Name: 近质膜和全球星形胶质细胞内钙动力学测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-26T23:27:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: 学习使用全内反射和落射荧光显微镜测量星形胶质细胞近质膜和全局钙动力学的方法。该技术通过制备星形胶质细胞-神经元共培养物并加载Fluo-4钙指示剂染料，实现同时观察细胞内钙信号变化。

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本研究由日本上原纪念基金会（授予 ES）以及怀特霍尔基金会、国家神经疾病与中风研究所和斯坦因-奥本海默捐赠基金奖（授予 BSK）资助。

实验步骤
实验步骤包括两个关键部分，以下将分步进行描述。
第1部分：制备海马星形胶质细胞培养物
简而言之，混合型海马星形胶质细胞-神经元培养物采用一种成熟的方案制备1,2,3。我们对步骤进行了优化，以获得健康的培养星形胶质细胞。以下所列所有操作均须在无菌环境中进行，例如超净工作台内。
准备盖玻片
<ul>
	<li>22 mm 盖玻片 (VWR, 48380-068)</li>
	<li>多聚-D-赖氨酸 (PDL, Sigma P0899)，分装 (1 mg/ml)</li>
	<li>层粘连蛋白分装液 (20 μg/ml)：向 1 mg/ml 层粘连蛋白溶液 (Sigma L2020) 中加入 49 ml 无菌水，制成 1.2 ml 分装液，于 -20°C 保存</li>
</ul>
<ol>
	<li>将PDL溶解于无菌水中（50 μg/ml）。</li>
	<li>对盖玻片进行高压灭菌，用无菌水冲洗后放入PDL溶液中（100个盖玻片使用20 ml）。室温下静置过夜。</li>
	<li>用无菌水替换PDL溶液（充分洗涤3次），然后干燥盖玻片并保存于4°C。</li>
	<li>在接种星形胶质细胞的前一天，将单个盖玻片置于6孔板的无菌孔中（BD Bioscience的无菌多孔平底带盖培养板）。每张盖玻片上加入400 μl层粘连蛋白，于培养箱中孵育过夜，以避免蒸发。</li>
</ol>

解剖
解剖用培养基：
<ul>
	<li>500 ml Earle's 平衡盐溶液（EBSS）（1X），液体（Invitrogen，14155-063）</li>
	<li>5 ml HEPES 溶液（Sigma，H0887）</li>
</ul>

海马体培养基：
<ul>
	<li>412.5 ml 最低必需培养基（MEM）(1X)，液体，含 Earle's 盐，不含 L-谷氨酰胺和酚红（Invitrogen，51200-038）</li>
	<li>10 ml 葡萄糖（Sigma，D-(+)-无水葡萄糖 SIGMA ULTRA G7528），1 M 溶于 MEM</li>
	<li>5 ml 青霉素-链霉素溶液（Invitrogen，15140-122）</li>
	<li>5 ml 丙酮酸钠溶液（Sigma，S8636）</li>
	<li>12.5 ml HEPES 溶液，1 M（Sigma，H0887）</li>
	<li>5 ml N-2 添加剂（100X），液体（Invitrogen，17502-048）</li>
	<li>50 ml 马血清，经热灭活（Invitrogen，26050-088）</li>
</ul>


木瓜蛋白酶溶液：
<ul>
	<li>向 Worthington PAPAIN-022 小瓶（LK003178；终浓度 20 U/ml）中加入 5 ml 解离培养基，并在 37°C 下孵育 60 分钟。</li>
</ul>

