Name: 量化老化细胞生长的酵母年谱跨度 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-06T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: 了解酵母时序寿命的高通量定量方法，通过BioScreen CMBR系统测量光密度生成生长曲线，评估静止期细胞活力随时间的变化。该方法为真核细胞衰老机制研究提供可靠数据。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目1R21AG031965-01A1支持。M. K. 是艾里森衰老医学基金会新学者。

第1部分：衰老培养物的制备
<ol>
	<li>从冻存菌种中挑取目标菌株，在YEPD琼脂平板（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%琼脂、2%葡萄糖）上划线接种。</li>
	<li>将平板在30 °C下培养48小时，或直至单菌落出现。</li>
	<li>挑取单菌落，接种于试管中含5 mL YEPD液体培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖）中。</li>
	<li>在30 °C下振荡或使用滚筒摇床持续振荡培养过夜。</li>
	<li>取50 µL过夜培养物接种至5 mL合成完全（SC）培养基（表1）中。通常每种菌株制备三份SC培养物，以实现每种被测菌株寿命分析的三个生物学重复。</li>
	<li>在整个实验过程中（通常为2周或更长时间），将培养物置于30 °C并在滚筒摇床上持续振荡培养。</li>
</ol>
第二部分：采集存活率年龄点
在SC培养基中培养两天后，细胞应进入静止期，此时可采集第一个年龄时间点。此后，应每隔2-3天采集一次样本，持续至少两周。每个年龄时间点的采集步骤如下：
<ol>
	<li>通过向每个孔中加入 145 µL YEPD，准备 Bioscreen 100 孔 Honeycomb 板以进行接种。务必至少留出一个孔仅含有 YEPD 而无细胞，用于后续数据分析。</li>
	<li>从培养箱中取出老化培养物。</li>
	<li>对第一个将要接种到 Honeycomb 板中的培养物进行短暂涡旋振荡，注意避免洒出任何培养液。</li>
	<li>吸取 5 µL 混合后的培养物，移入 Honeycomb 板的第一个孔中。每次移取 5 µL 前后，均需对每支试管口进行火焰灭菌。</li>
	<li>对每种老化培养物重复此操作，并准确记录各培养物对应的孔位。在整个实验过程中，每个后续时间点应使用相同的孔位。</li>
	<li>完成接种后，将培养物放回 30˚C 培养箱中继续培养。</li>
</ol>
第3部分：装载 Bioscreen C MBR 仪器
<ol>
	<li>打开培养箱盖子，暴露培养舱，并取下样品架的盖子。</li>
	<li>将新接种的Honeycomb板插入样品架中（如果只读取一块板，请使用左侧插槽）。</li>
	<li>重新盖上样品架盖子，并合上培养箱盖。</li>
	<li>检查传热液液面是否高于最低填充线。如果液位偏低，使用1000 µL移液器加入提供的传热液进行补充。</li>
	<li>使用Bioscreen软件“EZExperiment”设置以下参数，以获得适合酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的生长曲线：
	<ul>
		<li>样品数量：输入含有培养基的孔数或200</li>
		<li>滤光片：420-580nm，宽带</li>
		<li>温度：30°C</li>
		<li>实验时长：1天0小时0秒</li>
		<li>测量间隔：30分钟</li>
		<li>振荡：开启，连续振荡，高强度</li>
	</ul>
	</li>
	<li>点击“开始”以启动读数。</li>
</ol>
第4部分：数据分析
通常在两周内选取六个时间点进行检测，分别在第2、4、6、9、11和13天进行。根据实验设计和所测试的菌株不同，可能需要更频繁或更少地采集时间点，或超过两周的时间。每次采集时间点时，必须以相同的顺序加载Honeycomb板，确保每个衰老培养物在每次时间点都对应相同的孔位，这将大大简化数据分析过程。
<ol>
	<li>从 Bioscreen C MBR 仪器获取输出文件。软件“EZExperiment”会将 Bioscreen 数据输出为制表符分隔的文件，该文件可与 Microsoft Excel 及其他软件兼容。第一列显示实验过程中测量 OD 值的时间点，后续各列代表 Bioscreen Honeycomb 板中的每个孔（图 1）。</li>
	<li>删除每列中的第一个 OD 读数。该读数属于“噪声”。</li>
	<li>通过从每列所有 OD 值中减去仅含 YEPD 的孔的 OD 值来对数据进行归一化处理。此步骤可消除培养基本身的背景吸光度。</li>
	<li>绘制生长曲线。曲线将随细胞年龄而发生位移（图 2）。例如，将第 1 列（Honeycomb 板中的第 1 孔）在六个时间点的生长曲线绘制在一起，可观察到曲线随时间明显向右移动。</li>
	<li>根据第 2 天年龄点的生长动力学计算每个孔的倍增时间（δ）。用于计算倍增时间的公式为： 
	<img alt="半衰期计算公式，自然对数与光密度示意图，教育用途。" src="/files/ftp_upload/1156/equat.png" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程"> 
	其中 OD1 和 OD2 表示连续两次 OD 测量值，t1 和 t2 为两次测量之间的时间间隔。仅在 OD 值介于 0.2 至 0.5 之间时计算倍增时间。这些值的平均值即为该孔的倍增时间。大多数野生型酵母菌株的倍增时间应在 85 至 90 分钟之间。</li>
	<li>针对每个年龄点，计算其相对于初始年龄点（第 2 天）的生长曲线时间偏移（∆t）。一种简便方法是计算每个孔从初始年龄点到后续各年龄点达到 OD 0.3 所需时间的差值。特定孔达到 OD 0.3 的时间可通过线性回归方程计算，该方程对应于 OD=0.3 前后两个时间点之间 ln(OD) 随时间变化的关系。</li>
	<li>计算每个年龄点的存活比例，以生成存活曲线（图 3）。将初始年龄点（第 2 天）定义为 100% 存活率。对于每个后续年龄点，使用以下公式计算存活百分比： 
	<img alt="统计分析公式，敏感性指数计算，公式 Sn=1/2(Δtn/δn)×100。" height="115" src="/files/ftp_upload/1156/equat2.png" width="245" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="第二个方程"> 
