Name: 取得高纯度弓形虫卵囊 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-03T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: 了解使用不连续氯化铯梯度法从感染猫粪便中纯化弓形虫卵囊的实验流程。该方法通过蔗糖浮选和离心步骤获得高纯度卵囊，适用于分子生物学和组织培养研究。

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我们感谢 Nichole Brinkman 和 Michael Ware 对本文稿的技术审阅，感谢 Abu Sayed 博士和 Linda Ransick 提供的技术与行政支持。美国环境保护局通过其研究与发展办公室，部分资助并参与了本研究所述工作，相关合作基于与 Dynamac 公司签订的合同编号 EP-D-06-096，以及与美国农业部（USDA）签订的跨机构协议编号 DW-12-92289801-0。本研究已通过机构审查并获准发表。提及商品名称或商业产品并不构成对其使用 endorsement 或推荐。MJS 当前地址：Dynamac, Inc.，俄亥俄州辛辛那提市。

1. 处理T. gondii卵囊时的一般安全预防措施
 <ol>
 <li>处理T. gondii卵囊时，必须遵守所有安全预防措施。在大多数健康个体中，T. gondii感染可被免疫系统有效控制；然而，感染将转为终身潜伏状态。免疫功能低下者对弓形虫病尤为易感，不应接触T. gondii卵囊。孕妇也不应接触T. gondii卵囊，因为感染可能导致严重的出生缺陷8。</li>
 <li>T. gondii卵囊只能在指定区域由经过培训的人员操作。必须在指定区域张贴标识，提示正在进行T. gondii卵囊相关工作，以提醒进入该区域的人员。</li>
 <li>处理T. gondii卵囊时，应穿戴适当的个人防护装备（PPE），例如实验服、一次性防护服、一次性手套，以及适当的眼部防护装置或面罩。</li>
 <li>建议频繁更换手套。不得使用被T. gondii卵囊污染的手套操作任何实验设备。</li>
 <li>处理T. gondii卵囊时，应始终使用金属可高压灭菌托盘，并铺有一次性吸水衬垫。确保所使用的所有架子、试管等器材均为一次性或可高压灭菌。</li>
 <li>所有含T. gondii的废弃物必须经过两次高压灭菌，每次至少持续一小时。</li>
 <li>所有非一次性设备（如架子、托盘等）也必须经过两次高压灭菌，每次至少持续一小时。</li>
 <li>用于吸取液体的真空管路应连接Vacushield™过滤器，以防止真空泵被污染。</li>
 <li>完成T. gondii卵囊操作后，所有受影响的实验台面必须进行消毒。应大量喷洒新配制的10%次氯酸钠溶液至工作区域，并使其自然干燥，随后必须用清水充分冲洗该区域。</li>
 </ol>
2. 缓冲液和溶液的配制
 <ol>
 <li>通过将 752.66 g 蔗糖溶解于 600 ml ddH2O 中，配制 1 L 的 2.2 M 蔗糖溶液。使用加热磁力搅拌器搅拌并温和加热以溶解蔗糖。待完全溶解后，用 ddH2O 定容至 1 L。随后需通过高压灭菌至少 20 分钟进行灭菌处理。</li>
 <li>通过将 6.05 g Tris-HCl 和 3.7 g EDTA 加入 700 ml ddH2O 中，配制 1 L TE 缓冲液（50 mM Tris-HCl，10 mM EDTA），调节 pH 至 7.2，然后用 ddH2O 定容至 1 L。</li>
 <li>对于 CsCl 梯度，通过将 21.75 g CsCl 加入 103.25 ml TE 缓冲液中，配制比重为 1.15 的 CsCl 储存液（1.15-CsCl）。溶液 A：将 30 ml TE 与 20 ml 1.15-CsCl 混合。溶液 B：将 20 ml TE 与 30 ml 1.15-CsCl 及 12.5 μl 酚红溶液混合。溶液 C：将 10 ml TE 与 40 ml 1.15-CsCl 混合（表 1）。</li>