<ol>
	<li>根据国家法规及本地机构动物护理与使用委员会审核批准的指南，处死出生后第1天（P1）的大鼠幼崽（通常为2只）。</li>
	<li>去除皮肤和颅骨，将脑组织置于盛有冷解剖液的培养皿中。</li>
	<li>去除脑膜，分离两侧半球并解剖出海马体。</li>
	<li>将海马体切成约1×1 mm的组织块，在37°C下用木瓜蛋白酶溶液消化11–13分钟。</li>
	<li>待组织块沉降后，小心吸除木瓜蛋白酶，并加入5 ml海马体培养基以彻底清除酶残留。重复此步骤一次，最后用海马体培养基重悬细胞（2 ml）。</li>
	<li>用三支经火焰抛光、内径依次减小（1000 μm、约500 μm和约300 μm）的移液管，轻轻吹打细胞约5次，直至无细胞团块残留。</li>
	<li>吹打完成后，将细胞悬液通过细胞筛网（孔径70 μm，BD Bioscience）过滤。取10 μl悬液进行细胞计数，并调整海马体培养基体积，使细胞密度达到400000个/ml。</li>
	<li>吸除盖玻片上的多聚赖氨酸溶液，在盖玻片未干燥前，每张盖玻片接种200 μl细胞悬液。</li>
	<li>将盖玻片置于培养箱中孵育60分钟，使细胞贴壁，随后每孔加入2 ml海马体培养基。</li>
	<li>次日，吸除旧的海马体培养基以去除死亡细胞和碎片，并每孔加入2 ml预热的新鲜海马体培养基。</li>
</ol>

维持
Neurobasal 培养基：
<ul>
	<li>500 ml 神经基础培养基（Neurobasal，Invitrogen，12348-017）</li>
	<li>10 ml B27 无血清添加剂（Invitrogen，17504-044）</li>
	<li>5 ml 青霉素-链霉素溶液（Penicillin-Streptomycin，Invitrogen，15140-122）</li>
	<li>1.25 ml L-谷氨酰胺溶液（L-glutamine，Invitrogen，25030-149）</li>
</ul>
从接种后第四天开始，每周两次用神经基础培养基喂养星形胶质细胞-神经元共培养物。将培养基在通风的烧瓶中预先在培养箱中孵育约30分钟，以平衡温度和CO2。
第二部分：钙成像
海马记录缓冲液：110 mM NaCl，5.4 mM KCl，1.8 mM CaCl2，0.8 mM MgCl2，10 mM D-葡萄糖，10 mM HEPES（所有化学试剂均来自Sigma），pH 7.4（用NaOH调节）。
将钙离子指示剂染料载入星形胶质细胞
<ol>
	<li>将培养物放入6孔板的一个孔中，孔内含有2 ml海马记录缓冲液，其中加入2.5 μM Fluo-4, AM（Invitrogen, F-14217）和0.05% Pluronic® F-127的20% DMSO溶液（Invitrogen, P-3000MP），在室温下孵育10-30分钟。</li>
	<li>移除Fluo-4溶液，用海马记录缓冲液洗涤盖玻片3次，并在室温下孵育30分钟。</li>
	<li>将盖玻片放置于灌流 chamber 上，用镜头清洁液清洁盖玻片的另一面。</li>
	<li>在物镜上滴加一滴浸油（Cargille公司Immersion Oil TYPE DF），然后将chamber（Warner Instruments的25 mm圆形盖玻片开放式chamber）置于显微镜（Olympus IX71）载物台上。</li>
	<li>使用透射光观察细胞形态，并调节至清晰对焦。然后使用单色光发生器（TILL Vision的Polychrome V）提供488 nm激发光，观察星形胶质细胞中Fluo-4的荧光信号是否均匀且可检测。</li>
	<li>使用落射照明（EPI）和全内反射荧光（TIRF）照明法测量星形胶质细胞中的钙信号。</li>
</ol>

