活体成像观察果蝇复眼原基盘中胶质细胞的迁移

我们通过夹住幼虫的后端和前端，然后将镊子向相反方向拉开来解剖幼虫。使用超细剪刀修剪掉多余的组织。这将暴露出幼虫脑部的两个脑半球及眼成虫盘。

腹神经索和口钩。将幼虫的复眼-脑复合体转移至培养室中。我们分离脑叶与视柄，以观察野生型复眼成虫盘内胶质细胞的迁移过程。

为了观察突变体视神经茎中停滞的胶质细胞，我们保留与视神经茎相连的脑叶。我是来自不列颠哥伦比亚大学动物学系Vanessa Als实验室的Patrick Cafferty。你好，我是Rin。

她还从今天开始，我们将向您展示一种在发育中的黑腹果蝇眼睛中观察迁移胶质细胞的方法。我们在实验室中使用该方法来研究胶质细胞的发育。那么，让我们开始吧。

实验开始前一周，将果蝇进行交配，以获得在胶质细胞特异性启动子调控下表达GFP的幼虫。本实验旨在观察在胶质细胞中表达并带有核定位序列标记的GFP。使用反向极性启动子时，需至少提前一天制备18毫米圆形盖玻片：将其浸入1%多聚赖氨酸溶液中10分钟，随后在实验前一天晚上于空气中过夜晾干。

在实验当天，将链式磁力培养室的各组件在70%乙醇中浸泡过夜以进行清洁。使用无菌技术配制培养基。在10毫升Schneider昆虫培养基中加入胎牛血清、青霉素-链霉素溶液和胰岛素。

将洁净的磁性培养腔置于细胞培养罩中晾干，随后用配制好的培养基冲洗以去除残留的乙醇。完成上述准备工作后，即可开始进行黑腹果蝇眼脑复合体的解剖。开始此操作时，从果蝇培养管壁上选取一只三龄游走期幼虫，将其放入盛有预冷培养基的培养皿中，并将培养皿置于冰上静置数分钟以进一步冷却幼虫。

建议使幼虫减缓肠道蠕动，以便于解剖。接下来，将冷却后的幼虫置于涂有萨兰的培养皿中的一滴培养基内，在解剖显微镜下操作，用一对 Dumont 精细镊子牢固夹住幼虫。从后端起约三分之一处，等待幼虫从前端伸出其口钩，当口钩完全伸展时，用第二对镊子夹住口钩。

解剖幼虫时，缓慢地将两对镊子向相反方向拉开。眼脑复合体连同唾液腺、脂肪体和成虫盘组织将从幼虫体部分离出来。切勿过快拉扯口钩，否则会导致其从脑复合体上撕脱。

使用超细剪刀去除唾液腺、脂肪体和成虫盘，此时脑的两个半球以及眼盘将附着于腹神经索和口钩上。接下来，将一个18毫米的盖玻片放置在载玻片上，使盖玻片的一边悬于载玻片的边缘外。为便于后续拾取盖玻片，需在盖玻片上滴加一滴培养基。

用镊子夹住口钩，将iBrain复合体转移到盖玻片上的培养基中。待眼脑复合体转移至盖玻片后，使用精细解剖剪将口钩从眼脑复合体上剪除。

去除口钩对于活体成像至关重要，因为口钩在培养基中会持续收缩，导致显微镜观察过程中组织移动。若要观察视神经束内的胶质细胞（GL），需保持脑部视神经束和眼成虫盘的完整。若要观察眼成虫盘内的胶质细胞迁移，则需小心切断连接脑与眼成虫盘的细薄组织——视柄，并将脑组织推离或弃去。

最后，用镊子夹起盖玻片，用永久性记号笔在盖玻片下方围绕目标组织画一个圆圈。该圆圈将有助于后续显微镜观察时定位组织。现在，眼成虫盘已准备好用于磁性培养腔室中的封片。

将眼成虫盘安装到磁力培养腔中时，用镊子夹住盖玻片悬垂的边缘，将盖玻片转移至链式磁力腔的底板上，注意不要扰动培养中的组织。接着，将硅胶O型环放置在链式腔主体上。然后缓慢地将主体安装到底板上方。

向培养室中加入培养基。加入培养基时速度不宜过快，以免扰动组织，以利于盖子下方的气体交换。不要将培养室完全装满，轻轻将透明盖子放在虚线所示的培养室上方。

为了观察迁移的胶质细胞，将培养腔室置于共聚焦或荧光显微镜的载物台上。使用盖玻片上的圆圈作为参考，在低倍镜下定位样品。使用40倍物镜对样品进行聚焦。

正确操作时，让组织自然沉降，并在三到四小时内每10至15分钟拍摄一次眼原基或视神经索的图像。该方案将获得一系列图像，显示表达GFP标记的胶质细胞从视神经索迁移至眼成虫盘的过程。尽管对野生型眼成虫盘进行60分钟的活体成像已足以观察到胶质细胞核位置的变化，但在某个对胶质细胞迁移至关重要的基因发生突变的情况下，胶质细胞核则完全无法从视神经索中迁移出去。

我们已将眼脑复合体培养长达240分钟，之后开始观察到培养组织出现退化现象。在240分钟时间点之后，我们开始在培养的眼脑复合体周围的培养基中观察到GFP阳性细胞。此外，GFP会在组织内广泛分布的弥散斑点中积聚，提示组织完整性发生破坏。

我们刚刚向您展示了如何培养用于研究胶质细胞迁移的成虫盘。感谢观看，祝您的实验顺利成功。