Name: 小鼠肾移植程序 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-10T00:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 48 s
Description: 学习小鼠肾移植手术技术，包括供体肾脏获取、血管吻合和膀胱重建等关键步骤。通过监测肌酐水平评估移植肾功能，为移植生物学和免疫排斥研究提供可靠的动物模型。

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本研究部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）R01 AI36532 项目对 GAH 的资助。我们衷心感谢 Tibor Nadasdy 博士在移植病理学方面提供的卓越支持，以及已故的 Charles G. Orosz 博士在启动本项研究工作过程中给予的宝贵指导和远见卓识。

供体器官获取（2）：
<ol>
 <li>使用65 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉供体；通过异氟烷（2-3%）维持麻醉状态。</li>
 <li>从胸骨至耻骨做正中切口进入供体腹腔，并将肠管向右侧牵拉以暴露左肾。</li>
 <li>使用8-0丝线结扎并切断肾上腺和睾丸血管，从而游离左肾。</li>
 <li>游离肾动脉和肾静脉汇合处上方的主动脉。</li>
 <li>游离肾动脉和肾静脉汇合处上方及下方的下腔静脉（IVC）。</li>
 <li>在肾动脉和肾静脉下方用8-0丝线结扎主动脉，以减少出血。</li>
 <li>从肾门开始游离左输尿管直至膀胱。</li>
 <li>通过向尾侧牵拉膀胱顶部，暴露输尿管膀胱连接部。</li>
 <li>切除包含左输尿管膀胱连接部的小块椭圆形膀胱组织，用于通过膀胱-膀胱吻合进行尿路重建。右侧输尿管不随膀胱一并切除。</li>
 <li>在肾动脉和肾静脉下方用8-0丝线结扎下腔静脉。</li>
 <li>在肾动脉和肾静脉上方结扎主动脉，并经肾下主动脉缓慢灌注0.2–0.4 ml冷的含肝素乳酸林格液，对移植物进行原位灌洗。</li>
 <li>在肾动脉和肾静脉上方用8-0丝线结扎下腔静脉。</li>
 <li>在下腔静脉汇合处横断肾静脉。</li>
 <li>在肾动脉下方约2 mm处斜行切断主动脉。</li>
 <li>将肾脏及其血管蒂连同附着于膀胱片的输尿管整块取出，置于冰上保存的乳酸林格液中。</li>
 <li>在麻醉状态下通过颈椎脱位处死供体小鼠。</li>
</ol>
受体移植（2）：
<ol>
 <li>以 65 mg/kg 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉受体小鼠，并通过异氟烷（2-3%）维持麻醉状态。</li>
 <li>行正中切口，用湿纱布覆盖肠管并小心将其向左侧牵开。</li>
 <li>结扎右侧输尿管、肾动脉和肾静脉，摘除右肾。</li>
 <li>结扎腰动脉分支后，用两个 4 mm 微血管夹仔细分离并交叉夹闭肾下主动脉和下腔静脉（IVC）。</li>
 <li>将一根 10-0 尼龙缝线穿过主动脉全层并牵拉，以单次切开（约血管直径的五分之一）形成椭圆形主动脉切口。</li>
 <li>用 30 号针头穿刺下腔静脉（IVC）后，使用显微剪适当延长，形成纵向静脉切口。</li>
 <li>用肝素化生理盐水冲洗主动脉和下腔静脉，清除管腔内血液或血凝块。</li>
 <li>将供体肾脏从冰中取出，置于小鼠右侧腹腔内。用冷生理盐水浸湿的纱布保持供体肾脏湿润。</li>
 <li>用供体主动脉袖口在受体主动脉切口的近端和远端顶点处各放置一根固定缝线。</li>
 <li>使用 2～3 根连续的 10-0 尼龙缝线在主动脉外侧，将供体主动脉袖口与受体主动脉切口的前壁行端-侧吻合。</li>
 <li>将供体肾脏移至受体左侧腹腔，重复上述操作，将供体主动脉袖口与受体主动脉切口的后壁进行吻合。</li>
 <li>在下腔静脉（IVC）内侧使用 4～5 根连续的 10-0 尼龙缝线，将供体肾静脉与受体下腔静脉后壁行端-侧吻合；随后在下腔静脉外侧使用 4～5 根连续缝线闭合下腔静脉前壁与供体肾静脉。</li>
 <li>静脉和动脉的吻合必须在 20 分钟内完成。</li>
 <li>吻合过程中多次用冷生理盐水冲洗移植肾。</li>
 <li>切开受体膀胱顶部，用电凝止血。</li>
 <li>在膀胱顶部做一小切口。</li>
 <li>使用两根 10-0 尼龙固定缝线，将供体的小膀胱补片与受体膀胱顶部吻合。吻合口每侧使用 8～10 针连续缝合。</li>
 <li>用连续的 4-0 无菌合成可吸收缝线（Vicryl）分两层关闭腹腔。</li>
 <li>术中通过间歇性静脉注射给予受体小鼠 0.4 ml 温生理盐水。</li>
</ol>
受体术后护理
<ol>
<li>关闭腹腔后，肌肉注射一次青霉素（500U/10g）（2）。</li>
<li>此外，受体动物在术后第0天和第1天接受0.05 mg/kg的丁丙诺啡肌肉注射以缓解疼痛。移植受体在术后饮用含有磺胺甲噁唑-三甲氧苄啶（sulfatrim）的水（100mg/kg），直至实验结束。</li>
<li>术后前24小时，小鼠置于温度可控的培养箱中饲养。</li>
<li>小鼠通常在手术后1小时内从麻醉中恢复，并可自由摄取常规食物和水。</li>
<li>皮肤缝线于术后2周拆除。</li>
</ol>
受体肾切除术
<ol>
<li>在肾移植术后4～7天，通过腹腔注射65 mg/kg戊巴比妥麻醉受体动物；使用异氟烷（2-3%）维持麻醉。</li>
<li>通过腹部正中切口打开腹腔。</li>
<li>用生理盐水浸湿的纱布覆盖肠道，并小心将其向右侧牵拉。</li>
<li>结扎左侧输尿管、肾静脉和肾动脉后，切除左肾。</li>
<li>使用连续缝合的4-0合成可吸收缝线（Vicryl）分两层关闭腹腔。</li>
</ol>
全血肌酐测定
<ol>
<li>每周至每两周进行一次少于 0.2 cc 的采血，可选择在无麻醉条件下经下颌下途径采血，或在异氟烷麻醉下经眼后途径采血。</li>
<li>使用 I-Stat 便携式临床分析仪（Heska Corp.，科罗拉多州福特柯林斯）测定全血肌酐的定量水平。</li>
<li>将常规单位（mg/dl）乘以 88.4，换算为国际单位制的微摩尔/升（µmol/L）。</li>
</ol>