全内反射荧光显微镜
简而言之，我们使用配备 Andor IXON DV887DCS EMCCD 相机的 Olympus IX71 显微镜。激发光控制与图像采集通过 TILLVision 软件实现。454/488/515 nm 氩离子激光器（100 mW）和 442 nm 固态激光器（45 mW）的光束通过 TILL Polyline 激光合束器、TIRF 双通光路聚光镜以及声光可调滤波器及其控制器（AOTF；以上均来自 TILL Photonics）进行合并与调控，随后经由 Kineflex 宽带光纤导入 TIRF 聚光镜。我们采用 Olympus 60X 1.45 NA 物镜实现全内反射荧光（TIRF）。针对每个星形胶质细胞，调整相机增益以获得最佳信噪比图像。TIRF 显微镜的背景知识与基本原理已有近期综述4, 5。我们所使用的大部分光学元件购自 TILL Photonics，该公司现为安捷伦科技（Agilent Technologies）的一部分（http://www.till-photonics.com/）。TIR 穿透深度可通过以下公式计算。
<img alt="显微镜公式图中带有数值孔径NA的光学分辨率方程。" src="/files/ftp_upload/1142/equation.jpg" style="float:left;" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程">

d = 穿透深度
n1 = 玻璃的折射率
n2 = 细胞的折射率
a = 入射角
NAi = 入射数值孔径
 
为了确保激光在全内反射荧光（TIRF）成像中处于最佳对准状态，我们发现观察100 nm荧光微球（Invitrogen, F8803）非常有用。我们展示了使用宽场（EPI）和TIRF显微镜拍摄的微球静态图像和视频。在TIRF模式下，可观察到信噪比显著提高，且微球呈现布朗扩散。我们发现定期（约每周一次）通过TIRF显微镜观察100 nm微球的行为有助于确认是否实现了最佳TIRF成像，从而避免因入射角未达到临界角α而产生的非理想斜入射照明（见图1）。
G蛋白偶联受体激动剂的应用
星形胶质细胞表达多种Gq偶联受体6, 7，包括代谢型谷氨酸受体和P2Y受体（激动剂：ATP、ADP）。这些受体的激活可导致星形胶质细胞内钙离子水平显著升高。例如，在向星形胶质细胞施加ATP（30 μM）时，可明显观察到细胞内钙离子浓度的上升8-10。我们使用华纳仪器公司（Warner Instruments）生产的VC-77SP快速溶液切换系统（Fast-Step灌流系统）（http://www.warneronline.com/index.cfm）。利用该方法，溶液可在不到约10 ms的时间内完成切换。
<img alt="配备奥林巴斯IX71显微镜和Andor iXon EMCCD的光谱学装置；包括声光可调滤波器（AOTF）和激光系统。" src="/files/ftp_upload/1142/fig1a.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
 
 
 
 
 
<img alt="全内反射荧光（TIRF）显微镜装置与蛋白质分析示意图。" src="/files/ftp_upload/1142/fig1c.jpg" data-altupdatedat="1787630408000">
图1. 成像系统的示意图与照片。A. 显示安装在气浮平台上的显微镜照片；B. 显示激光组件、控制器和光束盒的照片。C. 显示用于成像的培养腔室安装在显微镜载物台上的照片。左侧可见快速灌流装置（连同步进电机和theta导管），右侧可见Axopatch 200A放大器的头级。示意图描绘了系统中的光路以及全内反射荧光（TIRF）的实现方式。激光聚焦于60倍、数值孔径1.45的物镜的后焦平面，并将其位置调节至偏离中心，使光束以临界角α进入浸油。此时光束发生全内反射，并在折射率较低的介质中以距离λ衰减（见正文中的公式）。在此情况下，该介质为星形胶质细胞周围的记录缓冲液以及星形胶质细胞本身。结果是仅对质膜约100 nm范围内的分子进行光学激发（从而实现成像）。在细胞示意图中，这表现为绿色的“被激发”膜受体，而细胞内部或细胞顶面的分子则未被激发。Steyer和Almers4已对TIRF显微技术进行了全面阐述。
<img alt="EPI与TIRF显微镜示意图；对比度比较，细胞成像，荧光技术。" src="/files/ftp_upload/1142/fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2">
图2. 使用宽场落射荧光（EPI）和全内反射荧光（TIRF）显微镜获取的100 nm荧光微球图像。A. 显示包含数十个100 nm荧光微球的视野的EPI图像。红色箭头指向已沉降在玻璃盖玻片上的微球，而蓝色箭头指向在水中扩散的微球。B. 显示与A中相同视野的TIRF图像。在此图像中，仅可见由红色箭头指示的已贴附的微球，因为这些微球已沉降在玻璃盖玻片上，因而位于约100 nm的隐逝场范围内。A图中由蓝色箭头指示的微球不在该区域内，因此在TIRF图像中不可见。下方的图像显示了图像的三维渲染图。显然，当通过TIRF显微镜观察时，处于隐逝场内的微球信噪比显著提高。事实上，这些图像中EPI的信噪比为7.1 ± 0.6，而TIRF的信噪比为20 ± 0.7。
<img alt="荧光显微镜比较，EPI与TIRF；ATP反应，强度图，10 µm比例尺。" src="/files/ftp_upload/1142/fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3">
图 3. 使用 EPI 和 TIRF 显微镜采集的星形胶质细胞加载 Fluo-4 钙离子指示剂染料后的图像。A. 一个包含五个星形胶质细胞的视野的 EPI 图像。B. 与 A 相同视野的 TIRF 图像。请注意，A 和 B 中的图像存在显著差异。这是由于 TIRF 照明仅对紧贴玻璃盖玻片的质膜区域进行成像。下方图像显示了通过 EPI 和 TIRF 显微镜观察到的 ATP 诱发的细胞内钙瞬变。