	其中 sn 为存活百分比，∆tn 为时间偏移，δn 为倍增时间。</li>
	<li>通过将每个孔（或重复孔）的存活细胞比例（或百分比）对年龄作图，按需生成存活曲线（图 3B）。</li>
	<li>计算每个孔的存活积分（SI）。SI 定义为存活曲线下面积，可通过以下公式估算： 
	<img alt="静态平衡公式：SI=Σ(Sn-1+Sn)/2*(agen-age n-1)。数学方程示意图。" height="79" src="/files/ftp_upload/1156/equat3.png" width="400" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程 3"> 
	其中 agen 为年龄点（例如 2、4、6、9、11 和 13），sn 为该年龄点的存活值。</li>
	<li>根据 SI 和存活数据确定重复孔的统计参数。常用的统计参数包括每组生物学重复的均值、中位数和方差。可使用 t 检验或类似分析方法对不同实验组与对照组的 SI 进行成对比较。也可根据 4.8 中所述方法，基于平均后的生物学重复数据生成存活曲线。</li>
</ol>
第5部分：代表性结果
实验结束后，您将绘制出生存曲线，并完成足够的数据分析，以确定多种不同菌株或条件下的时序性衰老潜力。若操作正确，从Bioscreen C MBR仪器获得的生长曲线应与图2所示相似，所得生存曲线应与图3所示相似。通常情况下，在本实验所述条件下培养的野生型细胞，其中位时序寿命约为7天。不同菌株及某些条件下（例如在含0.05%葡萄糖的培养基中生长）的生存情况存在显著差异，其中位生存时间可超过30天。
<img alt="显示多个变量和时间间隔下原始数值数据的数据分析电子表格。" src="/files/ftp_upload/1156/1156fig1.png" data-altupdatedat="1787630408000"> 
图1. 来自 Bioscreen 程序“EZExperiment”的数据输出。A 列显示了吸光度读数的测量时间。后续各列代表接种了来自老化培养物细胞的 Honeycomb 板中的孔。
<img alt="吸光度随时间变化曲线；多日微生物生长情况；光密度测量。" src="/files/ftp_upload/1156/1156fig2.png" data-altupdatedat="1787630408000"> 
图2. 实验过程中单个生物学重复的生长曲线。随着时间推移，衰老培养物中的细胞活力下降，曲线呈现出明显的偏移。初始时间点（第2天）与后续时间点之间的时间间隔决定了该特定年龄下的细胞活力。
<img alt="存活力与年龄关系图；折线图；天数与存活力百分比数据分析。" src="/files/ftp_upload/1156/1156fig3a.png" data-altupdatedat="1787630408000"><img alt="不同菌株随时间变化的存活力比较图；折线图显示存活力百分比与年龄（天数）的关系。" src="/files/ftp_upload/1156/1156fig3b.png" data-altupdatedat="1787630408000"> 
图3. A) 使用图1中的生长出数据生成的生存曲线。第2天的时间点被设定为100%存活力。 B) 在同一实验中测试的两种菌株的最终生存曲线。这些生存曲线代表每种菌株三个生物学重复的平均存活力。误差线表示生物学重复内的标准偏差。生存曲线下方的阴影区域代表菌株1的生存积分（SI）。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">表1. 用于时序衰老研究的合成限定培养基（菌株背景 BY4743）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>浓度 (g/L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-葡萄糖</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>酵母氮源基础（-AA/AS）</td>
			<td>1.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>5.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>腺嘌呤</td>
			<td>0.04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-精氨酸</td>
			<td>0.02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-天冬氨酸</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-谷氨酸</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-组氨酸</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-亮氨酸</td>
			<td>0.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-赖氨酸</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-甲硫氨酸</td>
			<td>0.02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-苯丙氨酸</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-丝氨酸</td>
			<td>0.375</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-苏氨酸</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-色氨酸</td>
			<td>0.04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-酪氨酸</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-缬氨酸</td>
			<td>0.15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>尿嘧啶</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
注意：本配方针对二倍体 BY4743 菌株的营养缺陷型进行设计。氨基酸营养缺陷型应通过向完全合成培养基中添加 5 倍终浓度的相应氨基酸来补偿。

