使用基因脉冲MXcell电穿孔系统主细胞的转染效率高
January 7th, 2010
此过程说明如何使用基因脉冲MXcell电系统，以迅速和容易地识别小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）或其他主要细胞的最佳电条件。故障排除注意事项还讨论了相关的视频。
该方案的总体目标是确定使用小鼠胚胎、成纤维细胞或 mfs 横切原代细胞系的最佳电穿孔条件。例如，将 MF 细胞和所选核酸上样到连接到基因 Pulser MX 细胞系统的 96 孔电穿孔板中，从而可以在单次运行中测试多种电穿孔条件。对于优化实验，对细胞进行培养、电穿孔后并分析转染效率。
使用 epi 荧光显微镜和流式细胞术，可以选择最有效的电穿孔条件用于将来的转染。大家好，我是 BioRad Laboratories 基因表达部门的高级科学家 Adam McCoy。今天，我们将向您展示一种轻松识别横切原代细胞系的最佳电穿孔条件的程序。
我们在实验室中使用该程序来研究这些细胞中的基因表达。今天，我将使用 mes 或小鼠胚胎成纤维细胞的三种不同传代数。我使用不同的传代编号文化有两个原因。
首先，我将展示细胞健康的重要性对于原代细胞系，即使只是多培养几天也会对转染效率产生影响。其次，我想证明确定最佳条件的过程是相同的，即使老细胞的转染效率下降。您的实验可能不会涉及不同年龄的细胞。
您可以对自己的实验设计遵循相同的过程。如果您想比较基因表达与对照细胞和处理过的细胞，您可以先找到最佳条件，然后使用您确定的条件进行实验。或者，您可以一起进行优化和实验。
就像我今天要演示的那样，我将使用 GFP 编码质粒通过流式细胞术来观察转染效率。但是，即使您正在做不同的事情，例如引入 irna 并通过实时 PCR 查看基因表达，电穿孔程序也是相同的。那么让我们开始吧。
小鼠胚胎成纤维细胞或本方案中使用的 MET 是贴壁细胞。因此，处理这些细胞的第一步是使用涉及胰蛋白酶的标准组织培养方案将它们从培养瓶底部提起。化。细胞从培养瓶中分离后，用含有血清的培养基中和胰蛋白酶，并将细胞收集在 50 毫升锥形管中。
收集后离心，细胞沉淀后的细胞。应通过复苏器清洗它们，将它们悬浮在已知体积的 PBS 中。完全重悬后，对细胞进行计数，知道电穿孔实验需要每毫升 100 万个细胞的浓度。
根据细胞计数计算适当的细胞数，并将它们转移到干净的试管中。Centrifuge 想要更多来沉淀细胞。然后小心地取出 snat。
将细胞重新悬浮在电穿孔缓冲液中，浓度为每毫升 100 万个细胞，并添加每毫升 20 微克质粒。将板分成 96 个孔，每组 4 个孔，每组 4 个孔，每列标记为 1 到 12，第 8 行到 H，或者孔组共享一对电极板，因此这些孔中的细胞经历相同的脉冲。例如，单元 1 A、1 B、1 C 和 1D 在单个井组中电连接，并且都接收到相同的脉冲。
下一组四个孔，两个、A、B、C 和 D 在方案开始时都会接收第二个脉冲，即使参数可能相同，96 孔电穿孔板也被设置成板的上半部分和下半部分被分开。因此，板底部的一个 E、1 个 F、1 个 G 和 1 个 H 孔都接收到一个脉冲。但它与顶部的 1、A、B、C 和 D 井接收到的脉冲不同。
在这个实验中，将只使用一半的板。每个孔组的前三个孔包含不同年龄的细胞。顶行 A 中的单元格已传代 5 次。
B 行的细胞已经传代了 9 次，C 行的细胞已经传代了 13 次。D 行仅在电穿孔前包含电穿孔缓冲液。最好检查您的协议以确保设置正确。
该协议将提供 6 个指数衰减脉冲，然后是 6 个方波脉冲。指数衰减脉冲从 200 伏增加到 450 伏，并且都只使用 350 个微型雪貂。由于所使用的基因脉冲或电穿孔缓冲液的低电阻。
方波脉冲的电压和脉冲持续时间都不同。仪器的电容设置需要与电穿孔混合物的电导相匹配。如果使用更高电阻的缓冲器（如 DMEM）进行电穿孔，则可以使用相同的电压范围，但需要更大的电容，例如用于指数衰减脉冲的 950 个微型雪貂。
如果您不知道您正在使用的缓冲液的最佳电容，您还需要在您正在测试的电穿孔条件下改变电容。下一步是将 150 微升细胞质粒混合物加载到用于该实验的每个孔中。使用的每个孔组的第四个孔中填充有电穿孔缓冲液。
加载板后，将其放入 MXL 板腔室并盖上盖子。然后按脉冲吃掉细胞。该装置根据所选协议中指定的条件，将电脉冲按顺序传送到每个设置的井中。
对所有细胞进行电击祈祷需要几秒钟。脉冲完成后，从发送的板室混合物中取出板。将细胞从每个孔转移到含有预热培养基的培养皿中。
这些 MES 在补充有 10% FBS 对照样品的 DMEM 中生长，这些样品尚未电穿孔，从剩余的细胞质粒混合物中取出，并添加到含有战前培养物的培养皿中。与电穿孔池使用的培养基成分相同。终于漩涡。
然后轻敲板以分配细胞，然后放入培养箱中，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳下放置 24 小时，然后分析转染效率并确定最适合您的实验的电穿孔条件。一旦确定了最佳的电穿孔条件，就可以为未来的实验选择两种电穿孔方法。研究人员可以继续吃掉 96 孔板中的细胞，也可以一次吃掉一个样品中的比色皿中的细胞。
比色皿一次只能吃一个样品，所需体积是 96 孔板中一个孔所需体积的四倍，但当只需要少量样品时，单个比色皿更便宜且易于使用。基因脉冲或 MX 细胞系统的设计使得这次可以在板和比色皿中使用相同的电穿孔设置。不要使用板室，而是使用 mxl shock pod 来放置比色皿。
从仪器背面拔下板室并插入电击舱。由于减震舱仅提供为设置良好的 A、B、C、D 1 编程的脉冲，因此可能需要选择不同的程序。要选择以前保存的程序，请按 Home 键。
然后选择选项 3 用户协议。如果您已在正确的用户文件夹中，请按 Enter 选择用户协议并向下滚动。要突出显示正确的程序，请按 Enter 键选择该程序。
仪器现已准备就绪。现在程序已选定，请设置比色皿。质粒和 MEF 混合物的制备方式与前面所示相同。
用与整个孔组相同的体积加载每个 0.4 厘米的兽医。在 96 孔板中。由于井组是四个孔，每个孔使用 150 微升缓冲液或细胞混合物，每个切细胞使用 600 微升质粒细胞混合物。
接下来，将兽医放入电击舱室，按下脉冲将电击传递到细胞。电穿孔后，如板法混合，然后将细胞等分试样转移到装有预热培养基组对照的细胞培养板中。未进行电穿孔的孔会旋转板和水龙头。
