Name: TIRF显微镜视网膜双极细胞的影像胞外分泌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: 学习使用TIRF显微镜观察金鱼视网膜双极细胞的突触小泡胞吐过程。该方法结合膜片钳技术，可实时成像单个小泡动态，为神经递质释放机制研究提供高分辨率可视化手段。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 EY 14990 支持。

第一部分：解剖与双极细胞分离
<ol>
<li>配制表2中列出的溶液；用NaOH将任氏液（外部）溶液的pH值调节至7.4，用CsOH将内部溶液的pH值调节至7.2；用铝箔包裹内部溶液以避光，并在4 °C下保存至使用；</li>
<li>在解剖前，将金鱼在暗处适应至少30分钟；</li>
<li>在动物暗适应期间，准备5 mL透明质酸酶溶液（V型透明质酸酶，1100单位/mL，溶于低Ca2+任氏液；Sigma，St. Louis，MO）和10 mL L-半胱氨酸溶液（0.5 mg/mL，溶于低Ca2+任氏液），并称取木瓜蛋白酶（冻干粉末，40单位/mL；Sigma，St. Louis，MO）用于配制5 mL消化液；</li>
<li>使用手术剪迅速断头处死金鱼，并用#11手术刀片破坏脑和脊髓；</li>
<li>使用#7弯头Dumont镊子破坏眼外肌，并用虹膜剪剪断视神经，以摘除眼球；</li>
<li>将一只眼球置于滤纸上，用#11手术刀片尖端刺穿巩膜缘；</li>
<li>将Vannas剪刀的刀片插入穿刺孔内，剪除整个前节部分；</li>
<li>将一小片滤纸置于剩余的视杯上方，施加一定压力，使滤纸吸收玻璃体液；</li>
<li>提起附有视网膜的滤纸，用Vannas剪刀剪断视神经；</li>
<li>将带有视网膜的滤纸放入盛有透明质酸酶溶液的35 mm塑料培养皿中，并借助#7 Dumont镊子将视网膜从滤纸上剥离；</li>
<li>使用工业碳素钢单刃刀片的一半将视网膜切成4–6片，并在透明质酸酶溶液中孵育20分钟；</li>
<li>在等待透明质酸酶作用期间，向木瓜蛋白酶中加入5 mL L-半胱氨酸溶液，静置至液体变为透明（约5–10分钟）；</li>
<li>用低Ca2+任氏液将视网膜组织片清洗3次，并在木瓜蛋白酶溶液中孵育30–35分钟；</li>
<li>用低Ca2+任氏液将视网膜组织片清洗3次，随后在含有低Ca2+任氏液的35 mm塑料培养皿中于4 °C保存至使用；</li>
<li>为解离细胞，将一片视网膜放入含有500 µL低Ca2+任氏液的微量离心管中，用玻璃解离移液管缓慢吹打上下数次以解离视网膜，注意避免产生气泡。解离移液管的制备方法为：用本生灯加热玻璃巴斯德移液管的尖端，并借助解剖镊子轻微弯曲；</li>
<li>通过向自制记录室中加入一滴视网膜悬液来接种分离的细胞，该记录室预先加入2 mL低Ca2+任氏液。记录室由35 mm塑料培养皿的下半部分构成，其中部有一个圆形孔，底部粘附一片折射率为1.78的圆形盖玻片（PlanOptik，德国），使用硅弹性体（Sylgard 184；Dow Corning，Midland，MI）进行粘合。</li>
</ol>
第2部分：双极细胞加载与洗脱
使用具有高数值孔径物镜和高灵敏度相机的物镜型全内反射荧光（TIRF）显微镜对突触小泡进行成像是最佳选择。在我们的实验中，选用数值孔径为1.65的物镜（Apo x100 O HR，N.A. 1.65，Olympus，日本）和电子倍增CCD相机（Cascade 512B，Roper Scientific，Tucson，AZ）。使用如此高数值孔径的物镜需要采用高折射率玻璃盖玻片和浸油（含硫的二碘甲烷）。在我们的实验条件下，激发光被限制在长度常数约为50 nm的指数衰减场内。
<ol>
<li>在显微镜物镜上滴加一滴高折射率液体（M系列，折射率 = 1.7800，Cargille Labs，Cedar Grove，NJ）；</li>
<li>小心将记录室置于显微镜物镜上方，并将接地电极和灌流出口管小心安装到记录室上；</li>
<li>让记录室在显微镜上静置10–20分钟，使细胞沉降并贴附于底部；</li>
<li>在此期间，准备5 mL含1 mM Trolox®（(±)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸；Sigma，St. Louis，MO）的高K+任氏液，超声至完全溶解；</li>
<li>准备15 mL ADVASEP-7洗涤液：将1 mM ADVASEP-7（Sigma，St. Louis，MO）溶于低Ca2+任氏液中。注意：ADVASEP-7的使用为可选，可根据需要省略；</li>
<li>对灌流管路进行通气，并将ADVASEP-7洗涤液、低Ca2+任氏液和对照任氏液加入灌流系统；</li>
<li>使用薄壁硼硅酸盐玻璃（Kwik-Fil® TW150-3；WPI，Sarasota，FL）拉制上样移液管。吹液移液管的电阻范围为1.5–2.5 MΩ；</li>
<li>配制FM1-43®（N-(3-三乙基铵丙基)-4-(4-(二丁基氨基)苯乙烯基)吡啶二溴化物，“特殊包装”；Invitrogen，Carlsbad，CA）溶液。首先，将160 μL蒸馏水加入一支FM1-43®（100 mg）小瓶中，配制成1 mM储备液。该储备液可在4 °C保存最多一周。然后，取5 μL FM1-43®储备液加入1 mL高K+任氏液 + 1 mM Trolox®中。用铝箔避光保护溶液，并在4 °C保存至使用；</li>
<li>打开显微镜明场光源，寻找完整的双极细胞。轻敲显微镜，确保神经元牢固贴附于记录室底部；</li>
<li>将灌流笔置于目标细胞附近，并持续用低Ca2+任氏液灌流样本；</li>
<li>关闭室内灯光，并在光路中加入红色长通滤光片（例如RG630；Schott，德国），以最大限度减少对FM染料的激发；</li>