<ol><li>Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+aging+in+yeast%3A+the+means+to+the+end%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Replicative aging in yeast: the means to the end.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29(2008).</li>
<li>Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaeberlein%2C+M+%22Handbook+of+models+for+human+aging%22">Handbook of models for human aging</a>. Conn, P. M. , Elsevier Press. Boston. 109(2006).</li>
<li>Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae.</a> Aging Cell. 2 (2), 73(2003).</li>
<li>Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+high-throughput+quantitative+analysis+of+yeast+chronological+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63 (2), 113(2008).</li>
<li>Piper, P. W., Harris, N. L., MacLean, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preadaptation+to+efficient+respiratory+maintenance+is+essential+both+for+maximal+longevity+and+the+retention+of+replicative+potential+in+chronologically+ageing+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Preadaptation to efficient respiratory maintenance is essential both for maximal longevity and the retention of replicative potential in chronologically ageing yeast.</a> Mech Ageing Dev. 127 (9), 733(2006).</li>
<li>Fabrizio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+is+a+mediator+of+an+altruistic+aging+program+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Biol. 166 (7), 1055(2004).</li>
</ol>

本文所述的高通量时序性寿命测定法是一种高效、准确且精确量化大量菌株衰老潜能的方法。与通过计数菌落形成单位来确定存活率的经典方法（例如参见3）相比，该方法的主要进步在于采用摇床/培养箱/酶标仪联用设备（如Bioscreen C MBR仪器），在每个年龄时间点获取高分辨率的生长曲线。与低通量时序性寿命测定法直接比较表明，该方法可达到相当甚至更高的精确度，同时显著增加可分析样本的数量4。
上述方法适用于在衰老研究常用的培养条件下，筛选影响时间性寿命的遗传变异。然而，该方法也可轻松地适用于其他培养条件，例如预先适应呼吸性生长（甘油作为碳源）5、将细胞维持在水中而非耗尽的培养基中，或进行饮食限制相关研究4。此外，也可将其调整用于药物筛选，例如向衰老培养基中添加来自化合物库的不同化学物质，而非接种不同菌株。
本文所述方法在用于寿命测定的年龄时间点选择上也具有灵活性。如上所述，实验中的年龄时间点分别取在第2、4、6、9、11和13天。这些时间点适用于筛选...

