清洗总时长为一分钟。然后用一片滤纸从样品载网上吸去部分溶液，注意不要让样品载网干燥。在从样品载网上吸去最后一滴缓冲液后，立即将样品载网完全浸入染色液滴中，并等待一分钟。一分钟后，使用新的滤纸将染色液从样品载网上彻底吸除。让样品载网在观察前晾干数分钟。在透射电子显微镜下，以下是经负染色的 V 纳米颗粒的代表性透射电子显微镜图像。如您在此处所见，病毒核蛋白复合物（V NPS）呈杆状颗粒，长度可变，约为30纳米至120纳米。寡聚核蛋白（NP）以核蛋白分子链的形式排列，并进一步折叠成双螺旋重复结构，因此在这些杆状颗粒的两端有时可见环状结构。我们刚刚向您展示了如何纯化和观察流感病毒A的核糖核蛋白复合物。在进行此操作时，如果您使用醋酸铀对VR mps进行负染色，则在稀释时切勿使用PBS。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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