Name: 荧光原位杂交（FISH）的议定书在人类精子 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 19 s
Description: 学习荧光原位杂交技术用于人类精子染色体分析，检测13、18、21、X和Y染色体非整倍体。该方法为男性不育症的临床诊断提供可靠的遗传风险评估工具。

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本工作由加泰罗尼亚自治区政府（2005-SGR00437）资助。作者感谢 J. Blanco 和 F. Vidal 的指导与鼓励，以及 J. Lucas 提供的技术支持。

一、样品处理与细胞固定
<ol>
<li>将精液样本置于室温下的无菌容器中静置 20 分钟，直至液化。</li>
<li>将样本转移至离心管中，在 1000g 条件下离心 5 分钟。</li>
<li>使用巴斯德吸管轻轻移除并弃去上清液。</li>
<li>逐滴加入预热至 37°C 的低渗溶液（0.075M KCl），同时在涡旋振荡器上混匀，最终体积为 10 ml。</li>
<li>将离心管置于 37°C 水浴中孵育 30 分钟。</li>
<li>在 1000g 条件下离心 5 分钟。小心倾倒弃去上清液，避免扰动沉淀物。</li>
<li>将沉淀重悬后，逐滴加入新鲜配制的卡诺固定液（甲醇:乙酸 = 3:1），同时在涡旋振荡器上混匀，最终体积为 8 ml。</li>
<li>根据需要重复步骤 6 和 7，直至获得白色沉淀。</li>
<li>逐滴加入新鲜配制的甲醇:乙酸（3:1）溶液，调整最终体积至获得良好细胞铺展所需的细胞浓度（对于沉淀较少的样本，仅需少量滴加；而对于回收精子较多的样本，最终体积可达 1–2 ml）。可通过将重悬的样本滴加至未磨砂载玻片上，在相差显微镜下观察制备测试片。这有助于检查所获得的细胞分散情况，并可在后续制片中进行调整。</li>
<li>制片时，从至少 40 cm 的高度将两到三滴细胞悬液滴加至未磨砂载玻片中央（载玻片此前应保存于 -20°C 的甲醇中以去除油脂）。为便于在整个实验流程中定位样本，使用金刚石笔在载玻片的另一侧标记出精子涂片区域。</li>
<li>将载玻片在 -20°C 下保存至少 24 小时。 
注意：在混匀过程中逐滴加入甲醇:乙酸（3:1）是防止精子聚集形成团块的关键步骤。</li>
</ol>
II. 去浓缩
<ol>
<li>存放于 -20°C 的载玻片必须解冻后方可继续操作（将其置于室温下）。</li>
<li>将载玻片依次放入两个盛有 2 倍浓度的氯化钠-柠檬酸钠溶液（2xSSC）的考普林瓶中，每个考普林瓶中孵育 3 分钟。</li>
<li>将载玻片依次在系列乙醇溶液中洗涤，每个考普林瓶中处理 2 分钟。依次使用 70% 乙醇、90% 乙醇，最后用 100% 乙醇。随后将载玻片置于室温下干燥。</li>
<li>将载玻片放入二硫苏糖醇溶液（1,4-二硫苏糖醇 5 mM、1% Triton X-100、2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇 50 mM）中，在 37°C 孵育箱中孵育，以解聚染色质。该试剂通过断裂精子细胞核中鱼精蛋白的二硫键，使 DNA 解链。此步骤极为关键，因为精子细胞核中的 DNA 高度压缩。载玻片在二硫苏糖醇溶液（DTT）中的孵育时间需根据样本对此试剂的反应性进行调整。通常孵育时间约为 8 分钟，但可根据情况在 2 至 15 分钟之间调整。</li>