<ol><li>Richler, E., Chaumont, S., Shigetomi, E., Sagasti, A., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+to+image+activation+of+transmitter-gated+P2X+receptors+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An approach to image activation of transmitter-gated P2X receptors in vitro and in vivo.</a> Nature Methods. 5, 87-93 (2008).</li>
<li>Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin-mediated+endocytosis+is+the+dominant+mechanism+of+vesicle+retrieval+at+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses.</a> Neuron. 51, 773-786 (2006).</li>
<li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+hippocampal+neurons+from+P0+newborn+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats.</a> J Vis Exp. 19, (2008).</li>
<li>Steyer, J. A., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+real-time+view+of+life+within+100+nm+of+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A real-time view of life within 100 nm of the plasma membrane.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 268-275 (2001).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Fix, M., Takano, T., Nedergaard, M., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+vesicle+fusion+from+lysis+to+monitor+calcium-triggered+lysosomal+exocytosis+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Resolving vesicle fusion from lysis to monitor calcium-triggered lysosomal exocytosis in astrocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 14151-14156 (2007).</li>
<li>Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+signalling+between+astrocytes+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dynamic signalling between astrocytes and neurons.</a> Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).</li>
<li>Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLIA%3A+listening+and+talking+to+the+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GLIA: listening and talking to the synapse.</a> Nat Rev Neurosci. 2, 185-193 (2001).</li>
<li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+excites+interneurons+and+astrocytes+to+increase+synaptic+inhibition+in+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ATP excites interneurons and astrocytes to increase synaptic inhibition in neuronal networks.</a> J Neurosci. 24, 8606-8620 (2004).</li>
<li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+forms+of+astrocyte+single+vesicle+exocytosis+imaged+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Two forms of astrocyte single vesicle exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 4212-4217 (2007).</li>
<li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+ATP+is+the+predominant+cause+of+intercellular+calcium+waves+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Vesicular ATP is the predominant cause of intercellular calcium waves in astrocytes.</a> J Gen Physiol. 129, 485-491 (2007).</li>
<li>Agulhon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+role+of+astrocyte+calcium+in+neurophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology.</a> Neuron. 59, 932-946 (2008).</li>
<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mystery+and+magic+of+glia%3A+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60, 430-440 (2008).</li>
<li>Lee, S. Y., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+glutamate+targets+NMDA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Astrocytic glutamate targets NMDA receptors.</a> J Physiol. 581, 887-888 (2007).</li>
<li>Shigetomi, E., Bowser, D. N., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+forms+of+astrocyte+calcium+excitability+have+distinct+effects+on+NMDA+receptor-mediated+slow+inward+currents+in+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two forms of astrocyte calcium excitability have distinct effects on NMDA receptor-mediated slow inward currents in pyramidal neurons.</a> J Neurosci. 28, 6659-6663 (2008).</li>
<li>Cahoy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptome+database+for+astrocytes%2C+neurons%2C+and+oligodendrocytes%3A+a+new+resource+for+understanding+brain+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function.</a> J Neurosci. 28, 264-278 (2008).</li>
</ol>