<li>用10 μL FM染料溶液填充一支上样移液管，将其安装至显微操作器上，并在无正压条件下将移液管缓慢下放至样本位置，使其与待加载的双极细胞处于同一焦平面。请确保至少有两个电极夹持器：用于FM染料的夹持器不可用于膜片钳实验，否则可能污染细胞内溶液；</li>
<li>将吹液口置于轴突末梢约10 μm处，关闭灌流系统，并通过开启移液管正压吹入染料溶液10秒；</li>
<li>关闭正压，在不移动移液管的情况下静置30秒；</li>
<li>重新开启灌流系统，用ADVASEP-7溶液灌流记录室5分钟。在此期间，将吹液移液管从浴液中移出；</li>
<li>5分钟后，切换为低Ca2+任氏液，并继续灌流25–30分钟，以清除多余染料。</li>
</ol>
第3部分：膜片钳与全内反射荧光显微成像
<ol>
<li>在清洗样本的同时，使用厚壁硼硅酸盐玻璃管（B150-86-10；Sutter Instrument Company，Novato，CA）拉制膜片钳电极。膜片钳电极的电阻应处于 8–10 MΩ 范围内；</li>
<li>清洗完成后，将轴突末梢置于视野中央；</li>
<li>用 7 μL 内液填充膜片钳电极，轻敲电极以排除气泡，用熔化的牙科蜡（Sticky Wax；Kerr Corporation，Orange，CA）包裹电极，并将其安装至显微操作器上；</li>
<li>开启电极正压，缓慢将电极下放至样本表面。在放大器中检测电极电阻，并使用放大器的相应控制功能校正电极偏移和电容；</li>
<li>切换灌流液为正常任氏液。为在电极与细胞之间形成吉欧封接（gigaseal），可轻微触碰电极尖端至细胞体，随后关闭电极正压，同时向电极内施加轻柔的负压；</li>
<li>封接形成后，在放大器中选择“全细胞”模式，并将细胞钳制电位设为 -60 mV；</li>
<li>使用成像软件选择包含整个轴突末梢的兴趣区域，关闭明场光源，并通过短暂暴露（30 ms）末梢于 488 nm 激光下，确定全内反射荧光（TIRF）成像的最佳焦平面；</li>
<li>在对电极施加轻微负压的同时，使用放大器的“zap”指令击穿细胞膜，进入全细胞记录模式；</li>
<li>校正细胞电容和串联电阻，随后在成像突触囊泡运动的同时施加所需的电压刺激程序。此步骤中，确保电压刺激程序与相机帧率同步至关重要。在本实验中，每帧时长为 30 ms，因此电压变化以该值的整数倍进行（例如每 300 ms 或 10 帧）；</li>
<li>每次实验之间至少等待 40 秒，以允许细胞恢复；</li>
<li>为观察突触带的位置，可在开启 561 nm 激光的情况下拍摄图像。</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/1305/fig1.jpg" alt="光学显微镜装置示意图；激光激发、荧光发射、二向色滤光片。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 图 1：实验装置示意图。488 nm 激光（蓝色）聚焦于物镜后焦面边缘，在到达玻璃-水介质界面时发生全内反射。反射光束产生的电磁场激发位于玻璃培养皿底部附近、突触囊泡中负载的荧光染料，使其发出荧光（绿色）。荧光信号随后被引导至观察者眼睛（图示）或 CCD 相机。同时通过膜片钳技术控制成像细胞的膜电位。该方法可用于研究输入信号（膜电压）与神经元输出（胞吐作用）之间的关系。
<img src="/files/ftp_upload/1305/fig2.jpg" alt="分离的双极细胞轴突末梢显微图像；荧光，FM 1-43，Rpep-罗丹明标记。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="figure 2"> 图 2： 典型实验结果。左侧：分离的金鱼双极细胞的明场图像。右上方：使用488 nm激光（FM染料）成像的双极细胞轴突末梢中被FM 1-43®标记的突触囊泡的全内反射荧光（TIRF）图像。右下方：对细胞进行膜片钳记录后，使用561 nm激光对同一末梢的轴突末梢进行成像的结果。突触带由基于罗丹明的RIBEYE结合肽（Rpep_rhod）标记。
表1： 特定试剂与设备。
<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0">
<tbody>
<tr>
<td> 名称</td>
<td>类型</td>
<td>制造商</td>
<td>目录</td>
<td>评论</td>
</tr>
<tr>
<td>-</td>
<td>气浮台</td>
<td>Newport Corporation</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>IX70</td>
<td>倒置显微镜</td>
<td>Olympus</td>
<td>-</td>
<td>配备钨灯用于明场成像，以及用于全内反射荧光（TIRF）的侧向开口端口</td>
</tr>
<tr>
<td>TH4-100</td>
<td>灯源电源</td>
<td>Olympus</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>FF498_581-Di01</td>
<td>二向色滤光片</td>
<td>Semrock</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>NF01-405_488_568</td>
<td>发射滤光片</td>
<td>Semrock</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>Apo x100 O HR</td>
<td>目标</td>
<td>Olympus</td>
