Name: 结合周边神经移植和矩阵调制修复受伤的大鼠脊髓 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-20T17:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 14 s
Description: 了解利用周围神经移植结合神经营养因子和基质调节酶修复大鼠脊髓损伤的方法。该技术通过降解胶质瘢痕促进轴突再生，为神经再生医学研究提供重要实验模型。

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本研究工作得到了美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所（NIH/NINDS）基金项目 NS26380 和 NS55976、克里斯托弗和戴娜·里夫基金会以及丹尼尔·海曼脊髓研究基金的支持。德雷塞尔大学医学院脊髓研究中心为完成本工作所使用的核心设施提供了支持。

1）显微外科手术的准备
<ol>
 <li>手术区域需在摆放器械和辅助材料前用稀释的漂白剂溶液清洁并消毒。手术器械需在手术前一天进行高压灭菌，并存放于无菌容器中。开启用于在不同动物间手术操作时去除器械上病原体和微生物污染物的热珠灭菌器（Fine Science Tools）。</li>
 <li>接通用于维持手术过程中动物体温的温控装置。准备好用于控制出血的棉签和纱布垫。准备小块（&lt; 2mm3）明胶海绵，用于微血管止血，并将其浸入无菌生理盐水中。</li>
 <li>将大鼠放入诱导室，用异氟烷（5% 氧气混合，流速 2.0 L/min）进行麻醉。将动物从诱导室移至准备台，剃除手术区域周围较大范围的毛发。从手术区域中心开始，用70%异丙醇向外周擦拭，随后以同样方式用聚维酮碘溶液（Xenodine）进行刷洗。重复此清洗程序3次。</li>
 <li>将动物置于温控装置上，用吸入式面罩覆盖口鼻，将异氟烷浓度降至3%，流速调至0.2 L/min。通过皮下注射给予适当剂量的抗生素（氨苄西林），并通过肌肉注射给予镇痛剂（丁丙诺啡，0.05 mg/kg）。</li>
 <li>术者使用聚维酮碘溶液刷洗手部，并用水冲洗。助手为术者穿上无菌手术衣，术者用无菌毛巾擦干双手后戴上无菌手套。本操作适用于本文所述的每一次手术程序。</li>
 <li>由助手移除覆盖无菌器械的盖子，术者将器械摆放在无菌铺巾上。</li>
 </ol>
2) 切断周围神经以促进其变性
 <ol>
 <li>将动物侧卧，从股骨头部向膝关节方向做一条直线切口，切口与股骨保持平行且距离约3 mm。沿皮肤切口相同路线切开浅层的股二头肌，以暴露下方的股外侧肌。</li>
 <li>使用剪刀在靠近膝关节处的股外侧肌上做一小切口，并向上延伸至股骨头部。再次使用剪刀轻轻分离股外侧肌，直至可见坐骨神经的胫神经和腓神经合并分支（与股骨平行走行）。</li>
 <li>沿这些分支向股骨头部方向追踪，直至识别出坐骨神经的主干。在坐骨神经分叉稍下方，用精细镊子小心分离包裹胫神经分支（较粗的分支）周围的结缔组织（神经外膜）。</li>
 <li>一旦分离完成，将一根6-0丝线结扎线穿过胫神经并收紧。使用显微剪刀在结扎线近端（头侧）横断神经。将缝线穿过股外侧肌并打结固定。此缝线可作为标记，便于7–10天后取材时快速定位胫神经的切断端。</li>
 <li>在移植前使胫神经发生变性，可创造比新鲜神经制备更有利于轴突生长的环境。</li>
 <li>用6-0丝线缝合股外侧肌，再用6-0丝线缝合股二头肌，皮肤使用Michel伤口夹闭合。关闭异氟烷气流，移除吸入式鼻罩，将动物置于保温屏障上的暂养笼中，待其清醒并恢复活动后，送回饲养笼。</li>
 </ol>
3) 去除PN节段
<ol>
<li>按上述步骤（1.3）麻醉动物，剃除并清洁预定手术区域。将动物置于保温屏障上。</li>
<li>取下伤口夹，分离先前的皮肤切口。切开浅层肌肉缝线以暴露股外侧肌，并在此肌肉中切开缝线。</li>
<li>沿缝线追踪至胫神经断端，从神经上移除缝线。用精细镊子剥离胫神经一段长15 mm的神经外膜，并切断该远端。取出神经节段并浸入无菌的Hanks平衡盐溶液中。</li>
<li>若为异体移植实验，通过腹腔注射Euthasol处死动物；若为自体移植实验，则按照2.6）所述方法关闭腿部肌肉和皮肤，并按以下描述准备进行颈椎脊髓损伤手术。</li>
</ol>
4) 颈部半横断损伤与移植
