一个神经元和星形胶质细胞共培养检测神经毒性的高含量分析

高内涵筛选系统允许同时对许多样品进行各种形态学和细胞学分析。同时，在本视频中，制备神经元星形胶质细胞共培养物并将其放在 96 孔板上，在那里用神经毒性剂处理并进行各种神经毒性染色。将板加载到 GE incel 分析仪中，并使用研究软件从这些板中进行分析，可以获得神经和神经胶质细胞毒性的读数，例如右长神经元计数、GFAP 表达、星形胶质细胞区域。

大家好，我是 Andrew Ball，加利福尼亚州特曼库拉 Millipore Corporation 的高级科学家。今天，高内涵分析研究科学家 Janet Anur 将演示使用神经元和星形胶质细胞共培养物进行神经毒性高内涵筛选的方法。该技术采用 Millipore 开发的 Neurotox 3 检测中的试剂和方案来筛选神经生长、神经元和星形胶质细胞发育以及神经元和星形胶质细胞毒性。

我希望你喜欢以下序列。神经毒性的高内涵筛选从接种神经元星形胶质细胞共培养物开始。在 96 孔板中，一旦共培养物生长到大约 70% 至 80% 的共流畅度，它们就会分离。

使用 trippin 细胞在接种板中之前，应对细胞进行计数并调整至适合测定的密度。在 90 μL 的生长中，应让培养基细胞在水平表面上放置至少 15 至 30 分钟，以实现细胞均匀分布，这对于该检测至关重要。在此短暂的孵育之后，用 90 μL 的生长培养基替换，这是一种低血清 NGF 分化。中等。

继续培养这些细胞，直到获得所需的共流畅度或分化程度，然后将 10 微升感兴趣的神经毒性化合物添加到 90 微升分化培养基中。神经毒性 3 试剂盒包含对照神经毒素丙烯酰胺 K 2 52 或过氧化氢 1。细胞已暴露于毒素中适当的时间。

它们可以染色并准备成像，这将在下一步中显示 I.每个试剂盒都包含检测所需的一抗和二抗和眼睛，以及一系列对照化合物。试剂盒中也包含所有必需的缓冲液。在这种情况下，我们将在培养期结束时使用试剂研究共培养系统中的神经元和星形胶质细胞，然后在固定前在室温或 37 摄氏度和化学通风橱下预热 HCS 固定溶液。

向每个孔中加入 100 μL 固定液，让细胞在室温下固定 30 分钟。取出固定液，并按照您所在机构的危险废物处置要求进行处理。如果稍后要对细胞进行染色，请用 200 μL 洗涤缓冲液冲洗两次。

将第二次冲洗液留在密封的孔中，并将板储存在 4 摄氏度。如果要立即对细胞进行染色，请用 200 μL HCS am 免疫荧光缓冲液冲洗两次。在染色过程中，不允许细胞变干，这一点非常重要，因此请让任何系列洗涤中的最终洗涤保留在孔中。

制备兔抗 β 三微管蛋白小鼠抗 G-F-A-P-H-C-S 一抗的工作溶液后，去除免疫荧光缓冲液，加入 50 μL 原代在室温下孵育 1 小时。在该孵育结束时，可以制备二抗和 Hooks to 核染色溶液的工作溶液。该溶液应充分混合并避光并储存在冰上直至使用。

孵育 1 小时后，去除缓冲液并用 HCS 缓冲液冲洗 3 次。然后加入 50 μL 的 HCS 二抗钩状染色剂并储存在室温下，确保固定的细胞避光。孵育 1 小时后，用 HCS 免疫荧光缓冲液进行两次 200 μL 冲洗，用洗涤缓冲液进行两次 200 μL 冲洗。

密封板并立即成像，或将板储存在 4 摄氏度下直到准备好成像，确保板在储存时避光。对于 HCS 筛查，我们使用 GE Healthcare in cell analyzer 1000。该系统必须配备分束器，可以检测蓝色、绿色和红色范围内的荧光发射光谱，并使用研究者软件进行数据采集和分析高内涵筛选和分析。

在该仪器软件包中使用我们的检测试剂将使我们能够从每个染色孔中生成一系列测量结果，以获得不同的神经毒性指标。具体来说，我们将用于量化每种化合物的神经毒性程度的指标。R 神经元神经元计数、GFAP、染色强度、星形胶质细胞面积和星形胶质细胞计数的平均神经长度。

同样，这些数据是从荧光、每个孔生成的图像中获取的，并在所有多个孔中取平均值，以进行极高的通量分析。图像采集设置在采集方案管理器中进行，您可以在其中创建适用于所需放大倍率、荧光、波长和每孔要成像的视野数的样品特定成像方案。在这个例子中，我们将对三个荧光波长进行成像，每个标记物一个，核复染的钩子、神经元 β 三个微管蛋白和星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白或 GFAP。