<td>-</td>
<td>N.A. 1.65</td>
</tr>
<tr>
<td>RG630</td>
<td>红色玻璃滤光片</td>
<td>Schott</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>-</td>
<td>488 nm 激光器</td>
<td>相干</td>
<td>-</td>
<td>最低功率使用</td>
</tr>
<tr>
<td>-</td>
<td>快门</td>
<td>Uniblitz</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>VMM-D1</td>
<td>快门驱动器</td>
<td>Uniblitz</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>-</td>
<td>561 nm 激光器</td>
<td>Melles Griot</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>-</td>
<td>快门</td>
<td>Uniblitz</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>VMM-D3</td>
<td>快门驱动器</td>
<td>Uniblitz</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>灌注压试剂盒</td>
<td>灌流系统</td>
<td>自动化科学</td>
<td>09-04</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>灌注笔</td>
<td>灌流系统</td>
<td>自动化科学</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>Valvelink 8</td>
<td>灌流系统控制器</td>
<td>自动化科学</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>Cascade 512B</td>
<td>EM CCD相机</td>
<td>Roper Scientific</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>Metamorph 7.1</td>
<td>成像软件</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>EPC-9</td>
<td>膜片钳放大器</td>
<td>HEKA Elektronik</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>脉冲</td>
<td>放大器软件</td>
<td>HEKA Elektronik</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>MP-285</td>
<td>显微操作仪</td>
<td>Sutter Instrument</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>-</td>
<td>电极夹</td>
<td>HEKA Elektronik</td>
<td>-</td>
<td>对于1.5毫米外径玻璃管，使用2个单位</td>
</tr>
<tr>
<td>Kwik-Fil® TW150-3</td>
<td>硼硅酸盐毛细玻璃管</td>
<td>WPI</td>
<td>-</td>
<td>无纤维</td>
</tr>
<tr>
<td>B150-86-10</td>
<td>硼硅酸盐毛细玻璃管</td>
<td>Sutter Instrument</td>
<td>-</td>
<td>含细丝</td>
</tr>
<tr>
<td>P-97</td>
<td>微电极拉制仪</td>
<td>Sutter Instrument</td>
<td>-</td>
<td>配备 3x3 箱式灯丝和环境腔室</td>
</tr>
<tr>
<td>-</td>
<td>压力真空空气泵</td>
<td>托马斯科学公司</td>
<td>7893B05</td>
<td>产生真空以从腔室中移除液体，并提供移液器所需的正压</td>
</tr>
<tr>
<td>MatLab R2008a</td>
<td>分析软件</td>
<td>MathWorks</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>353001</td>
<td>35 mm 塑料培养皿</td>
<td>Falcon</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>-</td>
<td>高折射率玻璃</td>
<td>PlanOptik</td>
<td>-</td>
<td>折射率488 nm = 1.78</td>
</tr>
<tr>
<td>系列 M</td>
<td>高折射率液体</td>
<td>Cargille Labs</td>
<td>-</td>
<td>折射率 = 1.78</td>
</tr>
<tr>
<td>Sylgard 184</td>
<td>硅弹性体试剂盒</td>
<td>道康宁</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>谷胱甘肽</td>
<td>三肽</td>
<td>EMD Chemicals</td>
<td> </td>
<td>自由基清除剂</td>
