Name: 从14日龄的幼苗组织原生质体的分离拟南芥 /em (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-17T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: 学习从14日龄拟南芥幼苗分离完整原生质体的方法。该方案使用酶解法消化细胞壁，结合蔗糖密度梯度纯化，可获得高活性原生质体并维持96小时以上，适用于植物细胞生物学研究。

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本工作由康奈尔大学农业实验站（CUAES）NYC-125433 哈奇基金以及授予 O.K.V. 的康奈尔大学启动基金资助。

第1部分. 植物培养用固体培养基的制备。
我们通常在添加了1%蔗糖和0.7%琼脂的浓缩MS（Murasige和Skoog）培养基上培养植物。该培养基含有维持植物健康所需的所有必要成分。
配制1L MS培养基，pH 5.7
<ol>
	<li>在1.5–2.0 L的可高压灭菌瓶中，将2.15 g MS粉末加入800 ml水中。</li>
	<li>将搅拌子放入瓶中，并在搅拌板上搅拌使MS粉末溶解。</li>
	<li>在搅拌过程中，逐滴加入1N KOH，调节MS培养基的pH至5.7。</li>
	<li>加入10 g蔗糖，继续搅拌。</li>
	<li>加入7 g琼脂*。</li>
	<li>将配制好的培养基定容至1000 ml，并通过高压灭菌进行灭菌*。</li>
	<li>将高压灭菌后的培养基置于搅拌板上，在搅拌条件下冷却，以防止琼脂在瓶底沉淀。将培养基冷却至约60 °C*。</li>
	<li>倒入100 mm的培养皿中。将培养皿保存在4 °C条件下。</li>
</ol>
*提示 1：不要试图溶解琼脂。它将在灭菌过程中溶解。 
*提示 2：灭菌时将搅拌子保留在瓶中，后续步骤会用到。 
*提示 3：如果您的手能够握住已灭菌的瓶子持续 10 秒，说明培养基已充分冷却，可以开始倒平板。
第2部分. 植物材料与生长条件。
<ol>
	<li>对拟南芥（Arabidopsis thaliana）种子进行灭菌
	<ol>
		<li>取100 mg种子放入微量离心管中，加入1 ml 70%乙醇，充分混匀，孵育2分钟。离心沉淀种子，吸除上清液。</li>
		<li>加入1 ml含0.1% Tween-20的1.8%次氯酸钠溶液*，混匀10分钟。离心沉淀种子，吸除漂白液。</li>
		<li>此步骤需在超净工作台内操作。向种子中加入1 ml无菌水，充分混匀。离心沉淀后吸除水分。重复此步骤5次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将种子均匀铺种于步骤1中制备的培养皿上（每皿约100粒种子）。</li>
	<li>将接种后的培养皿置于4 °C黑暗条件下处理24–48小时，以进行春化处理。</li>
	<li>将培养皿转移至生长室中，在8小时光照/16小时黑暗的光周期条件下培养14天，光照强度为250 μmol m-2s-1，昼夜温度设置为23/19 °C，相对湿度保持在75%。</li>
</ol>
*提示1：漂白剂溶液通过稀释家用Clorox（含6%次氯酸钠）制备，并加入Tween-20至终浓度为0.1%。
第3部分. 从原生质体的分离 拟南芥 幼苗
<ol>
	<li>用新的剃须刀片将14天大的幼苗2 g在15 ml滤膜灭菌的TVL溶液中切碎。我们在无菌一次性培养皿中切碎植物材料。</li>
	<li>将切碎的组织转移至200 ml烧杯中，加入20 ml滤膜灭菌的酶解溶液，轻轻摇动烧杯使组织与酶解溶液混合，用封口膜和铝箔覆盖。</li>
	<li>在室温避光条件下以35 rpm振荡植物组织16–18小时。</li>
	<li>用预先用W5溶液润湿的八层纱布过滤，将释放的原生质体收集至50 ml Falcon离心管中。</li>
	<li>用15 ml W5溶液冲洗纱布，再次过滤原生质体。</li>
	<li>小心地在原生质体上层加入10 ml W5溶液，避免扰动蔗糖梯度；在100 g下离心7分钟。</li>
	<li>收集位于酶解溶液与W5溶液界面处的10 ml原生质体（图1B），转移至新的50 ml Falcon离心管中。</li>
	<li>加入15 ml W5溶液，在60 g下离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用15 ml W5溶液重悬原生质体以彻底去除酶解溶液，在60 g下离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀的原生质体重悬于1–3 ml W5溶液中。</li>
	<li>使用血细胞计数板进行细胞计数，评估原生质体产量。</li>
</ol>
第4部分. 试剂：
TVL：0.3 M 山梨醇；50 mM CaCl2，过滤除菌后于 -20 °C 保存。
酶溶液：0.5 M 蔗糖，10 mM MES-KOH [pH 5.7]，20 mM CaCl2，40 mM KCl，1% 纤维素酶（Onozuka R-10），1% 果胶酶（Macerozyme R10）。过滤除菌后新鲜使用。
W5 溶液：0.1% (w/v) 葡萄糖，0.08% (w/v) KCl，0.9% (w/v) NaCl，1.84% (w/v) CaCl2，2 mM MES-KOH pH 5.7。过滤除菌后室温保存。
第5部分：代表性结果：
采用第1和第2部分所述的拟南芥培养条件，可获得健康幼苗，适用于原生质体的分离（图1A）。通过蔗糖密度梯度离心法纯化原生质体，并在W5溶液与酶解液的界面处收集（图1B）。采用第3部分所述的原生质体分离方法，通常可从1克新鲜幼苗中收获5-10 × 106个完整原生质体（图1C）。
<img alt="叶绿素提取实验；培养皿、离心管、显微细胞结构。" src="/files/ftp_upload/1149/1149fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 拟南芥幼苗原生质体的分离。A，收集14天大的拟南芥幼苗组织，并通过改良的（Chen 和 Halkier，2000）方法将其转化为原生质体。B，通过蔗糖密度梯度离心纯化原生质体，并在酶溶液与W5缓冲液的界面处收集（白色箭头）。C，原生质体的明场显微镜观察。显微照片使用与Zeiss Axioscope 2 plus显微镜连接的冷却CCD相机拍摄。

