Name: 使用基因脉冲MXcell电穿孔系统主细胞的转染效率高 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-07T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: 了解如何使用Gene Pulser MXcell电穿孔系统优化小鼠胚胎成纤维细胞的转染条件。本方案通过流式细胞术和荧光显微镜分析，帮助研究者快速确定最佳电穿孔参数，提高基因表达研究效率。

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1）细胞制备
 <ol>
 <li>使用贴壁细胞时，必须在电穿孔前进行胰蛋白酶消化并收集细胞。</li>
 <li>为了比较代表三个不同传代次数的四种小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）培养物之间的转染效果，对每个培养瓶执行以下操作。</li>
 <li>吸除细胞培养基。</li>
 <li>加入 PBS 洗涤细胞。</li>
 <li>移除 PBS，加入足量胰蛋白酶覆盖细胞，并等待数分钟使胰蛋白酶发挥作用以使细胞脱落。</li>
 <li>在显微镜下检查培养瓶以确认细胞状态，轻拍培养瓶促进细胞脱落，然后再次检查以确保所有细胞均已脱落。</li>
 <li>如必要，延长孵育时间并重复操作。</li>
 <li>待所有细胞脱落后，加入含血清的培养基以中和胰蛋白酶。</li>
 <li>将细胞转移至离心管中，通过离心（相对离心力 = 300 × g）收集细胞沉淀。</li>
 <li>移除上清液，并将细胞重悬于已知体积的 PBS 中。</li>
 <li>计数细胞。</li>
 <li>转移适量体积的细胞悬液至新管中，以提供实验所需数量的细胞（每孔需要 150 μL 细胞悬液，细胞密度为 1 × 106 个细胞/mL）。</li>
 <li>离心细胞。</li>
 <li>移除上清液，并将细胞重悬于适量体积的 Gene Pulser 电穿孔缓冲液中，使细胞密度达到 1 × 106 个细胞/mL。</li>
 <li>每毫升细胞悬液中加入 20 μg 质粒 DNA，并轻轻混匀。</li>
</ol>
2）电穿孔装置设置与电穿孔
培养板设置与电穿孔
<ol>
<li>将电穿孔板插入 Gene Pulser MXcell 电穿孔系统的电源模块中。</li>
<li>用移液器将 150 μL 细胞混合液或缓冲液加入 96 孔电穿孔板的各孔中。</li>
<li>将板放入板室并进行电脉冲。</li>
<li>从室中取出电穿孔板。</li>
<li>通过在每个孔中反复吹打混匀孔内溶液。</li>
<li>将各孔中的细胞转移至 12 孔板的预温缓冲液中。</li>
<li>轻敲培养板使细胞分布均匀，并将板放入培养箱中。</li>
<li>让细胞恢复培养 24 小时。</li>
</ol>
比色皿设置与电穿孔
<ol start="9">
 <li>从 Gene Pulser MXcell 电穿孔系统电源模块上拔下培养板腔室，插入 ShockPod™ 电转杯腔室。</li>
 <li>将 600 μL 细胞悬液移入 0.4 cm 间隙的电穿孔电转杯中。</li>
 <li>将电转杯放入 ShockPod 腔室，并施加电脉冲。</li>
 <li>从腔室中取出电转杯。</li>
 <li>通过在电转杯中反复吹打混合其内容物。</li>
 <li>将每个孔中的细胞转移至 12 孔板中预热的缓冲液中。</li>
 <li>轻敲培养板以分散细胞，并将培养板放入培养箱。</li>
 <li>让细胞恢复培养 24 小时。</li>
 </ol>
3) 代表性结果
转染细胞并使其恢复后，使用落射荧光显微镜定性分析转染效率，并通过流式细胞术进行定量分析。
<img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig1.jpg" alt="显微镜下的细胞培养；荧光显微镜，细胞成像，生物医学研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 已成功进行电穿孔并正在表达GFP基因的细胞在落射荧光显微镜下可见。
<img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig2.jpg" alt="细胞培养显微图像，基质上的成纤维细胞，用于生物学研究" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2. 通过相差显微镜观察可同时看到转染与未转染的细胞。这些细胞接受了最低电压的电穿孔脉冲处理，电压为200V。由于细胞密度较高，细胞已基本汇合。
<img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig3.jpg" alt="显示细胞分布的荧光显微镜图像；蛋白质表达与定位分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3. 同一视野在落射荧光下显示有部分细胞表达GFP标记，但这些细胞仅占前一张图像中可见细胞的一小部分。
<img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig4.jpg" alt="细胞培养的显微图像；表面形态；生物研究；细胞生长检测。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 图4. 在250V下，相差显微镜下观察到的活细胞总数略有减少。
<img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig5.jpg" alt="荧光显微镜图像；组织培养中的细胞分布，细胞生长的光学分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 图 5. 在落射荧光显微镜下可见，表达 GFP 的细胞数量有所增加。
<img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig6.jpg" alt="细胞培养显微镜图像，细胞分布密集，用于生物学研究分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 图6. 在施加最高电压375 V时，可见的活细胞数量较少。
<img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig7.jpg" alt="荧光显微镜下的细胞培养；显微图像；细胞行为与形态学研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图7"> 图7. 然而，剩余细胞中有很大比例表达GFP。最佳条件取决于实验设计：在某些实验中，转染细胞数量最多可能最为理想，而在其他实验中，转染百分比最高可能更优。
我们关注在每种条件下GFP阳性细胞所占的百分比，以及该百分比如何随细胞年龄变化。流式细胞术可提供不同电穿孔条件下转染结果的定量信息。
<img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig8.jpg" alt="显示12种条件下GFP阳性百分比的柱状图，用于实验比较的数据分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图8"> 图8. 本图显示了在12种电穿孔条件下，第5代细胞中GFP阳性细胞所占的百分比。在最高电压的指数衰减脉冲（条件6）下，转染效率最高，约为80%；在测试的最强方波脉冲（条件12）下，转染效率为70%。
<img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig9.jpg" alt="GFP表达分析，柱状图；实验条件与GFP阳性百分比。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 9"> 图9. 在电穿孔前传代9次的细胞中，转染百分比的整体模式几乎相同，但转染百分比略有下降。
<img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig10.jpg" alt="柱状图显示12种条件下基因表达分析中GFP阳性细胞的百分比。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图10"> 图10. 此处显示的是第13代细胞中GFP阳性细胞的百分比，相较于较年轻的细胞，其转染效率显著下降。最高转染效率仅约为较年轻细胞的一半，表明应尽可能在细胞分离后尽早使用健康的细胞。