然后，我们将选择我们的放大倍率 20 倍，在本例中为我们的印版品牌，每个型号都与正确成像对准所需的规格相关联。接下来，我们选择要成像的孔。这可以是子集或整个板。

此时，我们还可以调整相机设置。接下来，我们选择适合我们的荧光标记物的激发和发射滤光片。在本例中为 hst、FITC 和 SI 3。

在这里，我们还可以优化每个荧光通道的曝光时间和聚焦。我们可以调整设置以减少整个视野中的任何模糊，从而获得尽可能清晰的图像。在采集选项窗口中，我们可以选择每个孔要成像的场数以及这些图像的位置。

这可以从每个孔几个图像到多个图像不等，它们可以随机位于中心和特定位置，甚至可以设置为排除细胞可能因染色过程中移液而破坏的孔区域。此时，一旦您对所有设置感到满意，您就可以在采集过程中为您的板采集图像组。您可以监控仪器按顺序对哪个波长进行成像、哪个视场和哪个波长成像，并且可以实时观察每个图像的出现。

在这个布局中，我们的核染色钩出现在顶部面板，神经元 β 三个微管蛋白出现在中间面板，星形胶质细胞 GFAP 出现在底部。神经元往往具有小细胞体和许多细长的神经突延伸。星形胶质细胞往往具有较大的细胞体，并且可能分散以覆盖大面积，或者可能显示投影以使它们看起来更像星星。

这些是刚刚获得的钩状孔的一些叠加或合并图像示例。染色细胞核为蓝色神经元细胞体，表达 β 3 微管蛋白的神经突为绿色，表达 GFAP 的星形胶质细胞为彩色。使用 incel 分析仪工作站软件进行红色图像分析。

该软件带有几种预编程的分析算法。一个例子是呈现 neite 生长检测参数以帮助软件了解典型的样品尺寸，例如核面积、细胞、体型和 neite 长度。这些值将启用图像分割。

您还可以为您的检测选择感兴趣的测量值，包括接近右长度的总计数、接近右计数或细胞核数。数据可以以多种格式导出，包括导出为 Excel 电子表格。输入协议后，将自动执行图像分析。

仅观察 β 3 微管蛋白荧光通道，您可以看到圆形细胞核以绿色勾勒，神经元细胞体以深蓝色勾勒，长而薄溶卵母也以绿色勾勒，在生成时也会显示测量值。另一个强大的工作站算法是多目标分析协议。有多种细胞核和细胞质测量方法。

该分析可用于星形胶质细胞的分割，甚至能够区分 GFAP 表达阳性（绿色）或阴性（红色）的细胞和共培养物。在这里，您可以看到通过顺序接种产生的原代大鼠、海马体、星形胶质细胞和神经元培养物的代表性成像样品，首先接种星形胶质细胞，然后在神经胶质层顶部接种神经元。这是一张融合图像，显示了钩状 HCS 核染色、β 三微管蛋白和 GFAP 染色。

β 3 微管蛋白荧光通道的单独分析允许对神经突生长进行分割，其中细胞体以蓝色勾勒，右侧附近以绿色勾勒。这是一条剂量反应曲线，说明了神经突长度和丙烯酰胺浓度与原代大鼠海马单一培养之间的关系。可以看出，当丙烯酰胺浓度增加到 1 毫摩尔以上时，接近右边的平均生长量突然减少。

有趣的是，星形胶质细胞和神经元煤培养物比单一培养物对丙烯酰胺处理更具抵抗力。以下是过氧化氢处理对神经元计数的影响。在我们的煤炭培养物中，每孔使用 10 个田地进行，并在所有孔中取平均值，随着过氧化氢浓度的增加，神经元计数急剧下降 50%。

在此图中，GFAP 强度与丙烯酰胺浓度作图。GFAP 表达是已知的神经毒性指标，在该图中，随着丙烯酰胺浓度升高到 1 毫摩尔以上而增加。有趣的是，这与神经元计数急剧下降的浓度相同。

该图证明了丙烯酰胺暴露对星形胶质细胞面积的影响，该图将 Y 轴上以平方微米为单位的平均星形胶质细胞面积与 x 轴上丙烯酰胺的浓度进行了比较。星形胶质细胞计数也可以使用这种方法确定。所有这些数据都可以从板上多个孔的单个染色样品中提取。

我们早点准备。我们刚刚向您展示了如何使用高内涵分析对神经元和星形胶质细胞共培养物中的毒性进行可靠和灵敏的评估。我们已经回顾了细胞处理和免疫染色技术。

我们还查看了一些代表性数据，这些数据显示了用于检测神经毒性的分析类型。执行此程序时，重要的是要确保固定的细胞在染色过程中不会变干，并确保二抗染色细胞免受光线照射。就是这样。

感谢您的观看，祝您高内涵筛选好运。