然后将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下恢复 24 小时，然后在转切片细胞并让其恢复后分析转染效率。使用 epi 荧光显微镜定性分析转染效率，并使用已成功电穿孔且现在表达 GFP 基因的流式细胞术细胞定量分析，在 epi 荧光显微镜下显示为绿色，此处显示的典型成功结果。在相差下观察细胞可以观察转染和未切除的细胞。
此处显示的是暴露于 200 伏特最低电压电穿孔脉冲的电池。由于细胞密度高，细胞在很大程度上是汇合的。落射荧光下的相同视野显示许多细胞正在表达 GFP 标记物，但这些细胞只是上图中在 250 伏特下可见的细胞的一小部分。
在 epi 荧光下，在相差下看到的活细胞总数略有减少。我们可以看到，在施加 375 伏的最高电压下，表达 GFP 的电池数量有所增加。可见的活细胞较少，但是，剩余细胞的大部分都在表达 GFP。
哪种条件最优取决于试验设计。在某些实验中，最大数量的转染细胞可能是最佳的。在其他实验中，最高百分比的转染可能是最好的。
我们对每种条件下 GFP 阳性细胞的百分比以及百分比如何随细胞年龄流动而变化感兴趣。细胞术可以提供有关每种不同电穿孔条件下转染结果的定量信息。此处显示的是传代中 GFP 阳性细胞的百分比。
五个单元格。在 12 种电穿孔条件下，在最高电压指数衰减下，最大转染百分比约为 80%。脉冲条件 6 和 70 在最强方波脉冲测试条件 12 下，细胞在电穿孔前通过 9 次。
转染百分比的总体模式几乎相同，但显示的转染百分比略有下降。以下是传代 13 个细胞中 GFP 细胞的百分比，显示相对于年轻细胞，转染百分比显著降低。最高转染百分比大约是年轻细胞的一半，这表明在分离后尽快使用健康细胞的重要性。
我刚刚向您展示了如何使用 MXL 电穿孔系统来确定电检测图或其他原代细胞系的最佳条件。执行此程序时，请务必记住在分离后尽快使用健康细胞，并使用与电穿孔缓冲液匹配的电穿孔条件。就是这样。
感谢您的观看，祝您的实验好运。
概述
本协议展示了使用Gene Pulser MXcell电穿孔系统来优化小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的电穿孔条件。该程序允许快速测试多种条件，并包含故障排除提示。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 基因表达
- 电穿孔技术
背景
- 电穿孔是一种用于将核酸引入细胞的方法。
- 小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）常用于基因表达研究。
- 细胞健康和传代次数可以显著影响转染效率。
- 电穿孔条件的优化对成功的实验至关重要。
研究目的
- 确定MEFs的最佳电穿孔条件。
- 展示细胞传代次数对转染效率的影响。
- 为研究基因表达的研究人员提供可靠的协议。
使用的方法
- 使用胰蛋白酶消化和在电穿孔缓冲液中重悬的方法制备MEFs。
- 将细胞和质粒装入96孔电穿孔板。
- 施加电脉冲以促进核酸摄取。
- 使用流式细胞术和显微镜分析转染效率。
主要结果
- 确定了不同传代次数的MEFs的最佳电穿孔设置。
- 根据细胞健康展示了不同的转染效率。
- 成功应用该协议进行基因表达研究。
- 为未来实验建立了可靠的方法。
结论
- 电穿孔可以有效地优化原代细胞系。
- 细胞传代次数是转染成功的关键因素。
- 该协议为细胞生物学研究人员提供了宝贵的资源。
常见问题
Executive Industry Relevance
Electroporation optimization is a critical early-stage workflow for transfecting primary and stem cells in target validation and assay development. The Gene Pulser MXcell system enables rapid, parallel screening of electroporation parameters to identify conditions that maximize transfection efficiency while preserving cell health. This approach supports mechanistic de-risking by ensuring reliable nucleic acid delivery in disease-relevant systems, directly impacting lead identification and predictive confidence in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of therapeutic hypotheses through efficient plasmid or siRNA delivery into primary cells.
- Operational Value: Supports rapid testing of multiple electroporation conditions in a single run, accelerating target confirmation workflows.
- Predictive Value: Increases confidence in target modulation data by reducing variability from inefficient transfection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible transfection outputs for quantitative assay development.
- Operational Value: Allows seamless transition from 96-well plate optimization to cuvette-based scaling without re-optimization.
