近质膜和全球星形胶质细胞内钙动力学测量

我们描述了如何来衡量膜和全球培养的星形胶质细胞，利用全内反射和epifluorescence显微镜细胞内钙离子动力学附近。

在本视频的第一部分，我们将演示如何制备星形胶质细胞神经元共培养物。为此，将来自 P 1 大鼠的几只河马 Campi 收集到用丙烷消化的试管中，通过解离，然后接种在盖玻片上。第二部分将展示如何测量星形胶质细胞中的细胞内钙动力学，其中包括将流感 oh 四钙指示剂染料加载到星形胶质细胞中，并通过 epi 显微镜测量整体钙动力学，以及通过草坪显微镜测量近膜钙动力学。

通过自动快速地改变照明，几乎可以同时观察到全局钙和近膜钙。大家好，我是 Aji omi，来自加州大学洛杉矶分校生理学系 Budget COS 实验室的博士后研究员。今天我们将向您展示 asto 位点钙成像的程序。

我们在实验室研究中使用该程序，靠近膜和整体钙动力学作为骨细胞。通过自动快速地改变消除，我们可以分辨整体钙和近膜钙。几乎同时，我将展示我们如何应用 TP 来引起星形胶质细胞中的钙升高。

然后，我将总结和讨论研究星形胶质细胞方法的障碍。所以让我们来研究一下。要开始星形胶质细胞培养，请从被斩首的大鼠幼崽的头部去除皮肤和头骨。

将大脑放入装满冷解剖培养基的培养皿中，解剖两个半球并去除脑膜。接下来，剖析河马 campi。将河马 campi 切成大约 1 x 1 毫米的小块。

在 37 摄氏度的 Pappa 溶液中消化 11 至 13 分钟。从培养箱中取出解剖的组织。然后，一旦组织块沉淀下来，小心地将它们从丙烷消化中取出，并加入 5 毫升海马培养基来清洗切碎的河马 Campi 块。

重复此步骤，最后，复苏悬浮在海马培养基中。用三个火焰抛光逐渐变小的移液器将细胞迭代约五次。进食后，将细胞通过全尺寸为 70 微米的细胞过滤器，并向过滤器中加入 4 mL 培养基。

在 10 微升悬浮液中计数细胞。调整海马培养基的体积，使每毫升有 400， 000 个细胞。现在，通过从盖玻片中吸出已暴露于层压板溶液过夜的层压板来准备用于接种细胞悬液的盖玻片。

在盖板可以干燥之前，每个盖玻片上放置 200 微升细胞悬液。让它们在培养箱中附着 60 分钟。孵育后，每孔添加 2 mL 海马培养基。

第二天吸出旧的海马培养基以去除死细胞和碎片，并加入 2 毫升预先警告的新鲜海马。星形胶质细胞神经元 Co 培养物的培养基维持应在铺板后 4 天开始，并每周两次加入 1 毫升新鲜神经基础培养基。请务必在培养箱中将培养基在通风瓶中预孵育约 30 分钟，以平衡温度和二氧化碳。

在研究星形胶质细胞之前，观察纳米荧光珠以优化草皮的激光角度是有用的。为此，将 200 微升水放在培养皿上，加入 1 微升 100 纳米荧光珠，并通过落射荧光显微镜混合观察珠子。接下来，通过草皮显微镜观察珠子。

对于钙成像，将培养物置于六孔板上的孔中，该板装有 2 毫升海马记录缓冲液，含有 2.5 微摩尔流感 oh 4：00 AM 和 0.05%onic F1 27,20% 的 DMSO 溶液，并在室温下孵育 10 至 30 分钟，记得盖上板以避免漂白荧光。四、去除流感噢四溶液，用海马记录缓冲液清洗盖 Slips 三次。将清洗过的盖玻片在室温下孵育 30 分钟。

将盖玻片放入腔室中，用镜片清洁液清洁盖玻片的另一侧，并加入 200 微升海马缓冲液。在物镜上滴一小滴浸油，然后将腔室放在显微镜的载物台上。使用透射光聚焦观察细胞，看看细胞的外观。

接下来，用单色的 488 纳米照射细胞，并确定 flu oh four 的荧光信号是否均匀且可检测。在星形胶质细胞中，使用 epi 和 turf 照明测量星形胶质细胞中的钙。在这里，通过 epi 照明观察荧光珠。

除了产生背景荧光外，它们还显示显著的布朗运动作为照明角度。当激光接近临界角时，激光束从玻璃水界面完全反射。这种全内反射产生一个称为倏逝场的电磁场。

这在折射率较低的细胞中具有约 100 纳米的深度。您可以在标本表面的这一薄层中激发花瓣。以下是与 epi 相比，通过草坪照明观察到的荧光珠。

当您减小角度时，照明信噪比会显著增加。激光束在表面不反射，穿过盖玻片直接照射到荧光珠上。你可以看到很多背景荧光。

现在我们增加角度。同样，背景噪声显著降低，您可以在盖玻片表面附近看到荧光珠。这些图像显示了流感 oh 四个加载的星形胶质细胞和神经元。

星形胶质细胞是具有精细突起的扁平细胞，而神经元具有圆形细胞体和又粗又长的树突。星形胶质细胞和神经元看起来都很健康，并且都感染了流感。哦，四个正确。

通过落射或共聚焦显微镜观察星形胶质细胞有助于了解星形胶质细胞是否健康以及钙指示剂是否正确加载到星形胶质细胞中。在星形胶质细胞最靠近盖玻片区域（称为足迹）的区域，观察到 TP 会导致质膜附近的钙增加。众所周知，海马星形胶质细胞表达纯的无能受体，当应用于浴中时，TP 会导致整体钙释放。

我们刚刚向您展示了如何制备海马骨细胞培养物，以及如何测量整体和质膜附近骨细胞的钙水平。在执行此程序时，请务必记住优化激光角度，以确保在显微镜上实现此目的的最佳方法是观察 100 毫米流速的行为。同时记录整体钙和近膜钙水平不仅将为我们提供钙信号的详细描述，而且为我们提供星形胶质细胞中钙调节机制的新见解。

我们还想到，这里描述的方法可用于测量其他可激发未知兴奋区域中的近膜和整体细胞内钙水平。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。