众所周知，星形胶质细胞会表现出细胞内钙水平的升高。这种钙升高可自发发生，也可由神经元活动或施加激动剂激活星形胶质细胞表面受体所触发11。一个重要的且存在争议的问题是：星形胶质细胞的细胞内钙升高是否能够触发信号分子的释放，从而激活神经元上的受体11, 12。这一问题存在争议，是因为已有研究既提供了支持也提供了反对这一观点的证据，Haydon7, 13 和 McCarthy11 实验室的综述对此进行了重点阐述。根据我们近期在脑片成像和电生理方面的研究数据，我们认为，在设计新的、基于假设的实验以明确星形胶质细胞如何影响神经元之前，必须首先更深入且精确地理解星形胶质细胞的钙动力学14。在本视频文章中，我们介绍了一种简单的方法，可在培养的星形胶质细胞中近乎同时地成像近质膜区域和全细胞范围内的细胞内钙变化。全内反射荧光（TIRF）显微镜的一项不可避免的技术要求是必须使用培养细胞，因为这些细胞需贴附于玻璃盖玻片上，处于衰逝场的穿透深度范围内3。值得注意的是，与体内状态相比，培养状态下的星形胶质细胞会发生基因表达谱的改变<...

<table><tbody><tr><td>VWR&amp;#174; 微型圆形盖玻片，1 号</td><td>工具</td><td>VWR international</td><td>48380-068</td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸氢溴酸盐</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>来自 Engelbreth-Holm-Swarm 小鼠肉瘤基底膜的层粘连蛋白</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Earle&amp;rsquo;s 平衡盐溶液 (EBSS) (1X)，液体</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>14155-063</td><td></td></tr><tr><td>最低必需培养基 (MEM) (1X)，液体，含 Earle&amp;rsquo;s 盐，不含 L-谷氨酰胺和酚红</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液，液体</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠溶液</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 溶液 1 M</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>N-2 补充剂 (100X)，液体</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>马血清，经热灭活</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>PAPAIN-022</td><td>试剂</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003178</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal&amp;#8482; 培养基 (1X)，无酚红液体</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>12348-017</td><td></td></tr><tr><td>B-27 无血清补充剂 (50X)，液体</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺-200 mM (100X)，液体</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>25030-149</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛</td><td>工具</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 多孔平底培养板，带盖，无菌</td><td>工具</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 六水合物</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21108</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 六水合物</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 游离酸</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4, AM 1 mM DMSO 溶液</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>F-14217</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic&amp;#174; F-127 20% DMSO 溶液</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>浸油 TYPE DF</td><td>显微镜</td><td>Cargill Labs</td><td>16242</td><td></td></tr><tr><td>适用于 25 mm 圆形盖玻片的开放式腔室，体积 100 &amp;mu;l</td><td>工具</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0362 (RC-21BDW)</td><td></td></tr><tr><td>Series 20 腔室用 P-2 平台，非加热型</td><td>工具</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0278 (P-2)</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres 羧基修饰微球，0.1 &amp;mu;m，黄绿色荧光 (505/515)，2% 固体含量</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>F8803</td><td></td></tr></tbody></table>