第1天
<ol>
<li>按上述步骤（1.3）麻醉动物，剃除并清洁预定手术区域。将动物置于隔热垫上。按上述方法（1.4）给予抗生素和镇痛剂。</li>
<li>定位枕骨切迹和明显的T2背侧椎体突起，在这两个体表标志之间做全长切口。沿斜方肌表层正中切开，并分离其下方的颈菱形肌。通过插入牵开器将肌肉保持分开状态。</li>
<li>应从C4、C5和C6背侧椎体突起处切断深层脊上肌。使用咬骨钳对C5进行部分椎板切除，以暴露脊髓右侧全部及左侧中线部分。以明显的背侧静脉作为脊髓中线的解剖标志。</li>
<li>使用显微手术刀片或30号针头刺破硬脊膜，并沿C5脊髓水平延长切口。在下方的蛛网膜下腔和软脑膜上做小切口。</li>
<li>使用拉制的玻璃微导管，施加轻柔压力，开始抽吸脊髓背侧右侧部分，同时使用显微镊子分离组织以促进其移除。继续操作至脊髓中间及腹侧部分，形成一个从背侧到腹侧、从中线至外侧脑膜贯通的长约2 mm的空腔。</li>
<li>将浸有生理盐水的明胶海绵填入空腔，以达到止血目的。</li>
<li>从Hanks溶液中取出周围神经段。轻轻剥离神经段近端3 mm处的神经外膜，并将此端贴合至半横断损伤空腔的头端壁。使用10-0缝线穿过神经外膜与硬脊膜固定神经段，随后将硬脊膜缝合，覆盖移植物的植入端。</li>
<li>用两片硅胶膜（Biobrane）将移植物夹合，以提供保护并便于后续时间点的分离。将其放置于C6、C7和T1椎体突起旁侧。切勿将神经远端贴附于脊髓或肌肉组织。</li>
<li>使用4-0缝线逐层缝合肌肉，使用伤口夹闭合皮肤切口。</li>
<li>将动物置于隔热垫上的饲养笼中，待其清醒且活动正常后，送回饲养笼。</li>
</ol>
第21天
<ol start="11">
<li>按上述方法（1.3）麻醉动物，剃除并清洁预定手术区域。将动物置于保温屏障上，并按前述方法（1.4）给予抗生素和镇痛药。剪开表层缝线，暴露包裹神经移植物的硅胶膜。使用精细镊子和弹簧剪小心地将神经从硅胶膜中游离出来，并将其从手术区域牵开。</li>
<li>在C7椎体突右侧进行部分椎板切除术。按前述方法（4.4）刺破脑膜，通过抽吸在C7脊髓处制备一个1 mm3的背侧象限损伤空腔。使用生理盐水浸润的明胶海绵实现止血，随后更换为含软骨素酶ABC的浸润明胶海绵。对损伤部位处理15分钟，每5分钟更换一次新鲜的软骨素酶浸润明胶海绵。</li>
<li>用硅胶膜包裹神经移植物的外部长度。使用4-0缝线缝合浅层肌肉，用伤口夹闭合皮肤切口。将动物放置于保温屏障上的饲养笼中，待其清醒且活动正常后，送回原饲养笼。</li>
</ol>
第23天
<ol start="14">
<li>按上述方法（1.3）麻醉动物，剃除并清洁预定手术区域。将动物置于保温屏障上，并按前述方法（1.4）给予抗生素和镇痛剂。剪开表层缝线，暴露包裹神经移植物的硅胶膜。不要扰动移植物，而是暴露C7移植物部位，使用带有拉制玻璃细管的汉密尔顿注射器，将1μl的软骨素酶ABC微量注射至脊髓右侧，位置约为移植物与脊髓连接处远端约1 mm处。</li>
<li>轻轻剥离神经段远端2 mm处的神经外膜，将此端对接至C7损伤腔。通过神经外膜以10-0缝线将神经段固定于硬脊膜上。</li>
<li>用4-0缝线缝合浅层肌肉，用伤口夹闭合皮肤切口。将动物置于保温屏障上的暂养笼中，待其清醒并恢复活动后，送回饲养笼。</li>
</ol>
5) 移植物及远端脊髓中动作电位的电生理记录
<ol>
<li>为了确定电活动是否通过已再生进入PNG的轴突进行传导，我们必须首先暴露并分离移植物。在该操作过程中需特别小心，避免对移植物造成物理性损伤，而移植物植入后使用Silastic膜的重要性正在于此。按上述方法（1.3）麻醉动物，剃除并清洁预定手术区域。将动物置于保温屏障上。</li>
<li>切开皮肤并分离浅层肌肉后，识别Silastic膜条，并小心地将其从移植物周围解剖分离。</li>
<li>使用咬骨钳去除PNG与脊髓对接部位头侧和尾侧相邻的椎板。在此过程中注意尽量不要扰动移植物。在上述两个水平的硬脑膜上切开小口。</li>
<li>在C5水平移植物与脊髓对接部位头侧约1 cm处，将一根单极刺激电极（铂-铱合金）插入损伤同侧的脊髓实质，深度约为1 mm。小心地将移植物中部轻轻抬起并置于双极钩状记录电极上。给予10 μA、持续100 μsec的单脉冲刺激，检测是否有动作电位通过已再生进入移植物的轴突传导。</li>