</tr>
<tr>
<td>透明质酸酶</td>
<td>酶</td>
<td>Sigma</td>
<td>H6254</td>
<td>V型</td>
</tr>
<tr>
<td>L-半胱氨酸</td>
<td>氨基酸</td>
<td>Fluka</td>
<td>30090</td>
<td>激活木瓜蛋白酶</td>
</tr>
<tr>
<td>木瓜蛋白酶</td>
<td>酶</td>
<td>Fluka</td>
<td>76220</td>
<td>从 番木瓜</td>
</tr>
<tr>
<td>Trolox®</td>
<td>可溶性维生素E</td>
<td>Sigma</td>
<td>56510</td>
<td>自由基清除剂</td>
</tr>
<tr>
<td>ADVASEP-7</td>
<td>磺化 B-环糊精衍生物</td>
<td>Sigma</td>
<td>A3723</td>
<td>降低FM 1-43®背景荧光</td>
</tr>
<tr>
<td>FM 1-43®</td>
<td>荧光染料</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T35356</td>
<td>特殊包装</td>
</tr>
<tr>
<td>粘性蜡</td>
<td>移液管涂层剂</td>
<td>Kerr Corporation</td>
<td>-</td>
<td>降低移液管电容</td>
</tr>
</tbody>
</table>
表2： 本研究中使用的生理溶液。
<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0">
<tbody>
<tr>
<td> 物质</td>
<td>低 Ca2+ Ringer 液</td>
<td>对照 Ringer 液</td>
<td>高 K+ Ringer 液</td>
<td>胞内溶液</td>
</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>120 mM</td>
<td>120 mM</td>
<td>97.5 mM</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
<td>2.5 mM</td>
<td>2.5 mM</td>
<td>25 mM</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
<td>1 mM</td>
<td>1 mM</td>
<td>1 mM</td>
<td>4 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>CaCl2</td>
<td>0.5 mM</td>
<td>2.5 mM</td>
<td>2.5 mM</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>10 mM</td>
<td>10 mM</td>
<td>10 mM</td>
<td>10 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>EGTA</td>
<td>0.75 mM</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
<td>0.5 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>葡萄糖</td>
<td>10 mM</td>
<td>10 mM</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>谷胱甘肽</td>
<td>2 mM</td>
<td>2 mM</td>
<td>-</td>
<td>1 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>CH3CsO3S*</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
<td>100 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>TEACl</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
<td>10 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>ATP-Mg</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
<td>10 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>GTP-Li</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
<td>1 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Rpep-rhod**</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
<td>5 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>体积</td>
<td>200 mL</td>
<td>100 mL</td>
<td>5 μL</td>
<td>100 μL</td>
</tr>
</tbody>
</table>
* 甲磺酸铯。 ** RIBEYE 结合肽：罗丹明+EQTVPVDLSVARDR-羧基（分子量 1997.75）。

