电生理方法记录从果蝇幼虫NMJ突触潜力
February 6th, 2009
在这里，我们描述了测量在果蝇幼虫神经肌肉接头处突触传递的电生理方法。发起人为诱发释放刺激运动神经元轴突，并通过NMJ传输，可在肌肉引起突触后反应测量。
从 Joof 幼虫神经肌肉接头产生稳定的电生理记录。首先解剖打开幼虫，在记录之前暴露体壁、肌肉和神经系统。CNS 基部的轴突在腹侧神经节后方切割。
然后将记录电极放置在感兴趣的肌肉上，并将刺激电极放置在神经支配运动神经元附近。运动神经元的切断轴突被吸入刺激移液管中。然后可以记录兴奋性连接电位。
大家好，我是来自哥伦比亚大学生理学和细胞生物物理学系 McCabe 实验室的 Wendy MLA。今天，我们将向您展示一种测量 GE 熔岩神经肌肉接头处抽搐传递的程序。我们在实验室中使用该程序来研究突触生理学和神经传递。
那么让我们开始吧。要开始实验，解剖流浪的第三和星形幼虫以暴露体壁。该方案通过使用短解剖针针对电生理实验进行了修改。
这些长度约为 2 到 4 毫米，在实验过程中不太可能撞击电极中的显微镜物镜。暴露体壁后，用镊子握住 CNS 并稍微抬高。然后切断周围神经运动轴突并切除大脑。
去除洗脑后，用含 1 毫摩尔钙的 HL 3.1 缓冲液对解剖的制备物进行两次清洗。现在解剖已经完成，可以从幼虫肌肉细胞进行细胞内记录。将解剖板放在电生理显微镜上，用 HL 3.1 缓冲液加钙浸没制备物。
然后固定浴电极，使其与溶液接触。抽吸电极用于刺激支配肌肉的周围神经。首先将抽吸电极放在培养皿中，以避免将细胞内电极放在肌肉上时产生振动。
电极放入培养皿中后，将其放置在支配肌肉 6 的运动神经元附近。在第三个腹部段，轻轻吸力，直到切割神经位于玻璃移液管内。抽吸时注意不要拉伸神经。
稍微抬起移液器，使其不接触肌肉。然后定位它，使其不会拉扯切割的神经纤维。抽吸电极就位后，将记录电极定位以进行细胞内记录。
使用充满三摩尔氯化钾的尖锐微电极。将记录电极放在肌肉 6 中心的上方。调整 input offset （输入偏移），使 bath solution 的读数为零。
慢慢降低电极并在高光学放大倍率下接近肌肉，直到它接触到肌肉表面。要确认肌肉已被穿透，请观察示波器。静息膜电位应至少为负 60 毫伏。
现在应该可以看到零星的微型 nplate 电位。记录电极就位后，让电池稳定一分钟。在开始记录之前，使用轴突 HS 二，轴夹二 B 放大器中的头部载物台来检测膜电位的变化。
轴夹二 B 是与计算机的接口，该计算机通过数字数据运行 P 夹软件。1322 A，将信号数字化。在 PC 上记录膜电位。使用 clamp X 软件，对运动轴突施加刺激以产生兴奋性膜电位或 ejs。
生成 ejs 后，在没有刺激突触的情况下记录三分钟内的微型 ejs。软微型分析软件可用于分析迹线并确定微型 EJP 幅度和频率。要生成 ejs.
使用主 8 脉冲发生器刺激运动神经元程序的切断端。发生器提供 0.3 毫秒平方电压脉冲程序。刺激之间的 5 秒间隔时间，以允许突触恢复。
在 NMJ 记录每块肌肉至少 10 个诱发电位并平均振幅。该图显示了野生型 sal 幼虫的第 6 块肌肉中记录的典型痕迹，具有诱发的 EJP 反应和自发的迷你 EJ.PS 我们刚刚向您展示了如何记录果蝇熔岩神经肌肉接头的 cy 电位。执行此程序时，请务必记住在 3 到 10 分钟内完成解剖，并在细胞仍然健康且反应灵敏时立即开始电生理记录。
如果解剖时间过长，肌肉细胞的静息膜电位将小于负 60 毫伏，这太低了，无法记录。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。
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概述
本文描述了测量果蝇幼虫神经肌肉接头（NMJ）突触传递的电生理学方法。该过程包括解剖幼虫以暴露体壁和神经系统，然后放置记录和刺激电极以测量兴奋性接头电位。
关键研究组成部分
科学领域
- 电生理学
- 神经科学
- 突触传递
背景
- 理解突触传递对于洞察神经通信至关重要。
- 果蝇幼虫作为研究NMJ的模型生物。
- 电生理学技术允许精确测量突触活动。
- 可以人为地刺激NMJ的诱发释放以进行分析。
研究目的
- 展示在NMJ记录突触传递的方法。
- 为感兴趣的电生理学研究提供一个协议。
- 增强对神经肌肉信号机制的理解。
使用的方法
- 解剖果蝇幼虫以暴露肌肉和神经系统。
- 在感兴趣的肌肉上放置记录电极。
- 在运动神经元附近使用刺激电极。
- 刺激后记录兴奋性接头电位。
主要结果
- 成功测量了NMJ的突触传递。
- 展示了诱发的兴奋性接头电位。
- 验证了电生理学方法用于研究NMJ。
- 洞察了果蝇中突触信号传递的动力学。
结论
- 概述的方法为研究NMJ传递提供了一种可靠的方法。
- 电生理学记录可以揭示突触功能的重要方面。
- 本研究有助于更广泛理解神经肌肉相互作用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Electrophysiological recording at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ) provides a genetically tractable, quantitative platform for interrogating synaptic function and neurotransmission. This model enables high-confidence target validation and mechanistic de-risking in early discovery, supporting predictive assessment of synaptic modulation and genetic perturbations. The approach is directly relevant for portfolio teams seeking robust, reproducible systems for neurobiology-driven drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of synaptic transmission and quantal content for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by isolating genetic or pharmacological effects on neurotransmission.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of synaptic pathways in a defined, manipulable system.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible assay for quantifying excitatory junction potentials (EJPs) and miniature EJPs (mEJPs).
- Delivers quantitative outputs suitable for comparative analysis across genetic backgrounds or compound treatments.
- Enables preparation of validated biological systems for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant synaptic mechanisms for translational continuity in neurobiology programs.
- Supports risk-adjusted advancement by providing predictive data on synaptic function and modulation.
- Offers a bridge from genetic discovery to preclinical validation in neuromuscular and synaptic disorders.
Pipeline & Workflow Integration
This electrophysiological method integrates into the discovery continuum from early target validation through assay development and preclinical research, enabling iterative hypothesis testing and mechanistic evaluation.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing and pathway clarification by quantifying synaptic responses to defined manipulations.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts of EJP amplitude and frequency for robust assay development.
- Analytics: Provides digitized, statistically analyzable data for cross-condition and cross-genotype comparisons.
- Translational Research: Facilitates alignment with disease-relevant synaptic endpoints for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, genetically flexible platform for ongoing neurobiology and synaptic function studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in synaptic target validation.
- Operational Value: Standardizes electrophysiological workflows for reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio triage based on quantitative synaptic data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurobiology-focused assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology and Drosophila genetics for optimal execution.
- Demands specialized instrumentation, including microelectrodes, amplifiers, and digitization hardware.
- Necessitates cross-team standardization of dissection and recording protocols for reproducibility.
- Adaptable to various genetic backgrounds and experimental manipulations within the Drosophila system.
- Limited to model organism context; translational extrapolation requires careful validation.