 <li>通过将 40 g NaOH 溶解于 800 ml ddH2O 中，配制 1 L 的 1 N 氢氧化钠（NaOH）溶液。待溶解后，用 ddH2O 定容至 1 L。</li>
 <li>通过将 20 ml H2SO4 与 980 ml ddH2O 混合，配制 1 L 的 2%（体积分数）H2SO4 溶液。</li>
 </ol>
 3. 蔗糖浮选
 <ol>
 <li>将10 ml含T. gondii卵囊的粪便悬液（溶于2% H2SO4中）加入50 ml锥形离心管中。需注意，此处的粪便悬液是指已通过先前所述蔗糖漂浮法进行预处理的样本8。当从感染猫只采集粪便样本后，需按参考文献8所述方法进行蔗糖漂浮处理。此额外的蔗糖漂浮步骤对于进一步减少带入CsCl纯化过程的粪便碎片、获得尽可能纯净的T. gondii卵囊至关重要。</li>
 <li>向粪便悬液中加入6 ml（3/5体积）1 N NaOH，中和2% H2SO4，并通过涡旋充分混匀。</li>
 <li>向粪便悬液中加入等体积（16 ml）的2.2 M蔗糖溶液，使终浓度为1.1 M，并通过涡旋充分混匀。</li>
 <li>使用10 ml移液器，小心地将10 ml ddH2O覆盖于蔗糖/粪便悬液上层。于室温下以1,200 × g离心20分钟，不启用刹车。</li>
 <li>小心吸取上层水相及界面层，并通过从气-水界面处移液的方式转移至新的50 ml锥形离心管中，移液时避免旋转移液器。在收集界面层时，应尽量减少蔗糖的带出。</li>
 <li>通过涡旋混匀剩余的蔗糖/粪便沉淀物溶液。</li>
 <li>重复步骤3.4和3.5。</li>
 <li>用ddH2O将两次获得的卵囊界面层溶液定容至50 ml，于室温下以2,000 × g离心10分钟。</li>
 <li>吸除每管中的上清液，用5 ml TE缓冲液重悬沉淀物，并将所有卵囊悬液合并。最终合并体积应为10 ml。</li>
 </ol>
4. CsCl 梯度
<ol>
 <li>使用50 ml注射器配18号钝头、可高压灭菌的不锈钢针头和双向止流阀，小心地将各层溶液依次铺置于50 ml聚碳酸酯Oak Ridge离心管中，制备不连续的CsCl梯度。注：在溶液B中加入酚红，以便于区分梯度层（表1）。</li>
 <li>按以下顺序缓慢向离心管中加入下列溶液。应注意流速不得超过0.5 ml/秒。
<ol>
 <li>10 ml TE/卵囊悬浮液样品</li>
 <li>8 ml 溶液A</li>
 <li>8 ml 溶液B</li>
 <li>8 ml 溶液C</li>
</ol>
</li>
 <li>将Oak Ridge离心管在4 °C下以12,000 × g离心60分钟，不启用刹车。可使用固定角转子，但高速水平摆动转子可实现卵囊与悬浮样品更佳的分离效果，并最大限度减少粪便碎片在管壁或管底的拖尾现象。拖尾程度取决于粪便悬浮液的组成，因此若粪便悬浮液极为浑浊，可能需要进行两次CsCl梯度离心。</li>
 <li>离心后，收集位于溶液A与溶液B之间的不透明/白色卵囊条带。为尽量减少粪便碎片的污染，应直接穿入卵囊条带而不扰动梯度层，并使用10 ml移液管收集卵囊界面层。将卵囊界面层转移至新的50 ml锥形离心管中。在收集卵囊界面层时，应尽量减少吸入的CsCl溶液体积，以免在后续洗涤步骤中影响卵囊的沉淀。</li>
 <li>用30–40 ml去离子水（ddH2O）洗涤卵囊。在室温下以2,000 × g离心10分钟，不启用刹车。小心吸除上清液，避免扰动卵囊沉淀。重复洗涤共额外两次。</li>
 <li>最后一次洗涤结束后，小心吸除上清液，将沉淀重悬于10 ml 2%硫酸中，4 °C保存备用。卵囊现已可用于后续操作。可通过显微镜检查样品中是否存在粪便碎片，以评估卵囊纯度。</li>
</ol>