<li>交换电极导线连接方式和位置，使钩状电极变为刺激电极，而单极电极则插入PNG与脊髓对接部位远端的脊髓内，尝试在脊髓中记录由再生轴突引发的动作电位。</li>
<li>实验结束时，在50 Hz频率下给予持续1小时、每次1 mA、持续100 μsec的脉冲刺激序列。1小时后处死动物，用4%多聚甲醛灌注，随后处理脊髓组织，通过免疫细胞化学方法检测因PNG内再生轴突激活而表达cFos的神经元。</li>
</ol>
6) 对轴突再生进入 PNG 的神经元进行逆行标记，以及对轴突再生返回脊髓的神经纤维进行顺行标记
<ol>
<li>对于未进行电生理检测的动物，可确定长入移植物的轴突来源及其在脊髓中的终止走行。按上述方法麻醉动物，剃除并清洁预定手术区域（1.3）。将动物置于保温屏障上，并按上述6.1节所述暴露外周神经移植物（PNG）。</li>
<li>使用显微剪刀在移植物中点处切断，并从移植物切断端剥离并翻回神经外膜。将切断的两端彼此分开，分别置于独立的帕拉膜片上。</li>
<li>将一块浸有True Blue的明胶海绵敷料置于近端切断端，以标记贡献轴突至PNG的神经元；将另一块浸有生物素化葡聚糖胺（biotinylated dextran amine, BDA）的明胶海绵敷料置于远端切断端，以标记从移植物延伸回脊髓的轴突。</li>
<li>术后3–4天处死动物，用4%多聚甲醛灌注，取脑和脊髓组织切片，进行荧光显微镜检测以观察True Blue标记的神经元，或进行BDA组织化学染色以检测标记的轴突。</li>
</ol>
7) 胸段完全横断损伤与移植
这为上述的颈段半横断损伤模型提供了一种替代方法。在此方法中，制造出更为严重的双侧损伤，并将外周神经节段植入损伤脊髓的病灶腔内，以连接损伤脊髓的头端和尾端残端。
第1天
<ol>
<li>按上述方法（1.3）麻醉动物，剃除并清洁手术区域。将动物置于保温屏障上。按上述方法（1.4）给予抗生素和镇痛剂。</li>
<li>通过最后肋骨插入点确定第12胸椎（T12）水平。从此点开始，沿T11、T10和T9椎体突起向头侧做皮肤切口。切开浅筋膜，穿过附着于这三个突起的上脊肌。</li>
<li>对T10椎体突起进行完全椎板切除（覆盖T12脊髓节段）。使用显微手术刀片或30号针头刺破硬脑膜，并沿T12脊髓纵向延长切口。在下方的蛛网膜下腔和软脑膜上做一小切口。</li>
<li>使用拉制的玻璃微导管，施加轻柔压力并配合显微镊子分离组织，双侧吸除T12脊髓组织。继续操作至脊髓的中间和腹侧部分，形成一个从背侧到腹侧、位于两侧脑膜之间的3 mm长空腔。</li>
<li>使用生理盐水浸湿的明胶海绵实现止血，随后更换为含软骨素酶ABC的浸湿明胶海绵。在损伤部位处理15分钟，每5分钟更换一次新的软骨素酶浸湿明胶海绵。</li>
<li>从Hank's溶液中取出外周神经节段。轻轻剥离神经节段近端4 mm处的外膜，裁剪适当长度，使其紧密嵌合于脊髓一侧的头端和尾端残端之间。将第二个神经节段并置于第一个移植节段旁，对接至脊髓的另一侧。用缝线将硬脑膜闭合并覆盖移植部位，再以一小片硅胶膜覆盖硬脑膜。</li>
<li>用4-0缝线逐层缝合肌肉，用伤口夹闭合皮肤切口。</li>
<li>将动物置于保温屏障上的暂养笼中，待其清醒且活动正常后，送回饲养笼。</li>
</ol>
第3天
<ol start="9">
<li>按上述方法（1.3）麻醉动物，剃毛并清洁预定手术区域。将动物置于保温屏障上，并按上述方法（1.4）给予抗生素和镇痛剂。剪开表层缝线，暴露移植物部位上方的硅胶膜。不要扰动移植物，而是暴露移植物远端的脊髓组织，使用带有拉制玻璃微管的汉密尔顿注射器，在移植物与脊髓交界处远端约1 mm的位置，向脊髓两侧各注射1μl的软骨素酶ABC。</li>
<li>用4-0缝线缝合浅层肌肉，用伤口夹闭合皮肤切口。将动物置于保温屏障上的暂养笼中，待其清醒且活动正常后，返回饲养笼。按照上述第5）和6）步骤进行电生理刺激与记录以及示踪剂标记。</li>
</ol>
8) 代表性结果
当该操作步骤得到优化时，外周神经节段将与宿主脊髓实现紧密整合。上行和下行的脊髓轴突将进入移植物，沿移植物长轴方向相对笔直地生长，并以大约每天1毫米的速度延伸至移植物的远端。如果已使用软骨素酶清除周围瘢痕组织中的抑制性蛋白聚糖，轴突在到达远端后将穿透相邻的脊髓组织。功能连接性的确定将依赖于电生理学和免疫细胞化学方法，检测脊髓神经元对移植物内轴突刺激所产生的反应。功能恢复的解剖学相关性将通过追踪已从神经移植物延伸回脊髓内部的轴突数量和长度来进行评估。