<table><tbody><tr><td>胰蛋白胨</td><td>试剂</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>试剂</td><td>BD Biosciences</td><td>288620</td><td></td></tr><tr><td>琼脂粉</td><td>试剂</td><td>BD Biosciences</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>无氨基酸和氨基酸盐的酵母氮源基础</td><td>试剂</td><td>MidSci</td><td>J630-500G</td><td></td></tr><tr><td>氨基酸</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硫酸铵</td><td>试剂</td><td>Spectrum</td><td>AM185</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>试剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-10</td><td></td></tr><tr><td>Bioscreen C MBR 仪器</td><td>工具</td><td>Growth Curves USA</td><td>5101370</td><td></td></tr><tr><td>Bioscreen 100 孔蜂巢板</td><td>工具</td><td>Growth Curves USA</td><td>9502550</td><td></td></tr></tbody></table>

通过老化细胞的再生长定量酵母时序性寿命

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

出芽酵母Saccharomyces cerevisiae在衰老研究领域已被证明是一种重要的模式生物1. 酵母中的复制寿命和时序寿命是研究酵母衰老的两种公认范式。复制衰老定义为单个酵母母细胞在衰老前产生的子代细胞数量；时序衰老则由细胞在非分裂、类似静止状态下的存活时间长短来定义。2我们开发了一种用于定量测定细胞时序性寿命的高通量方法。该方法包括在特定培养基中，于振荡条件下和恒定温度下对细胞进行老化培养。在每一个时间点，从老化培养物中取出一部分细胞亚群，并接种至富含营养的生长培养基中。随后，使用 Bioscreen C MBR 仪器对该部分老化细胞亚群获得高分辨率的生长曲线。接着应用一种算法，根据每个时间点的生长动力学数据，确定各细胞亚群中活细胞的相对比例。与现有的其他时序性寿命检测方法相比，该方法所需时间和资源显著减少，同时保持了良好的可重复性和精确性。该检测方法的高通量特性将有助于开展大规模的遗传学和化学筛选，以发现新的寿命调控因子，并进一步在更复杂的生物体中进行验证。

酵母的时序性衰老是指细胞在静止期随着时间推移而丧失活力的现象。本文介绍一种用于定量测定酵母时序性寿命的高通量方法。

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）已被证明是衰老研究领域中一种重要的模式生物¹。其复制性衰老和……