<ol><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology.</a> Traffic. 2, 764-774 (2001).</li>
<li>Zenisek, D., Steyer, J. A., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport%2C+capture+and+exocytosis+of+single+synaptic+vesicles+at+active+zones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones.</a> Nature. 406, 849-854 (2000).</li>
<li>Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+association+and+exocytosis+at+ribbon+and+extraribbon+sites+in+retinal+bipolar+cell+presynaptic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Vesicle association and exocytosis at ribbon and extraribbon sites in retinal bipolar cell presynaptic terminals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 4922-4927 (2008).</li>
<li>Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+synaptic+ribbons+in+the+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualizing synaptic ribbons in the living cell.</a> J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li>
<li>Rouze, N. C., Schwartz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continous+and+transient+vesicle+cycling+at+a+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Continous and transient vesicle cycling at a ribbon synapse.</a> J. Neurosci. 18, 8614-8624 (1998).</li>
</ol>

物镜型全内反射荧光显微镜的优点包括：1）通过将激发光限制在物镜焦平面内的狭窄区域，实现优异的光学切片能力，从而最大限度地减少非焦平面光线的干扰；2）由于光强随距离呈指数衰减，因此可通过荧光强度的变化来监测垂直方向上的运动；3）利用高数值孔径物镜高效收集光线1,5。
该技术的主要缺点是仅限于成像发生在100微米以内的事件&amp; 细胞表面的纳米级结构，这大致相当于透射电镜中的超薄切片。因此，这些事件的可视化在很大程度上依赖于细胞牢固地贴附在玻璃表面、突触带接近贴附于玻璃的膜区域以及囊泡的成功加载。本方案仅能实现双极细胞突触终末中总囊泡数量的1–2%被成功加载。2,6需要指出的是，细胞表面实际发生的事件远比我们能够成像的要多得多。

