联合外周神经移植与基质调控修复损伤的大鼠脊髓

在将外周神经移植到脊髓损伤部位之前，需提前7至10天对PNG进行预变性处理。通过切断供体大鼠的胫神经分支来实现。颈髓第5节段（C5）半切术则通过吸引法完成。

将PNG从供体大鼠取出，贴附于损伤腔的头侧壁，并通过将金线缝合至硬脑膜来固定。三周后，在C7水平制作背侧象限损伤，将浸有C-H-A-B-C的明胶海绵置入损伤腔内15分钟，以消化胶质瘢痕中的蛋白聚糖。两天后，在损伤部位附近微量注射C-H-A-B-C，并将PNG的远端贴附于背侧象限损伤处。

您好，我是约翰·胡拉（John Hula），德雷塞尔大学医学院脊髓损伤研究中心的主任。我是来自胡拉实验室的维罗尼卡·汤姆（Veronica Tom）博士，这位是玛莎·米恩（Martha mean）。

来自 Hula 实验室。今天我们将演示一种将外周神经节段移植到成年大鼠损伤脊髓中的手术方法。我们在实验室中采用该方法研究脊髓损伤后轴突的再生及功能恢复情况。

好的，我们开始吧。进行显微外科手术前，需对手术台进行消毒，并将所有手术器械进行高压灭菌。准备好保温屏障，以及用于微血管止血的、体积小于2立方毫米的小块明胶海绵。

准备好棉签、纱布垫和外科器械。在通过脚趾夹捏确认大鼠已完全麻醉后，将其放置于手术台上。根据随附文字方案中描述的无菌擦洗技术，剃除预定手术区域周围较大范围的毛发，并清洗手术部位。

接下来，将大鼠置于加热板上，用吸入锥罩住其口鼻，并将异氟烷浓度降至3%，流速调至0.2升/分钟。通过皮下注射给予适当剂量的抗生素氨苄青霉素，通过肌肉注射给予镇痛药布托啡诺。外周神经（PN）应在切除前7至10天进行横断，以促进其发生变性，从而提供比新鲜神经制备更有利于轴突生长的环境。

开始坐骨神经横断时，将动物侧卧放置。更换为无菌手套，并在手术区域周围铺上无菌手术巾。从股骨头至膝盖做一条直线切口，切口与股骨平行且距离股骨约三毫米，沿与皮肤切口相同的路线切开浅层的股二头肌，以暴露下方的股外侧肌。

暴露股外侧肌后，使用剪刀在靠近膝关节处做一小切口，并沿切口向上朝股骨头方向延伸。用牵开器轻轻分离股外侧肌，直至观察到坐骨神经的胫神经和腓总神经分支并行于股骨走行。接着，沿这些神经分支向股骨头方向追踪，直至辨认出坐骨神经的主干。

在坐骨神经分叉稍下方，使用精细镊子小心分离胫神经分支周围结缔组织或神经外膜。该分支为较粗大的一支。一旦分离出胫神经分支，将一根6-0丝线套入其中并结扎紧。

使用显微剪刀横断结扎线附近的神经残端。将缝合线穿过股外侧肌并打结固定，以标记胫神经切断端的位置，便于后续识别。

获取神经后，随后用6-0丝线缝合股外侧肌。然后，用6-0丝线缝合肱二头肌PMOs肌。

最后，使用 Michelle 伤口夹关闭皮肤。关闭异氟烷气流，移除吸入式鼻罩。将动物置于带有热屏障的暂养笼中。

将动物放回其饲养笼中。待其清醒并活跃后，7至10天后即可采集坐骨神经节段。开始移植时，将麻醉后的动物置于保温垫上。

确认动物已完全麻醉后，取下伤口夹子并分开皮肤切口。由于皮肤应能轻易拉开而避免污染，因此可能无需预先剃毛。无需穿过毛发，直接切开浅层肌肉的缝合处以暴露股外侧肌，然后切开该肌肉的缝合处。

沿缝合线追踪至胫神经的切断端，并将缝线从神经上移除。用精细镊子剥离胫神经一段15毫米长度的神经外膜，并横断该远端。取出神经节段并将其浸入无菌的Hank's平衡盐溶液中。

现在我们已准备好进行下一步操作，即诱导脊髓损伤以进行周围神经（PN）移植，该移植可以是自体移植或异体移植。将麻醉后的大鼠置于保温装置上，并按照前文所述给予抗生素和镇痛药物，以诱导半横断（HEMI section）脊髓损伤。首先，定位枕骨切迹和明显的第二胸椎（T2）背侧椎体突起。

沿这两个体表标志之间的全长做一切口。切开浅层斜方肌的正中线，并分离其下方的颈半棘肌。插入牵开器以保持肌肉分离。

应从 C4、C5 和 C6 椎体的背侧椎板处切断深层上脊髓肌。使用 R 陪审员器械对 C5 节段进行部分椎板切除术，以暴露脊髓右侧全部区域及左侧中份区域。以明显的背侧静脉作为解剖标志，确定脊髓中线位置。

接下来，使用微型手术刀片刺穿硬脑膜，并将切口延伸至第五颈椎脊髓节段。用拉制的玻璃微管在下方的蛛网膜下腔和软脑膜上做一小切口。利用轻柔的负压吸引，并配合显微镊分离组织，逐步吸除脊髓背侧右侧的组织。