<ol><li>Russell, P. S., Chase, C. M., Colvin, R. B., Plate, J. M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+transplants+in+mice.+An+analysis+of+the+immune+status+of+mice+bearing+long-term%2C+H-2+incompatible+transplants%5BTitle%5D)+AND+%22JExpMed%22%5BJournal%5D)">Kidney transplants in mice. An analysis of the immune status of mice bearing long-term, H-2 incompatible transplants.</a> JExpMed. 147, 1449-1468 (1978).</li>
<li>Zhang, Z., Schlachta, C., Duff, J., Stiller, C., Grant, D., Zhong, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+techniques+for+kidney+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Improved techniques for kidney transplantation in mice.</a> Microsurgery. 16 (2), 103-109 (1995).</li>
</ol>

动物实验严格按照俄亥俄州立大学动物护理和使用委员会（IACUC）制定的指南和规定进行。

我们已在小鼠中完成了约1200例肾移植手术，技术成功率达到&gt;90%。与心脏移植相比，肾移植的成功率通常较低。然而，我们实验室一直保持较高的肾移植成功率（&gt;90%）。成功的关键在于减少供体肾脏和受体的再灌注损伤，并在整个手术过程及术后最大限度地减少出血和血栓形成。以下因素可能最为重要：（a）通过细致轻柔的操作，尽可能减少受体在手术期间的出血；（b）在供体肾脏准备和受体移植过程中，尽量缩短热缺血时间和交叉阻断时间；（c）使用较小的供体膀胱瓣，以防止术后发生坏死、血供不足及膀胱漏液；（d）延迟切除受体原生肾脏，直至移植后4～7天，以使移植肾在术后有足够时间恢复功能；（e）在主动脉外进行吻合（供体主动脉袖与受体主动脉前壁之间，以及供体主动脉袖与受体主动脉后壁之间），以降低血栓形成的发生率；（f）术后至少24小时内保持受体小鼠体温恒定；（g）术后给予受体小鼠抗生素，以预防潜在感染。
在本方案中，我们使用10-0缝线代替11-0缝线，且不影响存活率。尽管11-0缝线是理想选择，并被许多移植实验室采用，但我们认为，只要上述因素得到良好控制，10-0缝线在肾移植中同样足够适用。...