测量星形胶质细胞中近质膜及全细胞内钙动力学

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

大脑中含有胶质细胞。星形胶质细胞是一种胶质细胞，长期以来被认为仅为神经元提供被动的支持作用。然而，越来越多的证据表明，星形胶质细胞也可能通过与神经元的功能性相互作用，主动参与大脑功能的调控。然而，星形胶质细胞生物学中的许多基本方面仍存在争议、不明确和/或缺乏实验探索。其中一个重要的问题是星形胶质细胞内钙瞬变的动力学特性。这一问题具有重要意义，因为钙离子已被公认为重要的第二信使，且已有研究提出，星形胶质细胞内钙浓度的升高可能触发其释放神经递质。然而，目前尚无任何详细或令人满意的关于星形胶质细胞近质膜区域钙信号传导的描述。全内反射荧光（TIRF）显微镜是一种强大的工具，可用于分析活细胞质膜约100 nm范围内的生理相关信号事件。在此，我们使用TIRF显微镜，并描述如何几乎同时监测近质膜区域及细胞内全局钙动力学。对该方法的进一步优化和系统性应用，有望揭示星形胶质细胞钙信号传导的精确细节。深入理解星形胶质细胞钙动力学可能为阐明星形胶质细胞与神经元是否、如何、何时以及为何发生钙依赖性功能相互作用提供基础。