<ol><li>Dubey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+viable+Toxoplasma+gondii+in+beef%2C+chicken%2C+and+pork+from+retail+meat+stores+in+the+United+States%3A+risk+assessment+to+consumers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Prevalence of viable Toxoplasma gondii in beef, chicken, and pork from retail meat stores in the United States: risk assessment to consumers.</a> J. Parasitol. 91, 1082-1093 (2005).</li>
<li>Tenter, A. M., Heckeroth, A. R., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+from+animals+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: from animals to humans.</a> Int. J. Parasitol. 30, 1217-1258 (2000).</li>
<li>Bowie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbreak+of+toxoplasmosis+associated+with+municipal+drinking+water%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Outbreak of toxoplasmosis associated with municipal drinking water.</a> Lancet. 350, 173-177 (1997).</li>
<li>Moura, L. de <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waterborne+toxoplasmosis%2C+Brazil%2C+from+field+to+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Waterborne toxoplasmosis, Brazil, from field to gene.</a> Emerg. Infect. Dis. 12, 326-329 (2006).</li>
<li>Jones, J. L., Dubey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waterborne+toxoplasmosis+-+Recent+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Waterborne toxoplasmosis - Recent developments.</a> Exp. Parasitol. doi: 10.1016/j.exppara.2009.03.013, (2009).</li>
<li>Dumetre, A., Darde, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+detect+Toxoplasma+gondii+oocysts+in+environmental+samples%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">How to detect Toxoplasma gondii oocysts in environmental samples.</a> FEMS Microbiol. Rev. 27, 651-661 (2003).</li>
<li>Dumetre, A., Darde, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Toxoplasma+gondii+oocysts+by+cesium+chloride+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification of Toxoplasma gondii oocysts by cesium chloride gradient.</a> J. Microbiol. Methods. 56, 427-4230 (2004).</li>
<li>Dubey, J. P. Toxoplasmosis of Animals and Man. , 2nd Edition, CRC Press, Inc. Boca Raton, FL. (2009).</li>
</ol>

通过不连续氯化铯梯度获得高纯度toxoplasma gondii卵囊

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Toxoplasma gondii是一种专性细胞内寄生的原生动物病原体，常见于人类感染。它是一种特征明确的顶复门原虫，与食源性和水源性疾病暴发密切相关。其终末宿主为猫科动物，在其中进行有性繁殖，产生高度传染性且环境抗性强的卵囊。感染途径包括摄入被污染肉类中的组织囊肿，或来自土壤或水体中的卵囊。健康个体感染后通常无症状，但会形成终生潜伏感染，当个体免疫功能受损时可发生再激活，导致弓形虫脑炎甚至死亡。被污染的肉类中含有的T. gondii囊肿一直是欧洲和美国感染的主要来源，但近年来动物管理和饲养实践的改进以及食品处理和加工程序的提升已显著降低了其流行率T. gondii肉中的包囊1, 2然而，人类的血清流行率仍然相对较高，表明接触被卵囊污染的土壤或水源可能是主要原因。事实上，全球已报道多起水源性弓形虫病暴发事件，支持了环境中的卵囊形式暴露具有重大健康风险的理论。3-5. 迄今为止，关于了解流行率的研究T. gondii由于缺乏在环境中检测卵囊的工具，对水中和环境中卵囊的研究仍然有限5, 6。这主要是由于缺乏高效的纯化方案，无法获得大量高纯度的T gondii用于研究目的的感染猫体内的卵囊。本研究描述了一种改良的CsCl方法的建立，该方法可简便地纯化T. gondii从感染猫的粪便中分离出的卵囊，适用于分子生物学和组织培养操作7.