 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="3">使用 Gene Pulser MXcell 转染 MEF 细胞所用的电穿孔条件</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>条件 (1-6) 
 指数衰减脉冲， 
 均使用 350 uF、1000 ohm</td>
 <td>电压 (V)</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1</td>
 <td>200</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2</td>
 <td>250</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3</td>
 <td>300</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4</td>
 <td>326</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5</td>
 <td>350</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6</td>
 <td>376</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>条件 (7-12) 
 方波脉冲， 
 均使用 2000 uF、1000 ohm 和 1 次脉冲</td>
 <td>电压 (V)</td>
 <td>脉冲持续时间 (ms)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>7</td>
 <td>200</td>
 <td>10 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>8</td>
 <td>250</td>
 <td>10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>9</td>
 <td>300</td>
 <td>10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10</td>
 <td>200</td>
 <td>20</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>11</td>
 <td>250</td>
 <td>20</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12</td>
 <td>300</td>
 <td>20</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

作者受雇于 Bio-Rad Laboratories，该公司生产本文所使用的试剂和仪器

本视频文章演示了如何使用 MXcell 电穿孔系统，简便地确定 MEF 或其他原代细胞系的最佳电穿孔条件。96 孔板格式可同时进行大量实验或优化条件的重复操作，从而避免开展多次独立实验。在操作过程中，应注意尽可能在细胞分离后尽早使用状态健康的细胞，并选择与电穿孔缓冲液相匹配的电穿孔条件。

<table><tbody><tr><td>Gene Pulser&amp;#174; 电穿孔缓冲液</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2676</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser MXcell&amp;#8482; 电穿孔系统</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2670</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser MXcell&amp;#8482; 配套 ShockPod&amp;#8482; 电穿孔杯室</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2673</td><td></td></tr><tr><td>配备 ShockPod&amp;#8482; 电穿孔杯室的 Gene Pulser MXcell&amp;#8482; 电穿孔系统</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2674</td><td></td></tr></tbody></table>

使用 gene pulser mxcell 电穿孔系统高效转染原代细胞

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

电穿孔正日益显现出其作为将质粒DNA或siRNA导入原代细胞最有效方法的优势。Gene Pulser MXcell电穿孔系统与Gene Pulser电穿孔缓冲液（Bio-Rad）专为高效转染核酸进入哺乳动物细胞以及难转染细胞（如原代细胞和干细胞）而开发。我们将演示如何开展一项简单的实验，以快速确定最佳电穿孔条件。我们将展示如何同时对多个样品在一系列不同电穿孔条件下进行处理，从而在优化条件的同时完成正式实验。我们还将说明如何将使用96孔电穿孔板所确定的最佳条件应用于标准电穿孔杯，实现在保持相同电穿孔效率的前提下，从电穿孔板顺利过渡到电穿孔杯。在视频中，我们还将讨论影响电穿孔实验成功或失败的一些关键因素。

本实验方案展示了如何使用 Gene Pulser MXcell 电穿孔系统快速、简便地确定小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）或其他原代细胞的最佳电穿孔条件。相关视频中还讨论了故障排除时的注意事项。

使用 Gene Pulser MXcell 电穿孔系统高效转染原代细胞

越来越多的研究表明，电穿孔是将质粒DNA或siRNA导入原代细胞最有效的方法。Gene Pulser ...

