使用 Gene Pulser MXcell 电穿孔系统高效转染原代细胞

本实验方案的总体目标是确定使用小鼠胚胎成纤维细胞（mfs）转染原代细胞系的最佳电穿孔条件。以MF细胞和选定的核酸为例，将其加入连接至Gene Pulser MX细胞系统的96孔电穿孔板中，可在单次运行中测试多种电穿孔条件。在优化实验中，电穿孔后对细胞进行培养，并分析其转染效率。

通过使用落射荧光显微镜和流式细胞术，可以筛选出未来转染所需的最高效的电穿孔条件。大家好，我是 BioRad Laboratories 基因表达部门的高级科学家 Adam McCoy。今天，我们将向您展示一种简便的方法，用于确定转染原代细胞系的最佳电穿孔条件。

我们在实验室中采用此方法研究这些细胞中的基因表达。今天，我将使用三种不同传代次数的小鼠胚胎成纤维细胞（mes或MEF）。我使用不同传代次数的细胞培养物基于两个原因。

首先，我将说明细胞健康的重要性：对于原代细胞系而言，即使在培养中多延长几天，也会对转染效率产生影响。其次，我想说明的是，尽管较老的细胞转染效率会下降，但优化最佳条件的过程仍然是一样的。您的实验可能不会涉及不同年龄的细胞。

您可以使用自己的实验设计遵循相同的流程。如果需要比较基因表达在对照细胞和处理细胞之间的差异，可以先找到最佳条件，然后使用已确定的条件进行实验。或者，您也可以将优化步骤与正式实验一并进行。

正如我今天将要演示的，我将使用一种编码GFP的质粒，通过流式细胞术来检测转染效率。但即使您进行的是其他操作，例如引入irna并通过实时PCR检测基因表达，电穿孔的步骤也是一样的。那么，让我们开始吧。

本方案中使用的小鼠胚胎成纤维细胞（mets）为贴壁细胞。因此，处理这些细胞的第一步是采用包含胰蛋白酶消化的标准组织培养方法，将细胞从培养瓶底部消化下来。待细胞从培养瓶壁脱离后，使用含血清的培养基中和胰蛋白酶，并将细胞收集至50毫升锥形管中。

收集细胞后，进行离心，使细胞沉淀。应用已知体积的磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞，洗涤细胞。待细胞完全重悬后，对细胞进行计数，确保其浓度达到每毫升100万个细胞，以用于电穿孔实验。

根据细胞计数计算出适当的细胞数量，并将其转移至洁净的离心管中。离心以沉淀细胞。然后小心吸除上清液。

将细胞重悬于电穿孔缓冲液中，浓度为每毫升100万个细胞，并加入每毫升20微克的质粒。这些孔板分为96个孔，列标记为1至12，行标记为A至H，每四个孔为一组（即孔组），共用一对电极板，因此这些孔中的细胞会接受相同的电脉冲。例如，孔1A、1B、1C和1D在电学上相互连接，构成一个孔组，均会接受相同的电脉冲。

接下来的四孔，即A、B、C和D孔，在启动程序时将全部接受第二个电脉冲。尽管参数可能相同，但96孔电穿孔板的设置使得板的上半部分和下半部分相互分隔。因此，位于板底部的E、F、G和H孔均接受一个电脉冲，但该脉冲与板顶部A、B、C和D孔所接受的脉冲不同。

本实验中仅使用培养板的一半区域。每组孔中的前三个孔含有不同代次的细胞。最上方 A 行的细胞已传代五次。

第B行的细胞已传代9次，第C行的细胞已传代13次。第D行在电穿孔前仅含有电穿孔缓冲液。建议检查您的实验方案，以确保设置正确。

本方案将递送六个指数衰减脉冲，随后递送六个方波脉冲。指数衰减脉冲的电压从200伏特逐步增加至450伏特，且均仅使用350 µF。这是由于所用基因脉冲或电穿孔缓冲液的电阻较低所致。

方波脉冲在电压和脉冲持续时间上均有变化。仪器的电容设置需要与电穿孔混合物的电导率相匹配。如果使用电阻较高的电穿孔缓冲液（如DMEM），可采用相同的电压范围，但对于指数衰减脉冲，应使用较大的电容，例如950微法拉。

如果所用缓冲液的最佳电容值未知，则还需要在测试的电穿孔条件中调整电容值。下一步是将 150 微升的细胞-质粒混合物加入本实验所用的每个孔中。每组孔中的第四个孔则加入电穿孔缓冲液。