<li>立即把载玻片转移至两个盛有 2xSSC 溶液的连续考普林瓶中，每个考普林瓶中孵育 3 分钟。</li>
<li>继续将载玻片依次放入盛有系列乙醇溶液的考普林瓶中洗涤，每个考普林瓶中处理 2 分钟（70%、90% 和 100% 乙醇）。将载玻片置于室温下自然干燥。 
注意：DTT 处理时间过长会导致荧光原位杂交（FISH）信号弥散，而处理时间过短则可能导致部分信号缺失。</li>
</ol>
三、杂交
<ol>
<li>将载玻片放入盛有甲酰胺溶液（70% 甲酰胺/2xSSC）的考普林瓶中，在73°C下孵育5分钟，以使精子DNA变性。</li>
<li>将载玻片依次转移至各考普林瓶中的乙醇溶液中，每个浓度乙醇溶液中浸泡1分钟（依次为70%、85%，最后为100%）。随后将载玻片置于室温下自然干燥。</li>
<li>取5 µL相应的即用型探针混合液，直接加至15x15盖玻片上（AneuVysion检测多色探针组：CEP 18/X/Y 或 LSI 13/21）。</li>
<li>如视频所示，小心地将载玻片覆盖在盖玻片上，使目标区域与探针混合液充分接触，然后用橡胶胶水密封。</li>
<li>将载玻片放入预热至37°C的杂交仪（HYBrite™）中，在37°C下孵育6–24小时。 
注：精子样本的变性步骤是必需的，而探针是否需要变性则由制造商决定。本实验所用探针混合液为即用型，无需进行探针变性处理。 探针混合液的用量需根据杂交区域的大小进行调整。</li>
</ol>
IV. 杂交后洗涤
<ol>
<li>从杂交室中取出载玻片。</li>
<li>去除橡胶胶水，轻轻侧向滑动并小心取出盖玻片。</li>
<li>为消除非特异性杂交信号，将载玻片置于盛有预热至73°C的0.4xSSC/0.3%NP-40溶液的柯氏瓶（coplin jar）中，孵育2分钟。</li>
<li>将载玻片转移至室温下的2xSSC/0.1%NP-40洗涤液中，洗涤1分钟。随后让载玻片在室温下自然干燥。</li>
<li>在目标区域加入复染试剂（对于18×18的盖玻片，用量为8 µL）。最常用的试剂为4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，Vysis Inc.）。</li>
<li>如视频所示，用盖玻片覆盖杂交区域（为保护杂交结果，可用指甲油封固盖玻片）。</li>
<li>将完成杂交的载玻片置于-20°C避光保存，直至后续分析。在此条件下，载玻片可保存长达12个月，而荧光信号强度无明显衰减。 
注意：过高的温度或过长的洗涤时间可能导致部分信号丢失，而相反条件则可能无法有效去除非特异性探针杂交信号。 
所加复染试剂的体积需根据杂交区域的大小进行调整。</li>
</ol>
V. 可视化
可使用配备DAPI/Texas Red/FITC三通道滤光片以及Aqua、FITC和Texas Red单通道滤光片的落射荧光显微镜对制备样品进行观察。精子细胞核的正确评估必须遵循标准评估标准1。
与X、Y和18号染色体探针杂交的标本应显示这三条染色体的信号。每个正常的精子必须显示一个蓝色信号（对应18号染色体），以及一个绿色信号（含X染色体的精子）或一个红色信号（含Y染色体的精子）。
在使用13号和21号染色体探针进行杂交的制备过程中，每个正常的精子应能区分出13号染色体的绿色信号和21号染色体的红色信号。