继续向脊髓的中间和腹侧部分操作，形成一个从背侧到腹侧、从中线到侧方脑膜完全贯通的长两毫米的空腔。将浸有生理盐水的明胶海绵置入半切（HEMI）损伤空腔中。为实现止血，从汉克溶液中取出先前采集的外周神经节段。

轻轻触摸神经节段近端三毫米处的外膜，并将此端对准HEMI节段损伤腔的头侧壁。通过外膜使用10-0缝线将节段固定于硬脑膜上。然后缝合硬脑膜，覆盖移植物的植入端，将移植物夹在两片细胞弹性膜之间。

将移植物置于C6、C7和T1椎体棘突旁，远端神经断端避免与脊髓或肌肉组织接触。用4-0缝线分层缝合肌肉，用伤口夹闭合皮肤切口。

最后，将动物放入带有隔热垫的暂养笼中，并送回其原饲养笼。待动物清醒并恢复活动后，再生的轴突即使到达外周神经移植物的远端，也常常无法重新延伸进入脊髓。因此，我们采用微注射软骨素酶ABC降解损伤区域周围的瘢痕组织。

在PN移植后21天开始进行此操作，首先确认动物已完全麻醉。然后移除伤口夹，并按照之前所示给予抗生素和镇痛剂。使用精细镊子和弹簧剪刀剪开表层缝线，暴露包裹神经移植物的弹性膜。

小心地将神经从脑膜弹性膜中游离出来。将神经从手术区域牵开。在第七颈椎突右侧进行部分椎板切除术。

使用显微手术刀片刺破脑膜，并通过抽吸在C7脊髓处制备一个1立方毫米的背侧象限损伤空腔。将浸有生理盐水的明胶海绵置入损伤空腔以实现止血。随后，用浸有软骨素酶nace的明胶海绵替换原来的明胶海绵。

BC。每五分钟更换一次浸有软骨素的明胶海绵，对病灶部位处理15分钟。用羊膜包裹神经移植物的外部长度。用4-0缝线缝合浅层肌肉，用伤口夹闭合皮肤切口。

将动物放入带有热屏障的暂养笼中，待其清醒并恢复活动后，将其放回原饲养笼。两天后，即外周神经移植术后第23天，对动物再次进行手术，向脊髓内微量注射硫酸软骨素酶NA。与之前相同，从麻醉动物身上移除伤口夹，并给予抗生素和镇痛剂。

切开表层缝线，暴露包裹神经移植物的弹性膜。暴露颈七移植物植入部位时，避免扰动移植物本身。随后使用连接拉制玻璃毛细管的汉密尔顿注射器，将一微升软骨素酶 ABC 精准微量注射至脊髓右侧，注射位置约在移植物与脊髓对接处远端一毫米处。

轻轻剥离神经段远端两毫米处的EUR，并将此端对准C七损伤腔。使用10-0缝线穿过神经外膜固定至硬脑膜。用4-0缝线缝合浅层肌肉，用伤口夹闭合皮肤切口。

将动物放置在带有热屏障的暂养笼中，并在其恢复清醒且活跃后放回其原居住笼。当该操作流程优化后，外周神经节段将与宿主脊髓紧密整合，从而可观察到再生进入移植物的脊髓轴突。我们通过扩散填充法将生物素化葡聚糖胺（biotinylated dextran amine）或 BDA 分别用于上行和下行标记。

脊髓轴突通常会进入移植物，并沿移植物长度方向以相对直线的方式生长，以每天约一毫米的速度延伸至移植物的远端。周围神经轴突可穿透相邻的脊髓组织。当使用软骨素NACE去除远端周围瘢痕组织中的抑制性蛋白聚糖后，经载体处理的样本中仅有极少数周围神经轴突延伸进入宿主组织。

然而，如果远端界面用软骨素处理，则有显著更多的轴突从移植物中长出，重新支配脊髓。如图所示，在每只动物15至20个观察到轴突生长的切片中选取的一个代表性切片，该柱状图显示，在联合nace A BC处理后，轴突外向生长显著增加。通过电刺激移植物内的轴突，检测脊髓神经元上突触标志物的免疫化学反应，可用于评估移植物与宿主脊髓之间的功能连接性。

该脊髓区域包含远端相邻部位，经免疫细胞化学染色显示生物素标记的葡聚糖胺（绿色）和突触标志物突触素（红色）。箭头指示两种标志物共定位的区域，表明部分从移植物中再生的纤维形成了功能性的突触连接。通过检测CFOs表达，也证实了移植物与脊髓神经元之间的功能性连接。在对移植物远端界面以外的宿主神经元进行突触刺激后，可在移植物同侧组织中观察到大量CFOs阳性神经元；而在更高倍镜下，移植物对侧组织中仅能观察到极少数CFOs阳性神经元。

我们刚刚向您展示了如何准备脊髓损伤部位，以便移植外周神经移植物，从而促进脊髓损伤后的再生。进行此操作时，重要的是要记住在移植前确保有足够的神经长度，并使移植物与脊髓损伤部位紧密贴合。以上就是全部内容。

感谢观看，祝您的实验顺利。