使用全内反射荧光显微镜成像视网膜双极细胞中的胞吐作用

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

全内反射荧光（TIRF）显微镜技术通过选择性成像靠近高折射率物质（如玻璃）的荧光分子，实现对细胞膜上发生的事件进行研究1. 在本文中，我们将该技术应用于成像从金鱼视网膜分离的视网膜双极细胞中突触小泡的胞吐作用。由于这些神经元具有较大的轴突终末，非常适合此类研究。通过同时对双极细胞进行膜片钳记录，可以研究突触前膜电位与突触释放之间的关系2,3. 通过共喷施染料和含有高浓度 K⁺ 的任氏液，将荧光染料（FM 1-43®）加载至双极细胞终末内的突触小泡中+浓度聚集到突触末梢，从而去极化细胞并刺激内吞作用，使染料随之进入谷氨酸能囊泡。在洗去多余染料约30分钟后，细胞即可用于同时进行膜片钳记录和488 nm激光成像。膜片电极内液含有基于罗丹明的肽段，该肽段可特异性结合突触带蛋白RIBEYE。4，从而在使用 561 nm 激光对终末进行成像时特异性地标记突触带。这使得能够精确定位活性区，并区分突触内与突触外事件。

在本视频中，我们演示如何利用全内反射荧光（TIRF）显微镜对金鱼视网膜双极细胞中单个突触小泡的胞吐及转运过程进行标记与可视化观察。

全内反射荧光（TIRF）显微镜技术通过选择性地...