将衰老培养物置于试管中，在30摄氏度下持续振荡培养。从每个衰老培养物中取细胞等分试样，接种至含有YEPD培养基的BioScreen蜂巢板的孔中。BioScreen CMBR仪器在24小时内孵育并振荡蜂巢板，同时测定每个孔的光密度。每30分钟可利用BioScreen输出的数据生成生长曲线，用于计算每种老化培养物的存活率。经过24小时孵育后，蜂巢板中各孔的细胞密度会因原始老化培养物的存活率不同而有所差异。大家好，我是华盛顿大学病理学系Matt Capline博士实验室的Chris Murakami。今天我们将向您展示一种利用衰老细胞的再生长来量化酵母时序性寿命的实验方法。在我们的实验室中，该方法被用于研究遗传因素和环境因素如何共同影响酵母的寿命。现在，让我们开始吧。为制备老化培养物，首先将酵母菌株从冷冻保藏菌种划线接种至YEPD琼脂平板，于30°C培养48小时，或直至单菌落出现。单菌落出现后，挑取单菌落并接种于5 mL YEPD液体培养基中。在试管中，于30摄氏度的滚筒摇床中培养过夜，以保持持续振荡。过夜培养后，取每种培养物50微升接种至5毫升合成完全培养基中。通常每种菌株制备三份SC培养物，以便对每种待测菌株的寿命分析进行三次生物学重复。整个实验过程中，将培养物置于30摄氏度的滚筒摇床上持续振荡培养，通常在培养两天后继续培养两周或更长时间。在SC培养基中，细胞应处于静止期，此时第一个年龄时间点即可进行取样。后续的年龄时间点应每隔两到三天取样一次，持续至少两周。开始此操作前，需先准备好生物检测仪。接种时使用100孔蜂窝板，每孔加入145 µL YEPD。务必至少留一孔仅加入YEPD而不接种细胞，用于后续数据分析。从培养箱中取出老化培养物。 简而言之，将要接种到蜂窝板中的第一份培养物轻轻涡旋混匀。注意不要洒出任何培养物。用火焰灼烧试管口，然后用移液器吸取五微升（5 µL）培养物，加入蜂窝板的第一个孔中。不要忘记灼烧试管口。取出5 µL等份样品后，对每种老化培养物重复此接种步骤。务必准确记录每种培养物对应的孔位。在整个实验过程中，每个后续时间点均应使用相同的孔位。将培养物放回30°C培养箱中。接种完成后，当培养物已接种至蜂巢板后，将该板放入BioScreen CMBR仪器中。为此，请通过打开盖子暴露培养箱室，然后取下样品架的盖子。将新接种的蜂巢板插入样品架中。使用左侧插槽。如果仅读取一个培养板，请将样品托盘盖重新装好，并关闭孵育室的盖子。务必确保传热液面高于最低填充刻度。如果不足，请使用1000微升移液器添加更多的传热流体。使用BioScreen软件Easy Experiment设置以下参数，以获得适于croce visi的生长曲线。对于样品数量，请输入含有培养基的孔数或200，将滤光片设置在420至580纳米波长范围内。将温度设置为30摄氏度。实验时长应为1天0小时0秒。测量间隔应为30分钟。最后，应将振荡设置为持续振荡并调至高速，点击“开始”以开始读数。从BioScreen CMBR仪器中获取输出文件。Easy Experiment软件会将BioScreen数据输出为制表符分隔的文件，该文件与Microsoft Excel及其他软件兼容。第一列（A列）显示了实验过程中测量光密度（OD）的时间。后续各列代表生物筛板中的每个孔，这些孔中接种了来自老化培养物的细胞。删除每列中的第一个OD读数，因为该读数属于噪声。通过从每列的光密度值中减去仅含YEPD的孔的光密度值来对数据进行归一化处理。这可以消除培养基本身的背景吸光度。生长曲线。曲线将随年龄而变化，例如，通过绘制六边形培养板第一列第一孔在六个时间点的菌丝延伸曲线，可以观察到曲线随时间明显向右偏移。初始时间点（第2天）与后续时间点之间的时间间隔决定了该特定年龄下的细胞活力。根据第2天年龄点的生长动力学计算每个孔的倍增时间。用于计算倍增时间的公式如下所示，其中 OD₁ 和 OD₂ 代表连续的光密度测量值，T₁ 和 T₂ 代表两次测量之间的时间。仅在光密度值介于 0.2 和 0.5 之间时计算倍增时间。这些值的平均值即为该条件下的倍增时间。通常，大多数野生型酵母菌株在每个年龄时间点的倍增时间值应在 85 至 90 分钟之间。相对于初始年龄时间点（即第 2 天），计算生长曲线中的时间偏移量 ΔT。一种简便的方法是：确定每个孔在初始年龄时间点与后续各个年龄时间点之间，达到 OD 值 0.3 所需时间的差值。可根据对应于自然对数光密度的线性回归方程，计算出特定孔达到 OD 0.3 所需的时间。为生成生存曲线，需计算每个年龄时间点的存活分数，并以初始的第2天年龄时间点作为100%存活率，用于后续各年龄时间点的相对比较。使用以下公式计算存活百分比。其中 SN 为存活率，Delta TN 为时间偏移，Sigma N 为倍增时间。可根据需要分别为其生成存活曲线。通过将存活细胞比例对年龄作图，计算每个孔的存活积分（SI），SI 定义为存活曲线下的面积，可通过以下公式进行估算：其中年龄 N 为年龄时间点，SN 为在该年龄时间点的存活值。根据 SI 及存活数据确定重复孔的统计学参数。常见的关注统计学参数包括每组生物学重复的均值、中位数和方差。可采用 t 检验或类似分析方法对不同实验组与对照组的 SI 进行成对比较。可能还需要根据生物学重复的平均值生成生存曲线。实验结束后，您将绘制出生存曲线，并完成足够的数据分析，以确定多种不同菌株或条件下的时间性衰老潜力。如果操作得当，从 BioScreen CMBR 仪器获得的生长曲线应与此曲线相似。通常情况下，在本实验所述条件下培养的野生型细胞，其时间性寿命中位数约为七天。在不同菌株中以及在某些条件下（例如在 0.05%葡萄糖培养基中生长）观察到生存时间存在显著差异，中位生存期可超过 30 天。我们刚刚向您展示了一种高通量定量测定酵母复制性寿命的方法。Croce visier。需要牢记的是，在进行此操作时，定期维护生物检测仪CMBR设备对于获得可重复的数据和确保准确性至关重要。就这些内容。祝您的实验顺利成功。

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