星形胶质细胞，钙信号，全内反射荧光显微镜，神经元，胶质细胞，第二信使，活细胞成像，质膜，钙瞬变，功能性相互作用

我们介绍了如何利用全内反射显微镜和落射荧光显微镜，在培养的星形胶质细胞中检测近膜区和全细胞内的钙离子动态变化。

大脑中含有胶质细胞。星形胶质细胞是一种胶质细胞，长期以来被认为仅为神经元提供被动的支持作用。然而，……

在本视频的第一部分，我们将演示如何制备星形胶质细胞与神经元的共培养体系。具体步骤包括：收集出生一天大鼠的多个海马组织，将其放入离心管中用胰蛋白酶消化，通过吹打进行细胞分离，然后将细胞接种到盖玻片上。第二部分将展示如何测量星形胶质细胞内的钙动力学变化，该过程涉及将Fluo-4钙离子荧光指示剂染料加载至星形胶质细胞中，利用落射荧光显微镜检测全细胞范围的钙动力学，以及利用全内反射荧光显微镜（TIRF显微镜）检测靠近细胞膜区域的钙动力学。通过自动且快速地切换 illumination，可几乎同时观察全局钙信号和靠近膜区域的钙信号。大家好，我是 Aji omi，来自加州大学洛杉矶分校生理学系 Budget COS 实验室的博士后研究员。今天我们将向您展示一种 astrocyte 突触部位的钙成像实验方法。在我们的实验室研究中，我们采用此方法研究骨细胞中近膜区域和全局的钙动力学。通过自动且快速地进行消除，我们可以分别解析全局钙信号和近膜钙信号。接下来，我将展示如何施加TP以引起星形胶质细胞内钙浓度的升高。最后，我将总结并讨论星形胶质细胞研究方法中的屏障问题。让我们开始学习。进行星形胶质细胞培养时，首先去除断头幼鼠头部的皮肤和颅骨。将脑组织置于含有冷解剖液的培养皿中，分离两个半球并去除脑膜。接着解剖海马体，并将海马体切成约1毫米×1毫米大小的组织块。在37摄氏度的Pappa溶液中消化11至13分钟。从培养箱中取出解剖后的组织。待组织块沉降后，小心地将其从丙烷消化液中移出，并加入5毫升海马体培养基以洗涤切碎的海马组织块。重复此步骤，最后用海马体培养基重悬。使用三个经火焰抛光且口径逐渐减小的移液管，将细胞吹打约五次。待细胞通过孔径为70微米的细胞筛后，向细胞筛中加入4毫升培养基。计数10微升悬液中的细胞。调整海马体培养基的体积，使细胞浓度为每毫升400,000个细胞。现在准备用于接种细胞悬液的盖玻片：将已过夜暴露于层粘连蛋白溶液的盖玻片中的层粘连蛋白吸除。在盖玻片干燥前，每张盖玻片接种200 µL细胞悬液。将盖玻片置于培养箱中孵育60分钟，使细胞贴壁。孵育结束后，每孔加入2 mL海马体培养基。第二天，吸除旧的海马体培养基以去除死亡细胞和碎片，并加入两毫升预热的新鲜海马体培养基。星形胶质细胞与神经元共培养的维持应在铺板后四天开始，每周两次，每次加入一毫升新鲜神经基础培养基。务必在通风的烧瓶中将培养基于培养箱内预孵育约30分钟，以平衡温度和二氧化碳。在研究星形胶质细胞之前，使用纳米荧光微球来优化TURF的激光角度会很有帮助。为此，先在培养皿中加入200微升水，再加入1微升100纳米荧光微球，混匀后通过落射荧光显微镜观察微球。接着，使用TURF显微镜观察这些微球。进行钙成像时，将培养物放入六孔板的一个孔中，孔内加入含有2.5 µM Fluo-4 AM和0.05% Pluronic F-127（DMSO中20%溶液）的2毫升海马记录缓冲液，室温孵育10至30分钟。注意用盖子遮盖孔板，避免荧光染料发生漂白。随后，移除Fluo-4 AM溶液，用海马记录缓冲液洗涤盖玻片三次。将洗涤后的盖玻片在室温下继续孵育30分钟。将盖玻片放入腔室中，用镜头清洁液清洁盖玻片的另一侧，并加入 200 µL 海马缓冲液。在物镜上滴加一滴浸油，然后将腔室置于显微镜载物台上。使用透射光观察细胞，进行调焦并观察细胞形态。接下来，使用单色光源的488纳米光照射细胞，并确定Fluo-4的荧光信号是否均匀且可检测。在星形胶质细胞中，采用落射照明（epi）和转盘式照明（turf）来测量星形胶质细胞内的钙离子。此处，通过落射照明观察荧光微球。除了产生背景荧光外，它们还表现出显著的布朗运动，并随着照明角度接近临界角，激光束在玻璃-水界面发生全反射。这种全内反射会产生一种称为隐逝场的电磁场。这会在折射率较低的细胞内形成约100纳米的穿透深度。您可在此样品表面的薄层中激发荧光信号。以下是采用全内反射照明与落射照明相比时观察到的荧光微球。当减小角度时，照明信噪比显著提高。激光束不会在表面反射，而是穿过盖玻片直接照射到荧光微珠上。您会看到大量背景荧光。现在我们增大角度。同样，背景噪声显著降低，你可以看到盖玻片表面附近的荧光微珠。这些图像显示了加载了Fluo-4的星形胶质细胞和神经元。星形胶质细胞是扁平细胞，具有细小的突起，而神经元具有圆形的胞体以及粗长的树突。星形胶质细胞和神经元均呈现健康状态，并成功加载了Flu-oh-four染料。通过落射荧光或共聚焦显微镜观察星形胶质细胞，有助于判断星形胶质细胞是否健康，以及钙离子指示剂是否已正确加载到星形胶质细胞中。在靠近盖玻片区域、被称为“足印”（footprint）的星形胶质细胞区域，可观察到TP刺激引起细胞膜附近的钙离子浓度升高。已知海马体星形胶质细胞表达纯粹的无反应性受体，当TP加入灌流液时，可引发全局性的钙离子释放。我们刚刚向您展示了如何制备海马区骨细胞培养物，以及如何全局和近质膜区域测量骨细胞的钙水平。进行此操作时，重要的是要记住优化激光角度，以确保在显微镜下获得最佳效果，可通过观察100毫米流速下的细胞行为来实现。同时记录全局钙信号与近膜钙水平，不仅能够提供钙信号的详细描述，还将为我们揭示星形胶质细胞中钙调节机制的新见解。我们还意识到，本文所述的方法也可用于其他可兴奋细胞中近膜区及全细胞内钙离子水平的检测。就此结束。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。

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科研

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Biology

生物学

近质膜和全球星形胶质细胞内钙动力学测量

本文描述了从分离的海马体制备急性脑切片的方法，以及在刺激Schaffer侧支的同时，对辐射层中的星形胶质细胞和神经元进行同步电生理记录的技术。同时演示了药理学分离星形胶质细胞钾离子和谷氨酸转运体电流的方法。...