- Scalability Value: Facilitates platform reuse across projects by preserving optimal electroporation settings between formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Ensures continuity from discovery to preclinical validation by maintaining consistent gene delivery efficiency.
- Operational Value: Enables passage-number-adjusted protocols to account for primary cell variability in longitudinal studies.
- Risk Mitigation: Reduces false negatives in gene expression assays by confirming optimal conditions before downstream analysis.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, where reliable transfection is essential for phenotypic screening and mechanistic follow-up.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling efficient nucleic acid delivery into primary cells for pathway clarification.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized transfection efficiency metrics for compound or genetic perturbation evaluation.
- Analytics: Provides quantitative flow cytometry and microscopy readouts to compare transfection across conditions and cell states.
- Translational Research: Connects early optimization to preclinical continuity by ensuring consistent transfection in disease-relevant primary cell models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electroporation optimization workflow applicable across multiple primary cell types and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in transfection efficiency, reduction of mechanistic ambiguity in gene expression data.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of transfection workflows across plate and cuvette formats.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions in target validation, capital efficiency through reduced reagent waste, and lower biological risk in downstream assays.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on reliable transfection-enabled data quality.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture, transfection, and flow cytometry.
- Dependent on Gene Pulser MXcell system, electroporation buffer, and compatible 96-well plates or cuvettes.
- Necessitates cross-team standardization of cell preparation and electroporation protocol execution.
- Requires adaptation of voltage, capacitance, and pulse settings based on cell type and buffer conductivity.
- Limited by primary cell availability, passage number effects, and the need for empirical optimization per cell line.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:44
Introduction
2:07
Preparing the Mouse Embryonic Fibroblasts
4:00
The 96-well Electroporation Plates
5:20
Electroporating the MEFs in 96-well Plates
10:11
Epifluorescence Microscopy Images of Transfected Cells
12:26
Conclusion
7:49
Electroporating the MEFs in Cuvettes