<ol><li>Houle, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+the+potential+for+chronically+injured+neurons+to+regenerate+axons+into+intraspinal+peripheral+nerve+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Demonstration of the potential for chronically injured neurons to regenerate axons into intraspinal peripheral nerve grafts.</a> Exp. Neurol. 113, 1-9 (1991).</li>
<li>Ye, J. H., Houle, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+the+chronically+injured+spinal+cord+with+neurotrophic+factors+can+promote+axonal+regeneration+from+supraspinal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Treatment of the chronically injured spinal cord with neurotrophic factors can promote axonal regeneration from supraspinal neurons.</a> Exp. Neurol. 143, 70-81 (1997).</li>
<li>Houle, J. D., Tom, V., Mayes, D., Wagoner, G., Phillips, N., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+an+autologous+peripheral+nerve+bridge+and+matrix+modification+by+chondroitinase+allows+robust+functional+regeneration+across+a+hemisection+lesion+of+the+adult+rat+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Combining an autologous peripheral nerve bridge and matrix modification by chondroitinase allows robust functional regeneration across a hemisection lesion of the adult rat spinal cord.</a> J. Neurosci. 26, 7405-7415 (2006).</li>
<li>Tom, V., Houle, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraspinal+microinjection+of+chondroitinase+ABC+following+injury+promotes+axonal+regeneration+out+of+a+peripheral+nerve+graft%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Intraspinal microinjection of chondroitinase ABC following injury promotes axonal regeneration out of a peripheral nerve graft.</a> Exp. Neurol. 211, 315-319 (2008).</li>
</ol>