<ol><li>Cocking, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+the+Isolation+of+Plant+Protoplasts+and+Vacuoles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles.</a> Nature. 187, 962-963 (1960).</li>
<li>Chen, S., Halkier, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+glucosinolate+uptake+by+leaf+protoplasts+of+Brassica+napus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of glucosinolate uptake by leaf protoplasts of Brassica napus.</a> J Biol Chem. 275, 22955-22960 (2000).</li>
<li>Robert, S., Zouhar, J., Carter, C., Raikhel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+intact+vacuoles+from+Arabidopsis+rosette+leaf-derived+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of intact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf-derived protoplasts.</a> Nat. Protocols. 2, 259-262 (2007).</li>
<li>Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%3A+a+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat Protoc. 2, 1565-1572 (2007).</li>
<li>Zhai, Z., Sooksa-nguan, T., Vatamaniuk, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+RNAi+as+a+reverse+genetic+approach+for+gene+functional+analysis+in+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Phys%22%5BJournal%5D)">Establishing RNAi as a reverse genetic approach for gene functional analysis in protoplasts.</a> Plant Phys. 149, 642-652 (2009).</li>
</ol>

描述该植物基因功能分析方法的临时专利已于2008年6月提交至康奈尔技术企业与商业化中心（CCTEC）。案卷号50341/015001：Vatamaniuk, O.K. 和 Zhai, Z. 植物基因快速功能分析方法。

为了获得高产量的完整原生质体，必须从健康的植株开始实验。用于分离原生质体的溶液需经过滤除菌。请注意，原生质体十分脆弱，因此在操作过程中切勿剧烈混合、吹打或涡旋，以免将其破坏。应通过缓慢旋转或轻弹离心管的方式温和混匀原生质体。本方法所获得的完整原生质体至少可在 96 小时内保持活性。因此，这些原生质体可用于研究多种细胞过程，例如蛋白质的亚细胞定位、完整细胞器的分离与分析，以及利用双链 RNA 干扰（RNAi）实现靶向基因失活等3-5。

