荧光 原位 人类精子中的荧光原位杂交（FISH）实验方案

人类精子细胞核中的荧光原位杂交技术方案已广泛应用于临床诊断领域。该方法的应用之一是精子倍性筛查。在为不育男性提供生殖建议时，这类个体中染色体数目异常的发生率高于一般人群，且常表现出异常的精液参数。

这表示将这些异常遗传给后代的风险增加。今天我们将演示针对去浓缩精子细胞核的荧光原位杂交实验方案，用于分析染色体13、18、21、X和Y。样本采集后，应于室温下静置20分钟，直至精液液化。实验开始时，需将样本转移至离心管中。

实验第一部分所用的溶液为37摄氏度预热的高渗溶液，以及甲醇与乙酸按3:1比例配制的溶液。这些溶液必须新鲜配制。然后将样品在1000 ×g 条件下离心5分钟。

现在，轻轻移除上清液，并逐滴加入高渗溶液，直至总体积约为10毫升。此离心管必须在37摄氏度下保持30分钟，然后再次离心样品。离心会使精子细胞聚集在离心管底部，从而允许我们用甲醇替换低渗溶液。

必须重复进行乙酸离心操作，以更换甲醇-乙酸溶液，直至获得白色沉淀物为止。当出现白色沉淀时，需加入更多甲醇-乙酸溶液。最终体积应根据后续实验所需的细胞分散程度进行调整。

最后一步是将固定好的样品滴加到保存在-20 °C甲醇中的Reed载玻片上，以制备展片。为便于后续观察精子展片的特定区域，可在载玻片的另一侧使用金刚石笔标记该区域。一旦确认细胞分散效果理想，载玻片应于-20 °C至少保存24小时。

在开始实验方案之前，本实验部分将使用生理盐水柠檬酸钠溶液、乙醇系列、DRE、胎牛和fide。载玻片解冻后，需将固定的样品浸入两个连续的共平面玻璃瓶中，每个瓶内含有两倍浓度的SSC溶液，以进行洗涤和脱水处理。

每个浓度的乙醇缸中需浸泡三分钟。然后，载玻片必须按照浓度递增的顺序，依次浸入各乙醇缸中，每缸浸泡两分钟。至此，为了继续后续步骤，载玻片必须彻底干燥。

由于精子细胞核中的DNA高度压缩，因此在变性之前必须先解聚染色质。这可以通过在37°C下使用DTT溶液实现。该试剂的作用机制是断裂精子细胞核中使DNA盘绕的鱼精蛋白之间的二硫键。载玻片在DTT溶液中的孵育时间必须根据精液样本对该试剂的反应性进行调整。

通常约为八分钟，但也可在两到十五分钟之间。在此时间后，必须立即将载玻片转移至两倍浓度的 SSC 溶液中浸泡三分钟，再重复一次，持续另外三分钟，随后在每个乙醇梯度瓶中各浸泡两分钟。为了进行探针杂交，必须使用单链 DNA。这需要在加入探针前进行变性处理，即在 73 摄氏度的前体溶液中孵育五分钟。为完成载玻片处理，最后需将载玻片浸入乙醇溶液中进行最终转移，每个梯度瓶中浸泡一分钟。

随后，载玻片即可用于临床诊断中的FISH研究。最常分析的染色体包括性染色体以及13、18和21号染色体。为了分析这些染色体，我们将使用来自vices的多色DNA探针试剂盒。

其中包含一个试剂瓶，内含针对X、Y和18号染色体的α卫星区域的探针组合，分别以绿色、亮蓝色标记；另一个试剂瓶内含针对13号和21号染色体的探针组合，分别以绿色和橙色标记。所添加探针混合物的体积需根据拟杂交区域的大小而定，以15×15盖玻片为参考，5 µL体积已足够。

两种探针混合物均已预先在杂交缓冲液中变性，便于直接使用，因此可直接添加至去凝聚并已变性的载玻片上。此外，还有多种商业化的探针可用于多种染色体及Loki，这些探针亦可用于此类实验。然而，通常情况下，这些探针在加入靶标样本前需要进行预先变性处理。

在这些情况下，遵循制造商的说明即可。靶向区域必须用盖玻片覆盖，并用橡胶胶水密封。然后将玻片放入预热至 37°C 的杂交 chamber 中，在该温度下孵育 6 至 24 小时。

在实验方案的最后阶段，我们将使用由不同浓度的氯化钠柠檬酸钠溶液和去污剂NP-40配制的这两种洗涤液。孵育结束后，可将载玻片从杂交盒中取出，去除橡胶胶水，然后小心地取下盖玻片。

如图所示，将载玻片浸入第一种洗涤液中，该溶液已预热至 73°C，浸泡时间为两分钟。随后将载玻片转移至室温下的第二种洗涤液中，继续洗涤一分钟。这两次洗涤有助于消除非特异性杂交信号。完成这两步洗涤后，需等待载玻片完全干燥，以结束本实验方案的最后一步。

此时需加入一种复染试剂，以利于观察细胞的细胞核。其中最常用的试剂之一是 DAPI。所加入的试剂体积必须根据杂交区域的大小进行调整，以18×18盖玻片为参考标准。

使用 8 微升的 DPI 已足够。可用指甲油封固盖玻片，此时样品即可用于观察。否则，可将样品在 -20 °C 下保存，直至后续分析。

我们将用于观察的显微镜是配备三波段滤光片的奥林巴斯BX 60落射荧光显微镜，该滤光片适用于dpi、Texas Red和FITC，同时配有用于Aqua FITC和Texas Red的单波段滤光片。通过三波段滤光片，可观察到与X、Y及18号染色体杂交后产生的这三条染色体的荧光信号。使用Aqua单波段滤光片时，仅能观察到18号染色体的荧光信号。在每一个正常的精子细胞中，我们应观察到一个此类信号。

然而，当仅使用单通道滤光片检测FITC时，部分精子显示出对应于X染色体的荧光绿色信号。缺乏绿色信号的精子应显示Y染色体的红色信号，该信号可通过Texas red滤光片特异性地观察到。通过三通道滤光片观察1321杂交信号，我们能够区分这两种染色体的信号。

绿色信号对应于13号染色体，可使用FITC的单波段滤光片进行特异性观察。Texas Red的单波段滤光片可使我们特异性观察21号染色体的信号。所有正常的精子应在这两个探针中各显示一个信号。

综上所述，以下是该实验方案的主要步骤。再次强调，固定过程应准确操作，通过逐滴添加甲醇-冰醋酸溶液，以获得高质量的展片。为避免在去凝聚过程中形成精子聚集体，DTT溶液中的孵育时间必须根据精液样本对该试剂的反应性进行调整。

精子暴露于DTT的时间过长会导致实验结束时信号弥散，而暴露时间不足则会导致探针完全无法杂交，部分信号缺失。精子样本的变性步骤是必需的，而探针的变性条件则必须根据制造商的说明进行调整。必须严格控制杂交后两次洗涤的时间和温度。

较高的温度或过长的洗涤时间可能导致部分信号丢失，而相反条件则无法消除非特异性信号。最后，使用配备适当特异性滤光片的落射荧光显微镜对于良好的信号观察和解读至关重要。以上即为全部内容。

感谢观看，祝您的实验顺利。