<table><tbody><tr><td>i-STAT</td><td>其他</td><td>HESKA</td><td>Cat 5101</td><td></td></tr><tr><td>i-STAT 试剂盒</td><td>其他</td><td>HESKA</td><td>CAT 5110-CREA</td><td></td></tr><tr><td>复方磺胺甲噁唑</td><td>其他</td><td>Actavis</td><td>R02109</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>其他</td><td>NOVAPLUS</td><td>CA-0474</td><td></td></tr><tr><td>10-0 缝合线</td><td>手术</td><td>Sharpoint</td><td>AK0100</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠肾移植手术步骤

Murine Renal Transplantation Procedure

小鼠肾脏原位移植是一种技术上具有挑战性的手术。尽管Russell等人在30多年前首次完成了小鼠肾移植(1)，随后Zhang等人对其进行了改进(2)，但目前全球掌握该技术的研究人员仍寥寥无几。在我们的实验室中，已成功实施了1200例原位肾移植手术，术后存活率超过&gt;90%。手术成功的关键在于严格控制手术期间及移植后的再灌注损伤、出血和血栓形成，并在吻合过程中使用10-0缝线而非11-0缝线。
术后对受体动物的护理和治疗对于移植成功及评估至关重要。所有肾移植受体均在术后立即接受青霉素注射，并持续在饮水中添加磺胺甲噁唑-甲氧苄啶（sulfatrim）以提供抗生素支持。每日评估动物整体健康状况，并常规使用便携式I-STAT仪器进行全血肌酐分析，以评估移植物功能。