<ol><li>Blanco, J., Egozcue, J., Vidal, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+chromosome+21+disomy+in+human+spermatozoa+as+determined+by+fluorescent+in-situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Incidence of chromosome 21 disomy in human spermatozoa as determined by fluorescent in-situ hybridization.</a> Hum. Reprod. 11, 722-726 (1996).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了如何处理人类精液样本以获得精子FISH制片。通过本方案，可分析男性配子中的染色体异常。精子非整倍体筛查既可用于基础研究，也可用于为不育男性提供生殖咨询。尽管在临床诊断中主要研究的染色体为X、Y、13、18和21号染色体，但市场上也有针对多种其他染色体和位点的商用探针，均可用于此类实验。

<table><tbody><tr><td>1,4-二硫苏糖醇（DTT）</td><td>材料</td><td>罗氏集团</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇</td><td>材料</td><td>罗氏集团</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>材料</td><td>默克 &amp;amp; Co., Inc.</td><td>100.063</td><td></td></tr><tr><td>AneuVysion&amp;#174; 多色DNA探针试剂盒&lt;ul style=&quot;内边距：2像素；&quot;&gt;&lt;李&gt;20x 盐水-柠檬酸钠&lt;/li&gt;&lt;李&gt;4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI II）&lt;/li&gt;&lt;李&gt;CEP 18/X/Y DNA探针&lt;/li&gt;&lt;李&gt;NP-40&lt;/li&gt;&lt;李&gt;LSI 13/21 DNA探针&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td><td>材料</td><td>Vysis 公司</td><td>32-161075 &lt;ul style=&quot;内边距：2像素；&quot;&gt;&lt;李&gt;30-805850&lt;/li&gt;&lt;李&gt;30-804941 &lt;/li&gt;&lt;李&gt;30-171077&lt;/li&gt;&lt;李&gt;30-804820&lt;/li&gt;&lt;李&gt;30-171078&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5804R</td><td>工具</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心管</td><td>材料</td><td>Nalge Nunc International</td><td>347856</td><td></td></tr><tr><td>玻璃 Coplin 瓶</td><td>材料</td><td>巴洛世界科学公司</td><td>赫伦达尔（ZCT278）</td><td></td></tr><tr><td>塑料 Coplin 瓶</td><td>材料</td><td>Deltalab</td><td>191087</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片（15×15）</td><td>材料</td><td>Knittel Glaser</td><td>4600115</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片（18×18）</td><td>材料</td><td>克尼特尔-格拉泽</td><td>4600118</td><td></td></tr><tr><td>金刚石笔</td><td>材料</td><td>Hammacher</td><td>335117010</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>材料</td><td>默克 &amp;amp; Co., Inc.</td><td>100.983</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>材料</td><td>罗氏集团</td><td>11814320001</td><td></td></tr><tr><td>冷冻机</td><td>工具</td><td>Zanussi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>手套</td><td>材料</td><td>Sanyo</td><td>101/3300</td><td></td></tr><tr><td>HYBrite&amp;#8482;</td><td>工具</td><td>Vysis 公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>浸油</td><td>材料</td><td>奥林巴斯株式会社</td><td>35505</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>工具</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>材料</td><td>默克 &amp;amp; Co., Inc.</td><td>106.009</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器</td><td>材料</td><td>实验室系统</td><td>Finnpipette（4500000）</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器更换吸头</td><td>材料</td><td>达斯实验室</td><td>16-2001</td><td></td></tr><tr><td>指甲油</td><td>材料</td><td>Quo-cosmetics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>奥林巴斯BX60落射荧光显微镜</td><td>工具</td><td>奥林巴斯株式会社</td><td></td><td>配备DAPI/Texas Red/FITC三通道滤光片，以及Aqua、FITC和Texas Red单通道滤光片。</td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>材料</td><td>鲁比劳</td><td>211.0230</td><td></td></tr><tr><td>相差显微镜</td><td>工具</td><td>尼康仪器公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塑料移液管（3 ml）</td><td>材料</td><td>Deltalab</td><td>200007</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>材料</td><td>Fluka</td><td>60128</td><td></td></tr><tr><td>橡胶水泥</td><td>材料</td><td>最佳测试</td><td></td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>材料</td><td>Knittel Glaser</td><td>4520022</td><td></td></tr><tr><td>载玻片保存盒</td><td>材料</td><td>Deltalab</td><td>19276.1</td><td></td></tr><tr><td>无菌容器</td><td>材料</td><td>Deltalab</td><td>409726</td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>材料</td><td>PentaFerte</td><td>002022300</td><td></td></tr><tr><td>温度计</td><td>材料</td><td>康马克仪器公司</td><td>KM12</td><td></td></tr><tr><td>三蒸水</td><td>材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>材料</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>材料</td><td>B. Braun Medical</td><td>Aesculap (BD224R)</td><td></td></tr><tr><td>垂直层流 &lt;em&gt;超净工作台&lt;/em&gt;</td><td>工具</td><td>Burdinola</td><td>OR-ST 1500</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>工具</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB15012</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>工具</td><td>Raypa&amp;#174;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