<ol>
 <li>为了确保实验的可重复性，必须保证每只动物脊髓损伤的水平一致。因此，准确识别用于椎板切除术的相应椎骨突起至关重要。由于本研究采用的是半横断或全横断损伤模型，因此在损伤范围以及特定脊髓传导束是否受损或保留方面不存在任何不确定性。</li>
 <li>在移植前必须使外周神经预先发生变性，因为这一过程可启动对外周轴突的降解，从而为再生轴突的生长腾出空间；同时还能激活施万细胞，促使其产生多种神经营养因子，以支持轴突的向内生长。</li>
 <li>应将移植物切断端与脊髓组织进行牢固的初始对接（同时避免损伤移植物），以优化轴突进出移植物的生长效果。将外周神经移植物直接贴合于脊髓并用缝线固定，是该操作的关键步骤。</li>
 <li>使用软骨素酶修饰移植物周围细胞外基质是本实验的另一关键环节。脊髓损伤后形成的胶质瘢痕组织在结构和化学性质上均构成轴突生长的屏障。软骨素酶可降解瘢痕中具有抑制作用的蛋白聚糖成分，从而促进再生轴突延伸进入并越过移植物。</li>
 <li>本实验方法尚有多个可改进之处，以进一步增强轴突进出外周神经移植物的生长程度。我们正在尝试向移植物与宿主脊髓的对接部位递送神经营养因子，以促进受损轴突的再生反应。可通过注射病毒载体以提高局部因子的表达，或通过...