本研究描述了一种改良的氯化铯方法，可轻松从感染猫的粪便中纯化出适用于分子生物学和组织培养操作的刚地弓形虫卵囊

通过不连续氯化铯梯度获得高纯度Toxoplasma gondii卵囊

弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种专性细胞内寄生的原虫病原体，可常见感染人类。它是一种特征明确的顶复门原虫，与……相关

弓形虫卵囊通常从感染的猫粪便中获取，并通过漂浮法进行分离，从而获得部分纯化的悬液，用于分子学和组织培养实验。然而，对该寄生虫开展的实验需要高度纯化的卵囊。为此，需进一步采用蔗糖漂浮法进行纯化：将卵囊重悬于溶液中，覆盖蔗糖溶液后再加水，经离心处理，使卵囊与大部分粪便杂质分离。随后将 osis 层转移至预先铺有氯化铯并进行离心的新离心管中。收集所得的清晰 osis 条带并进行洗涤，即可用于需要高度纯化的 teon io 辅助的实验。您好，我是 Sarah Staggs 博士，就职于 Dynam 公司，该公司是美国环境保护局国家暴露研究实验室的承包商。今天我们将向您展示一种利用不连续氯化铯梯度从实验室感染的猫的粪便中纯化弓形虫（Toxoplasma gondii）卵囊的实验方法。本实验室常规采用该方法分离OSI，以用于分子生物学和组织培养实验。现在让我们开始吧。在开始进行任何与弓形虫（TG O Osis）相关的工作之前，必须考虑重要的安全事项。免疫功能低下者、孕妇以及正在积极备孕的人员不应接触该病原体，因为存在感染弓形虫病的风险，可能导致疾病及严重的出生缺陷。X. 为降低感染风险，应为该操作划定专用区域，并在人员进入房间前张贴警示标识以提醒他人。处理T-One IO包囊时，请务必穿戴实验服、一次性防护服、一次性手套以及适当的护目镜或面罩。应经常更换手套，并避免用受污染的手套触碰任何设备。此外，务必在铺有一次性吸水衬垫的可高温灭菌金属托盘上进行操作。此外，花点时间确保你计划使用的所有试管架、试管和其他设备均为一次性用品或可高压灭菌。如果使用非一次性物品，使用后务必进行两次、每次一小时的高压灭菌处理。你还应将所有真空管路连接至真空防护滤器，以避免污染真空泵。完成包囊分离后，需在工作台面重新使用新鲜的10%次氯酸盐溶液处理。待其自然干燥后，再用清水反复冲洗该区域数次。在采取适当的安全防护措施后，即可继续开展实验。在采集 T Guni OYS 之前，必须首先配制好蔗糖、浮力及氯化铯梯度所需的全部溶液，并准备离心步骤。所需溶液包括：经高压灭菌锅灭菌20分钟的2.2摩尔蔗糖溶液、一升pH为7.2的TE缓冲液、1当量的氢氧化钠溶液、2%的硫酸溶液，以及比重为1.15的氯化铯储备溶液。将使用1.15倍浓度的氯化铯储备液配制溶液A、B和C，用于制备氯化铯梯度。溶液A通过将30毫升TE与20毫升1.15倍浓度的氯化铯储备液混合而成；溶液B通过将20毫升TE与30毫升1.15倍浓度的氯化铯储备液混合，并加入12.5 µL酚红溶液制得；最后，溶液C通过将10毫升TE与40毫升1.15倍浓度的氯化铯溶液混合制得。我们首先准备蔗糖漂浮液，取10毫升含T osis的粪便悬浮液（溶于2%硫酸中），转移至50毫升锥形离心管中。该粪便样本来源于已感染的猫的粪便，这些样本此前已按照JP Duby博士所著《动物与人类弓形虫病》（Toxoplasmosis of Animals and Humans）一书中描述的蔗糖漂浮法进行过处理。此额外步骤可进一步减少氯化铯纯化过程中的粪便碎片含量，有助于获得最高纯度的T goi包囊。