急性海马脑片中突触激活的星形胶质细胞与神经元反应的双通道电生理记录

来源：Bannai, H., et. al., 利用膜靶向Ca2+指示剂解析培养细胞中的局部Ca2+信号。 J. Vis. Exp.

星形胶质细胞区室特异性动态的自发钙成像

本文介绍了一种用于诱导神经元稳态可塑性的方案改良方法，以研究星形胶质细胞G蛋白偶联受体的可塑性。该方法近期已被用于检测幼年小鼠星形胶质细胞I型代谢型谷氨酸受体（mGluRs）的变化，也可应用于测量成年小鼠组织中多种星形胶质细胞GPCR的表达上调或下调，可在原位（in situ）和在体（in...

通过调控神经元放电频率诱导星形胶质细胞受体的可塑性

星形胶质细胞内 Ca²⁺ 的特性与功能2+ 纹状体中的信号仍未能得到充分研究。本文描述了利用血清型2/5的腺相关病毒（AAV2/5）在纹状体星形胶质细胞中表达基因编码钙指示剂的方法，以及可靠地对钙信号进行成像的操作流程。2+ 纹状体星形胶质细胞内的信号 原位.

使用基因编码钙指示剂对成年小鼠纹状体星形胶质细胞中的细胞内 Ca2+ 信号进行成像

此处描述的AWESAM方案是快速、简便且经济地从其他脑细胞中分离培养小鼠星形胶质细胞的最佳方法。AWESAM星形胶质细胞表现出自发性Ca2+ 与星形胶质细胞相似的信号传导、形态及基因表达谱 体内.

培养 在体 内使用快速、简单且经济的AWESAM方案培养类小鼠星形胶质细胞

本文演示了以下实验方案：（1）新鲜分离完整的大脑微血管内皮“管状结构”；（2）在内皮依赖性超极化过程中，同步测量内皮细胞的钙离子浓度和膜电位。此外，这些方法允许将内皮细胞的钙信号和电学信号作为独立或交互的实验变量进行药理学调控。...

同时测量新鲜分离且完整的小鼠脑血管内皮细胞内的钙离子浓度和膜电位

本文介绍了一种用于神经元和胶质细胞中钙离子（Ca2+）成像的实验方案，可实现亚细胞水平上Ca2+信号的解析。该方法适用于所有能够表达基因编码Ca2+指示剂的细胞类型。...

局部钙信号的分离2+ 通过膜靶向Ca在培养细胞中的信号2+ 指示剂

本文介绍了一种体外活体成像方法，用于可视化小鼠星形胶质细胞中细胞器的细胞内运输以及质膜蛋白的转运过程。该方案还提供了一种图像分析方法，用于确定货物运输的路径和动力学特征。...

可视化与分析星形胶质细胞内细胞器及其他货物的胞内运输

本方案旨在提供一种方法 体外 和 体内 线粒体 Ca2+...

成像线粒体 Ca2+ 星形胶质细胞和神经元中利用基因编码Ca探针检测摄取2+ 指示剂（GECIs）

当前方法描述了一种用于高分辨率、亚区室钙成像的非比率测量法 体内 在 秀丽隐杆线虫 使用 readily available 遗传编码钙离子指示剂.

神经元钙处理的亚细胞成像 在体

本方案全面描述了一种可同时记录多个与记忆相关脑区中神经元和星形胶质细胞钙信号的方法，并展示了其在学习与记忆行为范式中的应用。...

一种双色光纤光度法用于记录学习与记忆行为过程中多个脑区的星形胶质细胞-神经元活动

学习使用全内反射和落射荧光显微镜测量星形胶质细胞近质膜和全局钙动力学的方法。该技术通过制备星形胶质细胞-神经元共培养物并加载Fluo-4钙指示剂染料，实现同时观察细胞内钙信号变化。

测量星形胶质细胞中近质膜及全细胞内钙动力学

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