<table><tbody><tr><td>10-0 丝线缝合线</td><td>ArosSurgical</td><td>T5A10N10</td><td></td></tr><tr><td>6-0 丝线缝合线</td><td>McKesson</td><td>2693</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>McKesson</td><td>483549</td><td></td></tr><tr><td>cFos 抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7799</td><td></td></tr><tr><td>生物素化葡聚糖胺</td><td>Invitrogen</td><td>D7135</td><td></td></tr><tr><td>布托啡诺（0.3 mg/ml）</td><td>McKesson</td><td>12496075701</td><td></td></tr><tr><td>硫酸软骨素酶 ABC</td><td>Cape Cod 联合公司</td><td>100332-1A</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol</td><td>韦伯斯特兽医</td><td>07-805-9296</td><td></td></tr><tr><td>Hanks平衡盐溶液</td><td>Cellgro</td><td>21-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Henry Schein</td><td>209-1966</td><td></td></tr><tr><td>米歇尔伤口夹</td><td>Fine Science Tools</td><td>12040-02</td><td></td></tr><tr><td>Neurotrace 试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>N7167</td><td></td></tr><tr><td>真蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5891</td><td></td></tr><tr><td>Xenodine</td><td>韦伯斯特兽医</td><td>92201</td><td></td></tr><tr><td>热珠灭菌器</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>强制运动跑轮</td><td>Lafayette Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TreadScan 系统</td><td>巧妙的系统</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无限视野冲击装置</td><td>精密系统与仪器</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磁刺激设备</td><td>Magstim</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

联合外周神经移植与基质调控修复损伤的大鼠脊髓

Combining Peripheral Nerve Grafting and Matrix Modulation to Repair the Injured Rat Spinal Cord

脊髓损伤（SCI）会导致神经元死亡，运动和感觉神经纤维（轴突）通路中断，并破坏与大脑的通信。我们研究的目标之一是促进轴突再生，以恢复损伤部位两端的神经连接。为实现这一目标，我们开发了一种外周神经（PN）移植技术，即将坐骨神经节段直接置于受损脊髓断端之间，或用于在损伤区域形成桥接。与移植其他神经组织相比，该方法具有多项优势：可将再生轴突导向特定靶区，通过示踪技术可轻松确定再生轴突的数量和来源，移植段可用于电生理实验以评估与移植轴突相关的功能恢复，且可采用自体神经以降低移植物排斥的可能性。在本实验室中，我们已成功实施了自体移植（供体与受体为同一动物）和异体移植（供体与受体为不同动物），并获得了可比的结果。该方法已在急性与慢性损伤情况下均取得成功。然而，到达PN移植物远端的再生轴突常难以重新延伸进入脊髓，因此我们采用微注射软骨素酶以降解与SCI区域周围瘢痕组织相关的抑制性分子。同时，我们发现外源性提供生长因子和营养分子可促进轴突向脊髓内更长距离的再生。移植后数月，我们对脊髓损伤动物进行多种解剖学、行为学和电生理学检测，以评估其功能恢复情况。该实验方法已在多种脊髓损伤模型、不同损伤节段及不同物种（小鼠、大鼠和猫）中成功应用。重要的是，外周神经移植策略在促进急性和慢性损伤神经元再生方面均有效。

脊髓的创伤性损伤会中断与大脑的通信。为了恢复失去的连接，我们利用外周神经移植物为再生纤维提供基质，并结合神经营养因子和基质调节酶，以清除抑制性分子，促进长距离生长。