该操作始于成年金鱼视网膜神经层的解剖，即位于眼球后部的神经组织。将视网膜置于酶溶液中消化35分钟，随后冲洗，并用火焰抛光的玻璃移液管轻柔吹打以分离细胞。接着将细胞接种于高折射率玻璃盖玻片上，并将其安装至塑料组织培养皿中。通过其独特的形态鉴定分离的双极细胞，以加载其终末。用含有FM 1-43的溶液对细胞吹泡10秒，随后等待30秒，再洗去染料。经过30分钟的清洗后，对细胞进行膜片钳记录，并利用全内反射荧光显微镜（TIRF）进行成像。大家好，我是来自耶鲁大学医学院细胞与分子生理学系ZEC实验室的Christina Jovi。今天我们将向您展示一种利用turf显微镜在活体视网膜双极细胞中研究胞吐作用的技术。我们在实验室中应用该技术来研究突触释放的机制。那么，让我们开始吧。在解剖前，先将一条金鱼置于暗处适应至少30分钟。断头并取出眼睛后，将一只眼球放置在一片滤纸上，用11号手术刀片的尖端刺穿巩膜缘，在刺出的小孔内插入刀尖。使用一对虹膜剪将整个眼前节剪下并移除。接着，将一小片滤纸置于剩余的视杯上方并施加一定压力，使其吸收玻璃体液。然后连同附着的视网膜一起提起滤纸，并使用一对VNA剪刀剪断视神经。将含有视网膜的滤纸放入盛有高透明质酸酶溶液的35毫米塑料培养皿中，使用7号Dumont镊子将视网膜从滤纸上剥离。接着，使用工业碳素钢单刃刀片的一半，将视网膜切成4至6块，并将其置于透明质酸酶溶液中静置20分钟。在等待透明质酸酶发挥作用的同时，向木瓜蛋白酶中加入5毫升L-半胱氨酸溶液，静置约5至10分钟，直至液体变为透明。用低钙林格溶液将视网膜组织块清洗三次，然后将其置于木瓜蛋白酶溶液中静置30至35分钟。在木瓜蛋白酶溶液中孵育35分钟后，将视网膜组织块洗涤三次。将组织块转移至含有低钙林格液的35毫米塑料培养皿中，并将培养皿置于12至14摄氏度保存，直至准备开始细胞解离。首先，使用本生灯加热玻璃移液管或移液器的尖端，然后用解剖镊子轻轻将其弯曲，以制备解离用移液管。取一小块视网膜放入含有低钙林格溶液的微量离心管中，用制备好的解离移液管轻柔地反复吹打，使视网膜组织解离。注意避免产生气泡，将细胞悬液滴加至一个自制的记录室中，该记录室已预先填充低钙林格溶液，以完成分离细胞的接种。该腔室由一个35毫米塑料培养皿的下半部分构成，中间有一个圆形孔，底部粘附一块由折射率为1.78的玻璃制成的圆形盖玻片。在完成视网膜解剖和双极细胞分离后，我们即可开始双极细胞的染料加载与洗脱。在本实验中，最好使用配备高数值孔径物镜和高灵敏度相机的全内反射荧光显微镜。在本视频中，我们将使用数值孔径为1.65的物镜和电子倍增电荷耦合器件。首先，在显微镜物镜上滴加一滴高折射率液体。将记录室置于显微镜物镜上方。将接地电极和灌流出口管小心安装到记录室中。将记录室置于显微镜上静置10至20分钟，使细胞沉降并贴附于底部。随后，冲洗灌流管路，并加入清洗液。将低钙林格液和对照林格液接入灌流系统。打开显微镜明场光源，寻找完整的双极细胞。轻轻敲击显微镜，以确保神经元牢固附着于灌流 chamber 的底部。将灌流笔置于一个完整细胞附近，并持续用低钙任氏液灌流样本。现在关闭房间内的灯光，并在光路中添加红色长通滤光片，以最大限度减少对荧光染料的激发。用10微升荧光染料溶液填充上样移液管。将它安装到显微操作器上，然后在不使用加压选项的情况下将其缓慢下降至制备物上，直至与所选双极细胞处于相同的焦平面。将喷射口定位在距离轴突末梢约10微米的位置。关闭灌流系统，通过开启移液管的加压功能喷射染料溶液，持续10秒。现在关闭正压，同时保持移液管不动。等待30秒后，打开灌流系统，用清洗液灌流孵育 chamber 5分钟。在此期间，将喷射移液管从浴液中取出。五分钟后，将SUPERFUSION系统切换至低钙任氏液，并灌注25至30分钟，以清除过量染料。在双极细胞完成染料加载和洗脱后，即可开始膜片钳和全内反射荧光显微镜（T-I-R-F-M）成像。洗脱完成后，更换电极 holder，以避免染料污染您的膜片电极。将轴突末梢置于视野中央。用七微升（7 µL）的内液填充膜片电极，轻敲以去除气泡。用熔化的牙科蜡包裹，并将其安装到显微操作器上。将移液管翻转并施加压力，缓慢将其下降至样本上。检查移液管的电阻，并进行必要的调整。接下来，将灌流系统设置为控制任氏液，通过将电极尖端轻轻接触细胞体，在移液管与细胞之间形成吉欧封接。在移液管正压关闭的情况下，对已封接的电极施加轻柔的负压。在放大器中选择全细胞模式，并将细胞钳制电位设置为负60毫伏。现在使用成像软件选择一个包含整个轴突末梢的兴趣区域。关闭明场光源，并通过短暂暴露末梢于488纳米激光下，找到适合TIRF成像的焦平面。接下来，使用放大器的“zap”指令击破细胞膜，同时对移液管施加轻微的负压，校正细胞电容和串联电阻。然后在成像突触囊泡运动的同时施加电压程序。每次实验之间至少等待40秒，以确保细胞恢复。首先，我们在明场显微镜下选择一个双极细胞。然后放大图像，并用荧光染料标记其轴突末梢。经过30分钟的漂洗后，可利用共聚焦显微镜对已标记的末梢进行成像，同时观察荧光谷氨酸能囊泡的运动。在此，我们通过膜片钳电极引入一种核眼结合肽，使其在使用561纳米激光成像时能够显示突触核眼的位置。随后，我们对细胞进行去极化处理，并使用488纳米激光成像囊泡的运动。我们刚刚向您展示了如何分离并加载视网膜双极细胞的荧光染料，以及如何对这些神经元进行膜片钳记录，同时利用转盘显微镜对其进行实时成像。进行此操作时，重要的是不要让细胞过度暴露于激光下。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利。

imaging-exocytosis-in-retinal-bipolar-cells-with-tirf-microscopy

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

TIRF显微镜视网膜双极细胞的影像胞外分泌

本文介绍一种制备适用于电生理学和Ca2+成像的琼脂包埋视网膜切片的实验方案。该方法可利用对单个突触前神经末梢的直接膜片钳记录，研究视网膜微环路中的带状突触。...