<table><tbody><tr><td>MS基本盐混合物（Murashige和Skoog）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（100×15 mm）</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>82-4001</td><td></td></tr><tr><td>纤维素酶（Onozuka R&amp;#8208;10）</td><td>Research Products International Corp.</td><td>C32200</td><td></td></tr><tr><td>离析酶（Macerozyme R10）</td><td>Research Products International Corp.</td><td>M22010</td><td></td></tr><tr><td>纱布擦拭巾</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-665-29</td><td></td></tr><tr><td>实验室旋转仪（LabRotator）</td><td>Fisher Scientific</td><td>1167152Q</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X&amp;#8208;15R 离心机</td><td>VWR international</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>Axioskop 2 Plus 显微镜</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

从14天龄的arabidopsis thaliana幼苗组织中分离原生质体

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

原生质体是通过酶解法去除细胞壁后的植物细胞。从不同植物组织中分离原生质体的方法早在40多年前即有报道。1并已被用于研究多种细胞过程，例如蛋白质的亚细胞定位、完整细胞器的分离，以及通过双链RNA干扰（RNAi）实现靶向基因失活2-5. 大多数原生质体分离方案使用成熟拟南芥的叶片组织（例如，35天大的植株）2-4. 我们通过采用14天大的拟南芥幼苗改进了现有方案。在此过程中，1克14天大的幼苗可产生5 × 106-107至少能保持完整的原生质体时间为96小时。从幼苗中获得的原生质体产量与从成熟拟南芥叶片中制备的产量相当，但与成熟植株所需的35-36天相比，幼苗原生质体的分离可在15天内完成。这减少了使用成熟植株分离原生质体所需的时间和生长室空间，同时加快了需要完整原生质体的后续研究进程。

本视频展示了一种从14天龄拟南芥幼苗组织中分离完整原生质体的方法。由于所分离的原生质体至少可保持完整状态96小时，且来源于幼苗而非一个月大的成熟植株，因此该方法可加快需要完整原生质体的实验检测流程。