脊髓损伤（SCI）可导致神经元死亡，运动和感觉神经纤维（轴突）通路中断以及……

在将外周神经移植到脊髓损伤部位之前，需提前7至10天对PNG进行预变性处理。通过切断供体大鼠的胫神经分支来实现。颈髓第5节段（C5）半切术则通过吸引法完成。将PNG从供体大鼠取出，贴附于损伤腔的头侧壁，并通过将金线缝合至硬脑膜来固定。三周后，在C7水平制作背侧象限损伤，将浸有C-H-A-B-C的明胶海绵置入损伤腔内15分钟，以消化胶质瘢痕中的蛋白聚糖。两天后，在损伤部位附近微量注射C-H-A-B-C，并将PNG的远端贴附于背侧象限损伤处。您好，我是约翰·胡拉（John Hula），德雷塞尔大学医学院脊髓损伤研究中心的主任。我是来自胡拉实验室的维罗尼卡·汤姆（Veronica Tom）博士，这位是玛莎·米恩（Martha mean）。来自 Hula 实验室。今天我们将演示一种将外周神经节段移植到成年大鼠损伤脊髓中的手术方法。我们在实验室中采用该方法研究脊髓损伤后轴突的再生及功能恢复情况。好的，我们开始吧。进行显微外科手术前，需对手术台进行消毒，并将所有手术器械进行高压灭菌。准备好保温屏障，以及用于微血管止血的、体积小于2立方毫米的小块明胶海绵。准备好棉签、纱布垫和外科器械。在通过脚趾夹捏确认大鼠已完全麻醉后，将其放置于手术台上。根据随附文字方案中描述的无菌擦洗技术，剃除预定手术区域周围较大范围的毛发，并清洗手术部位。接下来，将大鼠置于加热板上，用吸入锥罩住其口鼻，并将异氟烷浓度降至3%，流速调至0.2升/分钟。通过皮下注射给予适当剂量的抗生素氨苄青霉素，通过肌肉注射给予镇痛药布托啡诺。外周神经（PN）应在切除前7至10天进行横断，以促进其发生变性，从而提供比新鲜神经制备更有利于轴突生长的环境。开始坐骨神经横断时，将动物侧卧放置。更换为无菌手套，并在手术区域周围铺上无菌手术巾。从股骨头至膝盖做一条直线切口，切口与股骨平行且距离股骨约三毫米，沿与皮肤切口相同的路线切开浅层的股二头肌，以暴露下方的股外侧肌。暴露股外侧肌后，使用剪刀在靠近膝关节处做一小切口，并沿切口向上朝股骨头方向延伸。用牵开器轻轻分离股外侧肌，直至观察到坐骨神经的胫神经和腓总神经分支并行于股骨走行。接着，沿这些神经分支向股骨头方向追踪，直至辨认出坐骨神经的主干。在坐骨神经分叉稍下方，使用精细镊子小心分离胫神经分支周围结缔组织或神经外膜。该分支为较粗大的一支。一旦分离出胫神经分支，将一根6-0丝线套入其中并结扎紧。使用显微剪刀横断结扎线附近的神经残端。将缝合线穿过股外侧肌并打结固定，以标记胫神经切断端的位置，便于后续识别。获取神经后，随后用6-0丝线缝合股外侧肌。然后，用6-0丝线缝合肱二头肌PMOs肌。最后，使用 Michelle 伤口夹关闭皮肤。关闭异氟烷气流，移除吸入式鼻罩。将动物置于带有热屏障的暂养笼中。将动物放回其饲养笼中。待其清醒并活跃后，7至10天后即可采集坐骨神经节段。开始移植时，将麻醉后的动物置于保温垫上。确认动物已完全麻醉后，取下伤口夹子并分开皮肤切口。由于皮肤应能轻易拉开而避免污染，因此可能无需预先剃毛。无需穿过毛发，直接切开浅层肌肉的缝合处以暴露股外侧肌，然后切开该肌肉的缝合处。沿缝合线追踪至胫神经的切断端，并将缝线从神经上移除。用精细镊子剥离胫神经一段15毫米长度的神经外膜，并横断该远端。取出神经节段并将其浸入无菌的Hank's平衡盐溶液中。现在我们已准备好进行下一步操作，即诱导脊髓损伤以进行周围神经（PN）移植，该移植可以是自体移植或异体移植。将麻醉后的大鼠置于保温装置上，并按照前文所述给予抗生素和镇痛药物，以诱导半横断（HEMI section）脊髓损伤。首先，定位枕骨切迹和明显的第二胸椎（T2）背侧椎体突起。沿这两个体表标志之间的全长做一切口。切开浅层斜方肌的正中线，并分离其下方的颈半棘肌。插入牵开器以保持肌肉分离。应从 C4、C5 和 C6 椎体的背侧椎板处切断深层上脊髓肌。使用 R 陪审员器械对 C5 节段进行部分椎板切除术，以暴露脊髓右侧全部区域及左侧中份区域。以明显的背侧静脉作为解剖标志，确定脊髓中线位置。接下来，使用微型手术刀片刺穿硬脑膜，并将切口延伸至第五颈椎脊髓节段。用拉制的玻璃微管在下方的蛛网膜下腔和软脑膜上做一小切口。利用轻柔的负压吸引，并配合显微镊分离组织，逐步吸除脊髓背侧右侧的组织。继续向脊髓的中间和腹侧部分操作，形成一个从背侧到腹侧、从中线到侧方脑膜完全贯通的长两毫米的空腔。将浸有生理盐水的明胶海绵置入半切（HEMI）损伤空腔中。为实现止血，从汉克溶液中取出先前采集的外周神经节段。轻轻触摸神经节段近端三毫米处的外膜，并将此端对准HEMI节段损伤腔的头侧壁。通过外膜使用10-0缝线将节段固定于硬脑膜上。然后缝合硬脑膜，覆盖移植物的植入端，将移植物夹在两片细胞弹性膜之间。将移植物置于C6、C7和T1椎体棘突旁，远端神经断端避免与脊髓或肌肉组织接触。用4-0缝线分层缝合肌肉，用伤口夹闭合皮肤切口。最后，将动物放入带有隔热垫的暂养笼中，并送回其原饲养笼。待动物清醒并恢复活动后，再生的轴突即使到达外周神经移植物的远端，也常常无法重新延伸进入脊髓。因此，我们采用微注射软骨素酶ABC降解损伤区域周围的瘢痕组织。在PN移植后21天开始进行此操作，首先确认动物已完全麻醉。然后移除伤口夹，并按照之前所示给予抗生素和镇痛剂。使用精细镊子和弹簧剪刀剪开表层缝线，暴露包裹神经移植物的弹性膜。小心地将神经从脑膜弹性膜中游离出来。将神经从手术区域牵开。在第七颈椎突右侧进行部分椎板切除术。使用显微手术刀片刺破脑膜，并通过抽吸在C7脊髓处制备一个1立方毫米的背侧象限损伤空腔。将浸有生理盐水的明胶海绵置入损伤空腔以实现止血。随后，用浸有软骨素酶nace的明胶海绵替换原来的明胶海绵。BC。每五分钟更换一次浸有软骨素的明胶海绵，对病灶部位处理15分钟。用羊膜包裹神经移植物的外部长度。用4-0缝线缝合浅层肌肉，用伤口夹闭合皮肤切口。将动物放入带有热屏障的暂养笼中，待其清醒并恢复活动后，将其放回原饲养笼。两天后，即外周神经移植术后第23天，对动物再次进行手术，向脊髓内微量注射硫酸软骨素酶NA。与之前相同，从麻醉动物身上移除伤口夹，并给予抗生素和镇痛剂。切开表层缝线，暴露包裹神经移植物的弹性膜。暴露颈七移植物植入部位时，避免扰动移植物本身。随后使用连接拉制玻璃毛细管的汉密尔顿注射器，将一微升软骨素酶 ABC 精准微量注射至脊髓右侧，注射位置约在移植物与脊髓对接处远端一毫米处。轻轻剥离神经段远端两毫米处的EUR，并将此端对准C七损伤腔。使用10-0缝线穿过神经外膜固定至硬脑膜。用4-0缝线缝合浅层肌肉，用伤口夹闭合皮肤切口。将动物放置在带有热屏障的暂养笼中，并在其恢复清醒且活跃后放回其原居住笼。当该操作流程优化后，外周神经节段将与宿主脊髓紧密整合，从而可观察到再生进入移植物的脊髓轴突。我们通过扩散填充法将生物素化葡聚糖胺（biotinylated dextran amine）或 BDA 分别用于上行和下行标记。脊髓轴突通常会进入移植物，并沿移植物长度方向以相对直线的方式生长，以每天约一毫米的速度延伸至移植物的远端。周围神经轴突可穿透相邻的脊髓组织。当使用软骨素NACE去除远端周围瘢痕组织中的抑制性蛋白聚糖后，经载体处理的样本中仅有极少数周围神经轴突延伸进入宿主组织。然而，如果远端界面用软骨素处理，则有显著更多的轴突从移植物中长出，重新支配脊髓。如图所示，在每只动物15至20个观察到轴突生长的切片中选取的一个代表性切片，该柱状图显示，在联合nace A BC处理后，轴突外向生长显著增加。通过电刺激移植物内的轴突，检测脊髓神经元上突触标志物的免疫化学反应，可用于评估移植物与宿主脊髓之间的功能连接性。该脊髓区域包含远端相邻部位，经免疫细胞化学染色显示生物素标记的葡聚糖胺（绿色）和突触标志物突触素（红色）。箭头指示两种标志物共定位的区域，表明部分从移植物中再生的纤维形成了功能性的突触连接。通过检测CFOs表达，也证实了移植物与脊髓神经元之间的功能性连接。在对移植物远端界面以外的宿主神经元进行突触刺激后，可在移植物同侧组织中观察到大量CFOs阳性神经元；而在更高倍镜下，移植物对侧组织中仅能观察到极少数CFOs阳性神经元。我们刚刚向您展示了如何准备脊髓损伤部位，以便移植外周神经移植物，从而促进脊髓损伤后的再生。进行此操作时，重要的是要记住在移植前确保有足够的神经长度，并使移植物与脊髓损伤部位紧密贴合。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