视网膜切片中单个神经末梢的膜片钳电容测量与 Ca2+ 成像

蛋白质在质膜内或细胞内特定位置的区室化分布是一种重要的调控机制，可显著影响信号转导的结果；因此，要理解信号转导过程，研究相关蛋白质在空间和时间上的动态行为至关重要。本文介绍了一种基于全内反射荧光（TIRF）显微镜的系统，用于研究T细胞中的信号转导，该系统也具有广泛的适用性。...

一种用于实时同步成像T细胞受体及其相关信号蛋白的TIRF显微镜技术

来源：Daniele, F., 等 利用全内反射荧光显微镜和pH敏感型GFP探针评估SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中神经递质囊泡动力学：细胞成像与数据分析。J. Vis. Exp.

使用全内反射荧光显微镜进行细胞成像

来源：Winkle, C. C., et al．利用联合方法定义质膜递送在轴突分支和神经元形态发生中的作用．J. Vis. Exp.

全内反射荧光显微镜用于胞吐事件的可视化

基于偏振的全内反射荧光显微镜（pTIRFM）可实现对细胞膜动态的实时检测。本文介绍了pTIRFM在研究调控性胞吐过程中膜重塑的应用。该技术可推广至细胞生物学中其他直接或间接涉及膜形态变化的过程。...

使用pTIRFM成像质膜形变

网格蛋白介导的内吞作用是一种快速且高度动态的过程，可将多种蛋白质（包括信号受体）内化。本文所述的实验方案可直接可视化单个内吞事件的动力学过程。这对于理解内吞机制核心组分之间如何相互协调，以及蛋白质货物如何影响该过程至关重要。...

通过全内反射荧光显微镜以单事件分辨率可视化G蛋白偶联受体的网格蛋白介导的内吞作用

本文介绍了一种利用突触小泡蛋白2-pHluorin构建体和全内反射荧光显微镜技术研究神经母细胞瘤细胞中神经递质囊泡动态的方法。同时报道了图像处理与数据分析的策略。...

使用TIRFM和pH敏感型GFP探针评估SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中神经递质囊泡动态：细胞成像与数据分析

本文详细介绍了一种用于活细胞成像检测调控性胞吐作用的方法。该方法利用可积聚于溶酶体相关细胞器中的异硫氰酸荧光素-葡聚糖（FITC-dextran）作为报告分子。这一简便的方法还可用于区分难以进行遗传操作的细胞中不同模式的调控性胞吐作用。...

成像FITC-葡聚糖作为调控性胞吐作用的报告分子

活体成像是研究健康与疾病状态下生物学的有力工具。本方案描述了使用标准双光子显微镜对小鼠视网膜进行经瞳孔成像的方法。同时展示了多种活体成像技术，用于对视网膜中多个细胞群体进行荧光标记。...

经瞳孔双光子活体小鼠视网膜成像

本研究介绍了一种替代性的视网膜平铺制备方法，通过去除感光细胞胞体，可加快抗体扩散速度，并改善对内层视网膜神经元进行免疫组织化学染色时的膜片钳电极接触条件。 原位 杂交和电生理实验。...

改良的视网膜劈裂铺片技术用于研究脊椎动物视网膜内核层神经元

本文展示了一种利用转盘共聚焦显微镜对视网膜中小胶质细胞的运动性及其与突触后斑点接触进行可视化和定量分析的方法。...

活体成像与特征分析疾病小鼠视网膜中小胶质细胞动态及其与突触的相互作用

学习使用TIRF显微镜观察金鱼视网膜双极细胞的突触小泡胞吐过程。该方法结合膜片钳技术，可实时成像单个小泡动态，为神经递质释放机制研究提供高分辨率可视化手段。

使用全内反射荧光显微镜成像视网膜双极细胞中的胞吐作用

探索更多视频