加载酶标板后，将其放入 MXL 酶标板腔室中并关闭盖子。然后按脉冲键以对细胞进行电转染。电转染仪会根据所选程序设定的条件，依次向每个孔施加电脉冲。

电穿孔处理所有细胞仅需数秒钟。脉冲结束后，将培养板从电穿孔腔室中取出，再将每孔中的细胞转移至含有预热培养基的培养皿中。

这些细胞在添加了10% FBS的DMEM中培养。未进行电穿孔的对照样品取自剩余的细胞质粒混合物，并加入到含有预温培养物的培养皿中，培养基成分与电穿孔细胞所用的相同。最后轻轻摇匀。

然后轻敲培养板以分散细胞，随后将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育24小时，之后分析转染效率，并确定最适合您实验的电穿孔条件。一旦确定了最佳电穿孔条件，在后续实验中可选择两种电穿孔方法之一：研究人员可以继续在96孔板中进行细胞电穿孔，也可以每次使用比色杯对单个样品进行细胞电穿孔。

比色皿每次只能容纳一个样品，且所需样品体积是96孔板单孔体积的四倍；但当仅需处理少量样品时，单个比色皿成本较低且使用方便。Gene Pulser或MX细胞系统的设计允许在本实验中对96孔板和比色皿采用相同的电穿孔参数。此时，请勿使用板用电转室，而应改用适用于比色皿的MX电击探头（MX Shock Pod）。

将培养板腔室从仪器背面拔下，并插入电击小室。由于电击小室仅能传递为孔集 A、B、C、D 一预设的脉冲程序，因此可能需要选择不同的程序。如需选择先前保存的程序，请按下“主页”按钮。

然后选择选项三“用户方案”。如果已处于正确的用户文件夹中，请按回车键选择用户方案并向下滚动。为选中正确的程序，请按回车键选择该程序。

仪器现已准备就绪。程序选定后，即可准备比色皿。质粒与MEFs的混合物制备方法与之前所示相同。

将每条0.4厘米的凝胶条加载与整套孔所用相同体积的样品。在96孔板中，每套孔包含四个孔，每孔使用150微升缓冲液或细胞混合物，因此每条凝胶条需加入600微升质粒细胞混合物。

接下来，将移液器放入电击小室中，按下脉冲按钮，向细胞施加电击。电穿孔完成后，按照平皿法混合细胞，然后将等分试样转移至已加入预热培养基的细胞培养板中，并设置未进行电穿孔的对照孔，轻轻摇晃培养板并轻弹。

然后将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养24小时以恢复，待转染细胞并使其恢复后，分析转染效率。使用落射荧光显微镜对转染效率进行定性分析，使用流式细胞术进行定量分析。成功电穿孔并表达GFP基因的细胞在落射荧光显微镜下呈现绿色，此处展示的是一个典型的成功结果。在相差显微镜下观察细胞，可同时看到转染和未转染的细胞。

图中显示的是在 200 伏最低电压电穿孔脉冲处理下的细胞。由于细胞密度较高，细胞大部分已融合生长。在倒置荧光显微镜下观察同一视野，可见部分细胞表达了 GFP 标记蛋白，但其数量仅占此前在 250 伏条件下图像中可见细胞的一小部分。

在相差显微镜下观察到的活细胞总数略少于落射荧光显微镜下的观察结果。我们可以看到，在施加最高电压（375 伏）时，表达 GFP 的细胞数量有所增加。尽管可见的活细胞数量减少，但剩余细胞中有很大比例正在表达 GFP。

哪种条件最优取决于实验设计。在某些实验中，转染细胞数量最多可能是最佳条件；而在其他实验中，转染百分比最高可能更为理想。

我们关注在每种条件下GFP阳性细胞所占的百分比，以及该百分比随细胞传代次数的变化情况。流式细胞术可提供不同电穿孔条件下转染结果的定量信息。此处显示的是传代过程中GFP阳性细胞的百分比。

五个细胞。在12种电穿孔条件下，最高电压指数衰减时的最大转染率约为80%。脉冲条件6和70，在测试的最强方波脉冲条件12下，细胞在电穿孔前已传代九次。

转染率的整体模式几乎完全相同，但显示的转染百分比略有下降。以下是传代13细胞中GFP阳性细胞的百分比，其转染率相对于较年轻的细胞明显降低。最高转染率仅为较年轻细胞所达到值的一半左右，表明应尽可能在细胞分离后尽早使用健康的细胞，这一点至关重要。

我刚刚向您展示了如何使用 MXL 电穿孔系统来确定电穿孔探针图谱或其他原代细胞系的最佳条件。进行此操作时，重要的是要记住，在分离后应尽快使用健康的细胞，并且所用的电穿孔条件应与电穿孔缓冲液相匹配。以上就是全部内容。

感谢观看，祝您的实验顺利。