荧光 原位 人类精子中的荧光原位杂交（fish）实验方案

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

非整倍体是人类中最常见的染色体异常。这些异常大多源于父母生殖过程中减数分裂时发生的错误。在人类男性中，这些错误可导致产生具有染色体数目异常的精子，从而增加将此类异常遗传给后代的风险。
因此，精子细胞核荧光原位杂交（FISH）技术已成为临床诊断中广泛采用的一种实验方案。该方法可评估寻求遗传性生殖咨询的患者其配子中染色体数目异常的频率。
迄今为止，精子FISH分析中最常检测的染色体包括X、Y、13、18和21号染色体。
本视频文章逐步介绍了如何处理和固定人类精液样本，如何使精子染色质去凝集和变性，如何制备精子FISH样本，以及如何在显微镜下观察结果。文中对最关键的步骤给出了特别说明，以帮助获得最佳实验结果。

本视频文章逐步介绍了如何处理精液样本，以在人类精子上获得高质量的荧光原位杂交结果。所获得的样本可用于临床诊断背景下的非整倍体筛查。

荧光 原位 人类精子中的荧光原位杂交（FISH）实验方案

非整倍体是人类中最常见的染色体异常。这些异常大多源于配子发生过程中减数分裂的错误……

人类精子细胞核中的荧光原位杂交技术方案已广泛应用于临床诊断领域。该方法的应用之一是精子倍性筛查。在为不育男性提供生殖建议时，这类个体中染色体数目异常的发生率高于一般人群，且常表现出异常的精液参数。这表示将这些异常遗传给后代的风险增加。今天我们将演示针对去浓缩精子细胞核的荧光原位杂交实验方案，用于分析染色体13、18、21、X和Y。样本采集后，应于室温下静置20分钟，直至精液液化。实验开始时，需将样本转移至离心管中。实验第一部分所用的溶液为37摄氏度预热的高渗溶液，以及甲醇与乙酸按3:1比例配制的溶液。这些溶液必须新鲜配制。然后将样品在1000 ×g 条件下离心5分钟。现在，轻轻移除上清液，并逐滴加入高渗溶液，直至总体积约为10毫升。此离心管必须在37摄氏度下保持30分钟，然后再次离心样品。离心会使精子细胞聚集在离心管底部，从而允许我们用甲醇替换低渗溶液。必须重复进行乙酸离心操作，以更换甲醇-乙酸溶液，直至获得白色沉淀物为止。当出现白色沉淀时，需加入更多甲醇-乙酸溶液。最终体积应根据后续实验所需的细胞分散程度进行调整。最后一步是将固定好的样品滴加到保存在-20 °C甲醇中的Reed载玻片上，以制备展片。为便于后续观察精子展片的特定区域，可在载玻片的另一侧使用金刚石笔标记该区域。一旦确认细胞分散效果理想，载玻片应于-20 °C至少保存24小时。在开始实验方案之前，本实验部分将使用生理盐水柠檬酸钠溶液、乙醇系列、DRE、胎牛和fide。载玻片解冻后，需将固定的样品浸入两个连续的共平面玻璃瓶中，每个瓶内含有两倍浓度的SSC溶液，以进行洗涤和脱水处理。每个浓度的乙醇缸中需浸泡三分钟。然后，载玻片必须按照浓度递增的顺序，依次浸入各乙醇缸中，每缸浸泡两分钟。至此，为了继续后续步骤，载玻片必须彻底干燥。由于精子细胞核中的DNA高度压缩，因此在变性之前必须先解聚染色质。这可以通过在37°C下使用DTT溶液实现。该试剂的作用机制是断裂精子细胞核中使DNA盘绕的鱼精蛋白之间的二硫键。载玻片在DTT溶液中的孵育时间必须根据精液样本对该试剂的反应性进行调整。通常约为八分钟，但也可在两到十五分钟之间。在此时间后，必须立即将载玻片转移至两倍浓度的 SSC 溶液中浸泡三分钟，再重复一次，持续另外三分钟，随后在每个乙醇梯度瓶中各浸泡两分钟。为了进行探针杂交，必须使用单链 DNA。这需要在加入探针前进行变性处理，即在 73 摄氏度的前体溶液中孵育五分钟。为完成载玻片处理，最后需将载玻片浸入乙醇溶液中进行最终转移，每个梯度瓶中浸泡一分钟。