然后，向粪便悬液中加入三分之五体积的1 N氢氧化钠溶液，以中和硫酸。通过涡旋充分混匀悬液。接着，加入与悬液等体积的蔗糖，并再次通过涡旋充分混匀。使用10毫升每管的量，小心地将10毫升双蒸水覆盖在蔗糖粪便悬液上方。操作完毕后，将试管放入离心机，于室温下以1200 × g离心20分钟，离心结束后不进行刹车。小心操作，避免扰动，从空气-水界面轻轻吸取上层水相及界面层。在收集界面层时，尽量减少蔗糖层的残留量非常重要。将这些层转移至一个新的50毫升锥形离心管中。涡旋振荡该管，以混匀残留的蔗糖粪便沉淀溶液。将上一步的水相覆盖及离心操作再重复一次。离心后，收集上层水相和界面层，并转移至新离心管中。使用重蒸水将两个200个包囊界面溶液的体积补至50毫升。然后在室温下以2000 × g离心试管10分钟。最后用移液器吸除各管中的上清液S。将沉淀物重悬于5 mL茶缓冲液中，并制备渗透悬浮液。现在可进行氯化铯梯度步骤。首先，在一个 50 毫升聚碳酸酯 Oak ridge 离心管中制备不连续的氯化铯梯度。使用带 18 号钝头可高压灭菌钢针的 50 毫升注射器，向该聚碳酸酯管中加入 10 毫升含有 TE 和 osis 的悬浮液。然后使用双向止流阀，将以下溶液缓慢直接加入试管底部。8 mL 溶液A、8 mL 溶液B和8 mL 溶液C。确保流速不超过0.5 mL/s。还需注意，溶液B中的酚红有助于区分梯度层。现在，您已准备好使用固定角度的高速转子，在4摄氏度条件下以12,000 ×g离心Oak ridge管60分钟，且不使用刹车。离心结束后，我们收集溶液A与溶液B之间不透明的白色条带。该条带含有卵母细胞。使用10毫升移液器，直接移至卵母细胞条带处，避免扰动梯度，收集卵母细胞。收集包囊时，尽量减少吸入的氯化铯溶液体积，因为过量的氯化铯可能在洗涤过程中影响包囊的沉淀。随后，将OSIS转移至一个新的50毫升锥形离心管中。用30至40毫升双蒸水洗涤O型包囊，然后在室温下以2000 × g离心10分钟（无刹车），小心吸除上清液，注意不要扰动O型包囊沉淀。再重复洗涤两次。最后一次洗涤完成后，小心吸去上清液，并将沉淀重悬于10毫升2%硫酸中。在显微镜下检查OSIS，以确保样本中的所有粪便碎片均已成功去除。现在可以对隐孢子进行进一步操作，或者在您准备使用前将其保存在4摄氏度环境中。下图是在400倍放大倍数下使用微分干涉相差显微镜观察未纯化的隐孢子的形态。请注意视野中存在大量粪便污染物，这使得识别隐孢子变得非常困难。这是经过氯化铯梯度纯化方案后在 400 倍镜下观察到的 OISS。注意其中无粪便碎片残留。我们刚刚向您展示了如何利用不连续氯化铯梯度从实验室感染猫的粪便中纯化弓形虫（Toxoplasma gondii）卵囊。进行此操作时，重要的是要牢记遵守所有安全准则，并在叠加氯化铯梯度时格外小心，应缓慢逐层加入，尽量避免扰动或混合梯度。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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科研

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免疫学与感染

取得高纯度弓形虫</em一个不连续的氯化铯梯度>卵囊

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