本实验方案的总体目标是确定使用小鼠胚胎成纤维细胞（mfs）转染原代细胞系的最佳电穿孔条件。以MF细胞和选定的核酸为例，将其加入连接至Gene Pulser MX细胞系统的96孔电穿孔板中，可在单次运行中测试多种电穿孔条件。在优化实验中，电穿孔后对细胞进行培养，并分析其转染效率。通过使用落射荧光显微镜和流式细胞术，可以筛选出未来转染所需的最高效的电穿孔条件。大家好，我是 BioRad Laboratories 基因表达部门的高级科学家 Adam McCoy。今天，我们将向您展示一种简便的方法，用于确定转染原代细胞系的最佳电穿孔条件。我们在实验室中采用此方法研究这些细胞中的基因表达。今天，我将使用三种不同传代次数的小鼠胚胎成纤维细胞（mes或MEF）。我使用不同传代次数的细胞培养物基于两个原因。首先，我将说明细胞健康的重要性：对于原代细胞系而言，即使在培养中多延长几天，也会对转染效率产生影响。其次，我想说明的是，尽管较老的细胞转染效率会下降，但优化最佳条件的过程仍然是一样的。您的实验可能不会涉及不同年龄的细胞。您可以使用自己的实验设计遵循相同的流程。如果需要比较基因表达在对照细胞和处理细胞之间的差异，可以先找到最佳条件，然后使用已确定的条件进行实验。或者，您也可以将优化步骤与正式实验一并进行。正如我今天将要演示的，我将使用一种编码GFP的质粒，通过流式细胞术来检测转染效率。但即使您进行的是其他操作，例如引入irna并通过实时PCR检测基因表达，电穿孔的步骤也是一样的。那么，让我们开始吧。本方案中使用的小鼠胚胎成纤维细胞（mets）为贴壁细胞。因此，处理这些细胞的第一步是采用包含胰蛋白酶消化的标准组织培养方法，将细胞从培养瓶底部消化下来。待细胞从培养瓶壁脱离后，使用含血清的培养基中和胰蛋白酶，并将细胞收集至50毫升锥形管中。收集细胞后，进行离心，使细胞沉淀。应用已知体积的磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞，洗涤细胞。待细胞完全重悬后，对细胞进行计数，确保其浓度达到每毫升100万个细胞，以用于电穿孔实验。根据细胞计数计算出适当的细胞数量，并将其转移至洁净的离心管中。离心以沉淀细胞。然后小心吸除上清液。将细胞重悬于电穿孔缓冲液中，浓度为每毫升100万个细胞，并加入每毫升20微克的质粒。这些孔板分为96个孔，列标记为1至12，行标记为A至H，每四个孔为一组（即孔组），共用一对电极板，因此这些孔中的细胞会接受相同的电脉冲。例如，孔1A、1B、1C和1D在电学上相互连接，构成一个孔组，均会接受相同的电脉冲。接下来的四孔，即A、B、C和D孔，在启动程序时将全部接受第二个电脉冲。尽管参数可能相同，但96孔电穿孔板的设置使得板的上半部分和下半部分相互分隔。因此，位于板底部的E、F、G和H孔均接受一个电脉冲，但该脉冲与板顶部A、B、C和D孔所接受的脉冲不同。本实验中仅使用培养板的一半区域。每组孔中的前三个孔含有不同代次的细胞。最上方 A 行的细胞已传代五次。第B行的细胞已传代9次，第C行的细胞已传代13次。第D行在电穿孔前仅含有电穿孔缓冲液。建议检查您的实验方案，以确保设置正确。本方案将递送六个指数衰减脉冲，随后递送六个方波脉冲。指数衰减脉冲的电压从200伏特逐步增加至450伏特，且均仅使用350 µF。这是由于所用基因脉冲或电穿孔缓冲液的电阻较低所致。方波脉冲在电压和脉冲持续时间上均有变化。仪器的电容设置需要与电穿孔混合物的电导率相匹配。如果使用电阻较高的电穿孔缓冲液（如DMEM），可采用相同的电压范围，但对于指数衰减脉冲，应使用较大的电容，例如950微法拉。如果所用缓冲液的最佳电容值未知，则还需要在测试的电穿孔条件中调整电容值。下一步是将 150 微升的细胞-质粒混合物加入本实验所用的每个孔中。每组孔中的第四个孔则加入电穿孔缓冲液。加载酶标板后，将其放入 MXL 酶标板腔室中并关闭盖子。然后按脉冲键以对细胞进行电转染。电转染仪会根据所选程序设定的条件，依次向每个孔施加电脉冲。电穿孔处理所有细胞仅需数秒钟。脉冲结束后，将培养板从电穿孔腔室中取出，再将每孔中的细胞转移至含有预热培养基的培养皿中。这些细胞在添加了10% FBS的DMEM中培养。未进行电穿孔的对照样品取自剩余的细胞质粒混合物，并加入到含有预温培养物的培养皿中，培养基成分与电穿孔细胞所用的相同。