随后，载玻片即可用于临床诊断中的FISH研究。最常分析的染色体包括性染色体以及13、18和21号染色体。为了分析这些染色体，我们将使用来自vices的多色DNA探针试剂盒。其中包含一个试剂瓶，内含针对X、Y和18号染色体的α卫星区域的探针组合，分别以绿色、亮蓝色标记；另一个试剂瓶内含针对13号和21号染色体的探针组合，分别以绿色和橙色标记。所添加探针混合物的体积需根据拟杂交区域的大小而定，以15×15盖玻片为参考，5 µL体积已足够。两种探针混合物均已预先在杂交缓冲液中变性，便于直接使用，因此可直接添加至去凝聚并已变性的载玻片上。此外，还有多种商业化的探针可用于多种染色体及Loki，这些探针亦可用于此类实验。然而，通常情况下，这些探针在加入靶标样本前需要进行预先变性处理。在这些情况下，遵循制造商的说明即可。靶向区域必须用盖玻片覆盖，并用橡胶胶水密封。然后将玻片放入预热至 37°C 的杂交 chamber 中，在该温度下孵育 6 至 24 小时。在实验方案的最后阶段，我们将使用由不同浓度的氯化钠柠檬酸钠溶液和去污剂NP-40配制的这两种洗涤液。孵育结束后，可将载玻片从杂交盒中取出，去除橡胶胶水，然后小心地取下盖玻片。如图所示，将载玻片浸入第一种洗涤液中，该溶液已预热至 73°C，浸泡时间为两分钟。随后将载玻片转移至室温下的第二种洗涤液中，继续洗涤一分钟。这两次洗涤有助于消除非特异性杂交信号。完成这两步洗涤后，需等待载玻片完全干燥，以结束本实验方案的最后一步。此时需加入一种复染试剂，以利于观察细胞的细胞核。其中最常用的试剂之一是 DAPI。所加入的试剂体积必须根据杂交区域的大小进行调整，以18×18盖玻片为参考标准。使用 8 微升的 DPI 已足够。可用指甲油封固盖玻片，此时样品即可用于观察。否则，可将样品在 -20 °C 下保存，直至后续分析。我们将用于观察的显微镜是配备三波段滤光片的奥林巴斯BX 60落射荧光显微镜，该滤光片适用于dpi、Texas Red和FITC，同时配有用于Aqua FITC和Texas Red的单波段滤光片。通过三波段滤光片，可观察到与X、Y及18号染色体杂交后产生的这三条染色体的荧光信号。使用Aqua单波段滤光片时，仅能观察到18号染色体的荧光信号。在每一个正常的精子细胞中，我们应观察到一个此类信号。然而，当仅使用单通道滤光片检测FITC时，部分精子显示出对应于X染色体的荧光绿色信号。缺乏绿色信号的精子应显示Y染色体的红色信号，该信号可通过Texas red滤光片特异性地观察到。通过三通道滤光片观察1321杂交信号，我们能够区分这两种染色体的信号。绿色信号对应于13号染色体，可使用FITC的单波段滤光片进行特异性观察。Texas Red的单波段滤光片可使我们特异性观察21号染色体的信号。所有正常的精子应在这两个探针中各显示一个信号。综上所述，以下是该实验方案的主要步骤。再次强调，固定过程应准确操作，通过逐滴添加甲醇-冰醋酸溶液，以获得高质量的展片。为避免在去凝聚过程中形成精子聚集体，DTT溶液中的孵育时间必须根据精液样本对该试剂的反应性进行调整。精子暴露于DTT的时间过长会导致实验结束时信号弥散，而暴露时间不足则会导致探针完全无法杂交，部分信号缺失。精子样本的变性步骤是必需的，而探针的变性条件则必须根据制造商的说明进行调整。必须严格控制杂交后两次洗涤的时间和温度。较高的温度或过长的洗涤时间可能导致部分信号丢失，而相反条件则无法消除非特异性信号。最后，使用配备适当特异性滤光片的落射荧光显微镜对于良好的信号观察和解读至关重要。以上即为全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利。

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