从14天龄的Arabidopsis thaliana幼苗组织中分离原生质体

原生质体是通过酶解法去除细胞壁的植物细胞。从不同植物组织中分离原生质体的技术最早……

该实验程序从第14天开始，将拟南芥种子接种于MS琼脂培养基上。种子萌发后，收集幼苗并进行切片。随后，植物材料在酶解液中消化，以降解细胞壁。将所得混合物通过纱布过滤，以分离原生质体与其他植物材料。收集到的原生质体通过在蔗糖密度梯度中与W五溶液分层进一步纯化。原生质体在酶液与W五溶液的界面处富集。在实验前对其进行收集和清洗。大家好，我是来自康奈尔大学作物与土壤科学系Lina Wauk实验室的Jang Ja。今天我们将向您展示一种从14天大的aro Ana TH中分离完整显影照片的操作流程。我们在实验室中采用此实验步骤来研究目的蛋白的亚细胞定位，以分离完整的细胞器，并利用双链RNA干扰技术对基因进行功能分析。现在我们开始操作。首先准备添加了1%蔗糖和0.7%琼脂的0.5倍MS培养基平板，每升培养基配制一份。称取 2.15 克 MS 粉末。将其加入含有磁力搅拌子的 1.5 升可高压灭菌瓶中的 800 毫升水中，并在搅拌板上搅拌以溶解粉末。逐滴加入 1 N 氢氧化钾溶液，调节 pH 至 5.7。继续搅拌，并加入10克蔗糖。接着加入7克琼脂，琼脂此时不会溶解，但在后续灭菌过程中会溶解。最后，将体积定容至1000毫升。将MS培养基在121摄氏度下高压灭菌20分钟。灭菌后将搅拌子保留在瓶中，然后将培养基置于搅拌台上搅拌，使其冷却至约60摄氏度。冷却过程中持续搅拌可防止琼脂在瓶底沉淀。若手能在瓶壁上停留10秒而不觉过烫，则表明培养基已充分冷却，可以倒平板。将培养基移至超净工作台，倒入150 mm × 15 mm的培养皿中。每板90毫升。将培养板置于4°C保存。现在培养板中的植株已生长，植株已准备就绪。让我们准备拟南芥种子。通过将拟南芥种子进行灭菌处理，以开始在培养皿上培养植株。取相当于50 µL体积的种子，放入一个Eppendorf微量离心管中。首先用乙醇进行消毒，加入1毫升70%乙醇并混匀。室温下孵育2分钟，期间种子会逐渐沉淀。用移液器尽可能吸除乙醇，随后用次氯酸钠溶液进行二次消毒，加入1毫升含Tween的次氯酸钠溶液，每2至3分钟涡旋混匀一次，持续10分钟。为便于去除次氯酸钠溶液，将种子快速离心，尽可能吸除溶液。最后的灭菌步骤在超净工作台中进行。向种子中加入一毫升无菌水并充分混匀。将种子短暂离心，吸去上清液，并重复此水洗步骤四次。种子消毒完成后，将其均匀铺在MS平板上。播种后，将接种好的培养皿置于4°C黑暗条件下处理24小时，以进行春化。经过24小时的低温处理后，将材料转移至生长环境，继续培养14天。在8小时光照/16小时黑暗的光周期条件下，培养14天的幼苗即可用于后续收获。现在幼苗已生长两周，是时候在超净工作台中制备原生质体了。使用新的剃须刀片在培养皿中将两克幼苗切碎，并放入15毫升经滤膜灭菌的TVL溶液中。接着，将切碎的组织转移至用铝箔包裹的200毫升烧杯中。加入 20 毫升 freshly prepared filter sterilized 酶溶液以降解植物细胞壁。轻轻摇动烧杯使混合均匀，并用生物膜和铝箔覆盖，使组织避光。随后在室温下将植物组织在酶溶液中振荡处理 16 小时。酶解液孵育结束后，将混合物通过预先用W5溶液润湿的八层纱布过滤，收集释放的原生质体至一个50毫升离心管中，并用10毫升W5溶液缓慢洗涤纱布以回收残留的原生质体。此时原生质体已收集在离心管中。小心地将5毫升WW5溶液铺加在原生质体上层。注意在加入 W five 溶液时不要破坏形成的蔗糖梯度。接下来，在 100 G 条件下离心原生质体 7 分钟。原生质体会聚集在酶溶液与 W five 溶液的界面处。收集界面处 10 毫升液体。将收集的原生质体转移至新的50毫升Falcon离心管中，加入15毫升W5溶液。然后在60 ×g条件下离心5分钟。离心结束后，弃去上清液，并将原生质体重悬于15毫升W5溶液中。再次以 60 ×g 离心原生质体 5 分钟。离心后，弃去上清液，将沉淀的原生质体重悬于 1 至 2 毫升 W5 溶液中。最后，在显微镜下使用血细胞计数板通过细胞计数评估原生质体的产量。此处描述的培养方法可获得健康的拟南芥幼苗，适用于经酶解和密度梯度分离后获取原生质体。收获一克新鲜幼苗通常可得到 5 至 10 × 10⁶ 个完整原生质体。我们已经向您展示了如何从14天大的拟南芥幼苗顶部分离原生质体。进行此操作时，必须牢记：实验成功的关键在于植物的健康状态。因此，保持本方案中为网筛和MS培养基指定的适宜比例至关重要。每块平板的培养基。最后，请记住，Port Plus 非常脆弱。细胞取出后，操作时应小心轻柔地上下颠倒混匀，避免涡旋振荡，并谨慎进行上下操作。就到这里。感谢观看。祝您的实验顺利。

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从14日龄的幼苗组织原生质体的分离拟南芥</em

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