小鼠肾移植是一种技术上具有挑战性的手术，需要精细的术后护理和治疗才能成功。

小鼠肾脏原位移植是一项技术上具有挑战性的手术。尽管最早的小鼠肾移植手术由 Russell 完成……

小鼠肾移植手术首先从供体器官获取开始，即从供体小鼠体内摘除左肾并置于冰上保存。随后摘除受体小鼠的右肾，为植入供体肾腾出空间。接着将供体肾从冰上取出，并移植到受体小鼠体内。小鼠在剩余的天然肾脏被切除前有四天的恢复期。七天后，使用i-STAT便携式临床分析仪监测肌酐水平，以评估移植物功能。您好，我是来自俄亥俄州立大学移植外科系Greg Hadley博士实验室的Sarah Heimer。今天我们将向您展示小鼠肾移植手术的操作流程。您今天所看到的肾移植手术将由本实验室的资深专家神经外科医生 Jing Wing 操作完成。请在本实验室中使用该操作流程来研究移植排斥反应的免疫学事件，以及预防排斥反应发生的策略。现在开始操作。首先进行足部夹捏，以确认动物已完全麻醉。在无菌环境下使用灭菌器械，于麻醉小鼠腹部正中线从胸骨至耻骨做一纵向切口，将肠管向右侧横向推开，暴露左肾，以便进行供体肾脏灌注。在肾动脉和肾静脉的上方及下方，用TY480丝线分别环绕腹主动脉和下腔静脉并打结。通过肾下主动脉原位灌注冷肝素化乳酸林格液。使用8-0丝线结扎并切断肾上腺和睾丸血管以及少数腰动脉分支，以游离左肾。接着，游离主动脉与下腔静脉连接处，并分离左肾动脉和肾静脉；在肾动脉和肾静脉的上方及下方，分别用四根8-0丝线环绕结扎主动脉和下腔静脉。为减少出血，首先在肾血管下方结扎主动脉。然后从肾门至膀胱游离左侧输尿管。通过牵拉膀胱顶部，暴露输尿管与膀胱壁连接处。务必避开右侧输尿管，切除包含左侧输尿管膀胱连接部的小椭圆形膀胱组织片。该组织片将用于通过膀胱-膀胱吻合术进行尿路重建。随后，在肾动脉和肾静脉上方结扎腹主动脉。通过肾下主动脉，用冷肝素化乳酸林格液原位缓慢灌注肌腱。在肾动脉下方约两毫米处斜行切断主动脉。最后，将肾脏及其血管供应连同输尿管一并移除，输尿管仍附着于膀胱组织块上。肾脏应保存在冰上的乳酸林格液中，直至准备将其移植到受体动物体内；同时，在麻醉下通过颈椎脱位法处死供体小鼠。如先前所述，受体移植手术开始前需进行夹趾操作，以确认动物已完全麻醉。手术开始时，做正中切口，用湿纱布覆盖肠道，并小心将其向左侧牵拉。为了成功完成此例肾移植手术，必须在供体主动脉袖与受体主动脉之间进行吻合。将供体肾静脉与受体下腔静脉吻合，并将供体膀胱补片与受体膀胱进行结扎。右侧输尿管、肾动脉和肾静脉。结扎后切除肾脏。仔细分离腰动脉分支，并使用两个4毫米的微血管夹分别夹闭肾下主动脉和下腔静脉。将一根10-0尼龙缝线穿过主动脉全层并牵拉，沿血管直径约五分之一处做单一切口，形成椭圆形主动脉切口。接下来，用30号针头穿刺下腔静脉，做一纵向静脉切口，并使用显微剪适当延长。用肝素化生理盐水冲洗主动脉和下腔静脉，以清除管腔内的血液或血凝块。将供体肾脏从冰上取出，置于小鼠的右侧腰部区域。将供体主动脉袖的近端和远端与受体主动脉切口的顶端分别放置两针固定缝线。使用2至3根连续的10-0尼龙缝线，在主动脉外侧对供体主动脉袖与受体主动脉切口的前壁进行端侧吻合。随后将供体肾脏移植物翻转至受体左侧腹 flank 区域。在供体主动脉套管与受体主动脉后壁之间重复先前的操作步骤。需要注意的是，静脉和动脉的吻合均必须在20分钟内完成。在吻合过程中，移植物还应多次用冷生理盐水冲洗。使用4到5根连续的10-0尼龙缝线，在下腔静脉内侧对供体肾静脉与受体下腔静脉后壁进行端侧吻合。用4到5根连续缝线在下腔静脉外侧闭合下腔静脉前壁和供体肾静脉。下一步是切开受体膀胱的顶部。使用电灼止血。完成吻合后，在膀胱顶部做一小切口，放置两根10-0尼龙固定缝线，将供体的小膀胱补片与受体的膀胱顶部进行吻合，每侧使用8至10针连续缝合完成吻合口缝合。最后用连续的4-0无菌合成可吸收薇乔缝线分两层关闭腹腔。术后护理从给予一次肌肉注射青霉素开始。移植受体在术后第0天和第1天还需按每千克体重0.05毫克的剂量接受肌肉注射布托啡诺以缓解疼痛，同时持续供应含有磺胺甲噁唑-甲氧苄啶的饮水。术后前24小时将小鼠置于温度可控的孵育箱中饲养。皮肤缝线在手术后两周拆除。切除剩余的自体肾脏至关重要，以便通过血清肌酐水平监测肾移植功能的变化。该操作通常在供体肾脏移植后的4至7天内进行，其主要步骤与从供体小鼠摘除肾脏时所采用的步骤相同。使用异氟烷麻醉以镇静宿主动物，以便采集血样。采用眶后静脉丛定量全血肌酐水平作为移植物功能的评估指标，并使用i-STAT便携式临床分析仪进行测定。将常规单位乘以88.4即可转换为国际单位（SI单位）。肌酐浓度以微摩尔每升表示。动物通常在手术后两到三个小时恢复，并在切除剩余的天然肾脏后表现出正常的小鼠行为。动物的存活依赖于肾移植物功能，可通过每天对动物整体健康状况和肌酐水平的检查来评估。使用便携式 i-STAT 临床分析仪测量全血作为参考。非移植的正常小鼠肌酐水平接近 20 微摩尔。当小鼠出现疾病症状且肌酐水平升高至接近 100 微摩尔时，考虑存在肾移植功能障碍。我们刚刚向您展示了小鼠肾移植的操作步骤。尽管该手术在技术上具有挑战性，但我们的实验室在实施该手术方面已取得了很大成功。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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