结合周边神经移植和矩阵调制修复受伤的大鼠脊髓

取一只麻醉后右侧坐骨神经暴露且完整的实验大鼠，该神经支配后肢的运动和感觉功能。切除一段神经，形成缺损，切断神经元轴突，阻断信号传导。切断的远端轴突会退化，导致特化的神经修复细胞或施万细胞脱离。将一种带有微通道的柔软管状仿生导电神经支架缝合至神经两端切断处的外层——神经外膜上。在神经末端附近植入成对电极，并将导线穿过皮肤下方引至颈部后方。施加持续的电刺激，向支架输送温和的脉冲。来自变性远端的施万细胞迁移进入支架，并沿微通道排列。这些细胞释放生长因子，刺激轴突近端的延伸。当轴突延伸时，施万细胞以富含脂质的髓鞘膜包裹它们，从而恢复信号传导。这展示了支架和电刺激在神经修复中的潜力。...

使用仿生导电支架结合电刺激进行神经修复

来源：Zweckberger, K., et al. 神经前体细胞与自组装肽在实验性颈段脊髓损伤中的协同应用。 J. Vis. Exp.

在大鼠模型中注射自组装肽和神经前体细胞以修复脊髓损伤

来源： Svientek, S. R., 等．成年大鼠复合再生性外周神经接口（C-RPNI）的制备． J. Vis. Exp.

构建大鼠神经损伤模型中的复合再生性外周神经接口

含有生长因子的纤维蛋白基质被用于将移植的神经干细胞固定在完全性脊髓横断损伤部位。移植的细胞完全填充了损伤空腔，并分化为多种神经细胞类型，包括能够向宿主脊髓长距离延伸轴突的神经元。...

严重脊髓损伤后使用纤维蛋白与生长因子混合物促进神经干细胞的存活与分化

采用自组装肽（SAP）和神经前体细胞（NPC）联合生长因子治疗颈段脊髓损伤，是一种促进神经再生与功能恢复的有前景的策略。本研究建立了颈段脊髓损伤的 contusion/compression 动脉瘤夹大鼠模型，并采用 SAP 注射联合 NPC...

神经前体细胞与自组装肽在实验性颈段脊髓损伤中的协同应用

严重的脊髓损伤常导致组织缺损。本文描述了两种成功桥接此类缺损的方法，可通过在急性损伤后以及完全脊髓横断五周后植入机械微连接系统，促进大鼠的组织适应、再生反应及功能改善。...

急性与慢性损伤后修复脊髓大范围组织缺损的实验策略

本文介绍了一种技术：在脊髓完全横断后，将一个中空导管插入脊髓残端之间，并填充施万细胞（SCs）和可注射的基底膜基质，以桥接断端并促进轴突跨越缺损区域再生。...

将雪旺细胞移植至聚偏氟乙烯-三氟乙烯导管内以桥接大鼠横断脊髓残端促进轴突再生跨越缺损

以下手稿描述了一种用于开发生物性闭环神经反馈系统的新方法，该系统称为复合再生性外周神经接口（C-RPNI）。该结构能够与外周神经整合，以放大传出运动信号，同时提供传入感觉反馈。...

成年大鼠复合再生性外周神经接口（C-RPNI）的制备

本手稿提供了一种用于开发生物性外周神经接口的创新方法，该接口称为肌袖再生性外周神经接口（Muscle Cuff Regenerative Peripheral Nerve Interface,...

用于放大完整外周神经信号的肌袖状再生性外周神经接口

用于电生理研究的新生小鼠脊髓分离示例。...

脊髓电生理学

了解利用周围神经移植结合神经营养因子和基质调节酶修复大鼠脊髓损伤的方法。该技术通过降解胶质瘢痕促进轴突再生，为神经再生医学研究提供重要实验模型。

联合外周神经移植与基质调控修复损伤的大鼠脊髓

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