最后轻轻摇匀。然后轻敲培养板以分散细胞，随后将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育24小时，之后分析转染效率，并确定最适合您实验的电穿孔条件。一旦确定了最佳电穿孔条件，在后续实验中可选择两种电穿孔方法之一：研究人员可以继续在96孔板中进行细胞电穿孔，也可以每次使用比色杯对单个样品进行细胞电穿孔。比色皿每次只能容纳一个样品，且所需样品体积是96孔板单孔体积的四倍；但当仅需处理少量样品时，单个比色皿成本较低且使用方便。Gene Pulser或MX细胞系统的设计允许在本实验中对96孔板和比色皿采用相同的电穿孔参数。此时，请勿使用板用电转室，而应改用适用于比色皿的MX电击探头（MX Shock Pod）。将培养板腔室从仪器背面拔下，并插入电击小室。由于电击小室仅能传递为孔集 A、B、C、D 一预设的脉冲程序，因此可能需要选择不同的程序。如需选择先前保存的程序，请按下“主页”按钮。然后选择选项三“用户方案”。如果已处于正确的用户文件夹中，请按回车键选择用户方案并向下滚动。为选中正确的程序，请按回车键选择该程序。仪器现已准备就绪。程序选定后，即可准备比色皿。质粒与MEFs的混合物制备方法与之前所示相同。将每条0.4厘米的凝胶条加载与整套孔所用相同体积的样品。在96孔板中，每套孔包含四个孔，每孔使用150微升缓冲液或细胞混合物，因此每条凝胶条需加入600微升质粒细胞混合物。接下来，将移液器放入电击小室中，按下脉冲按钮，向细胞施加电击。电穿孔完成后，按照平皿法混合细胞，然后将等分试样转移至已加入预热培养基的细胞培养板中，并设置未进行电穿孔的对照孔，轻轻摇晃培养板并轻弹。然后将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养24小时以恢复，待转染细胞并使其恢复后，分析转染效率。使用落射荧光显微镜对转染效率进行定性分析，使用流式细胞术进行定量分析。成功电穿孔并表达GFP基因的细胞在落射荧光显微镜下呈现绿色，此处展示的是一个典型的成功结果。在相差显微镜下观察细胞，可同时看到转染和未转染的细胞。图中显示的是在 200 伏最低电压电穿孔脉冲处理下的细胞。由于细胞密度较高，细胞大部分已融合生长。在倒置荧光显微镜下观察同一视野，可见部分细胞表达了 GFP 标记蛋白，但其数量仅占此前在 250 伏条件下图像中可见细胞的一小部分。在相差显微镜下观察到的活细胞总数略少于落射荧光显微镜下的观察结果。我们可以看到，在施加最高电压（375 伏）时，表达 GFP 的细胞数量有所增加。尽管可见的活细胞数量减少，但剩余细胞中有很大比例正在表达 GFP。哪种条件最优取决于实验设计。在某些实验中，转染细胞数量最多可能是最佳条件；而在其他实验中，转染百分比最高可能更为理想。我们关注在每种条件下GFP阳性细胞所占的百分比，以及该百分比随细胞传代次数的变化情况。流式细胞术可提供不同电穿孔条件下转染结果的定量信息。此处显示的是传代过程中GFP阳性细胞的百分比。五个细胞。在12种电穿孔条件下，最高电压指数衰减时的最大转染率约为80%。脉冲条件6和70，在测试的最强方波脉冲条件12下，细胞在电穿孔前已传代九次。转染率的整体模式几乎完全相同，但显示的转染百分比略有下降。以下是传代13细胞中GFP阳性细胞的百分比，其转染率相对于较年轻的细胞明显降低。最高转染率仅为较年轻细胞所达到值的一半左右，表明应尽可能在细胞分离后尽早使用健康的细胞，这一点至关重要。我刚刚向您展示了如何使用 MXL 电穿孔系统来确定电穿孔探针图谱或其他原代细胞系的最佳条件。进行此操作时，重要的是要记住，在分离后应尽快使用健康的细胞，并且所用的电穿孔条件应与电穿孔缓冲液相匹配。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利。

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科研

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Biology

生物学

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