实时成像果蝇胚胎血细胞迁移

果蝇血细胞分散在整个胚胎发育。此协议演示如何安装和图像这些用荧光标记的血细胞的胚胎的迁移。

该视频演示了安装果蝇胚胎以对血细胞进行成像的程序。他们的胚胎巨噬细胞。胚胎由苍蝇在产卵笼中的苹果汁琼脂平板上产卵过夜。

第二天，取出农业板，将胚胎从农业板清洗到细胞过滤器中，然后进行额外洗涤以去除碎屑。将含有胚胎的细胞过滤器浸入漂白剂中以覆盖胚胎。洗掉漂白剂后，胚胎被转移到一滴水中。

然后吸出水滴，胚胎被 hello carbon 油覆盖。将具有可见 he 细胞的适当分期胚胎转移到两个固定的盖玻片之间的每个膜的培养皿中，并在油中小心对齐。然后将第三个盖玻片放在胚胎上，并用指甲油粘住。

胚胎内血细胞的运动现在可以通过显微镜上最上面的盖玻片成像。大家好，我是来自首尔租赁部门 Brian Strm 实验室和伦敦国王学院分子生物物理学的 Jennifer Zaed。我是来自巴斯大学生物与生物化学系伍德实验室的 Ian Evans。

今天，我们将向您展示将 Josephs bryo 安装到该生物体的活体图像、血液部位、胚胎巨噬细胞的程序。我们使用该程序来研究对这些重要免疫细胞的发育、扩散和风反应以及它们用来执行这些过程的细胞骨架机制。那么让我们开始吧。

通过在 UAS 控制下获得适当的 TROs OAL 系来开始此过程，该细胞系包含血细胞特异性 gal 4 驱动程序和遗传编码的荧光报告基因。在这里，serpent gal four 用于驱动来自 UAS Red Stinger 的荧光红色核标志物的表达。有关推荐的 GAL 四驱动程序和 UAS 构建体范围的讨论，请参阅随附的书面协议，将每种性别的 20 只果蝇置于产蛋笼中。

产蛋笼由一个 55 毫升的苹果汁农用板组成，该板安装在塑料管的底部，另一端用纱布覆盖以允许气流。或者，可以使用带孔的简单塑料峰值器。在苍蝇适应新的预热苹果汁格栅后，让苍蝇在笼子里至少适应两天，并让苍蝇在 25 摄氏度下躺

有关收集更谨慎的分期胚胎的信息，请参阅随附的书面协议。一旦果蝇孵育了适当的产蛋时间，使用洗瓶将大约 3 毫升的水涂抹到板上。然后用软头画笔将胚胎从苹果汁中移出，用肉眼将细胞过滤器放在烧杯上，可以很容易地看到脱落的胚胎。

将苹果汁中的水倒入细胞过滤器中以收集胚胎。然后在苹果汁中加入更多的水。阿特。重复过滤过程，直到收集到所需数量的胚胎。

接下来，使用洗涤瓶，使用大约 10 毫升水在细胞过滤器中清洗胚胎。胚胎清洗后，将细胞过滤器放入苹果汁 Aerate 的盖子中。加入足够纯的漂白剂，使胚胎悬浮在细胞过滤器中，以覆盖胚胎。

将细胞过滤器和培养皿盖转移到解剖显微镜上，以跟踪胚胎的装饰。在明场照明下，当背附件溶解时，装饰完成，这应该在两分钟内发生。装饰完成后，从漂白剂中取出含有胚胎的细胞过滤器，再次将过滤器放在烧杯上。

使用洗衣瓶轻柔但彻底地洗掉残留的漂白剂。将蓝色实验室纸巾涂抹在细胞过滤器的底部，以吸干剩余的水。如果蓝色变为白色或存在粉红色残留漂白剂，请继续洗涤，确保在进行下一步之前去除所有漂白剂痕迹。

从细胞过滤器中去除多余的水分，可以更轻松地在下一步中使用画笔拾取胚胎。从胚胎中去除所有漂白剂后，用细画笔将一滴水放入培养皿盖中。从过滤器中收集所有涂层胚胎，并将它们重悬于液滴中。

接下来，在细胞过滤器的外部涂抹化学擦拭布以干燥胚胎。胚胎干燥后，加入一滴 700 的卤素碳油以覆盖所有胚胎。然后在含有胚胎的液滴附近放置第二小滴油。

在荧光解剖显微镜下检查胚胎。确定所需基因型的适当分期胚胎，以对 he 细胞的横向迁移进行成像。在腹侧中线。

选择 13 至 14 期胚胎。在这个例子中，细胞由荧光核识别，在头部和腹侧神经索以及发育中的背血管中可见，以对血液扩散到胚胎上后的运动进行成像，选择 15 期胚胎。在这个阶段，血液将分散在整个胚胎上。

然而，从中线横向迁移后，胚胎腹侧应可见三条平行的血液线。选择胚胎后，使用一对弯曲的 5 号制表师镊子舀起选定的胚胎。注意不要刺穿样品瓶膜。

然后将胚胎放入 50 毫米 Petri perm lumax 培养皿底部的第二滴油中。放入两小滴 Halo Caron 油 700，相距约 1 厘米。在解剖显微镜的明场照明下，将盖玻片涂在每一滴上。

使用弯曲的镊子小心地转移多达 15 个胚胎。将胚胎腹侧向上对齐并平行于盖子的边缘。一旦胚胎在一小滴油上对齐并使其扩散以在两个盖玻片之间形成均匀层，就会滑落。

油扩散后，这可能需要几分钟。检查胚胎是否仍在腹侧。如果胚胎略微滚动，则侧朝上。

用镊子再次重新定位它们。最后使用三号镊子。将第三个盖玻片放在胚胎上。

桥接两个先前粘附的盖玻片。将此盖玻片粘在盖子上。使用指甲油的滑动支撑。

胚胎现在可以进行成像了。这个 SRP gal 四个 UAS Red Stinger 胚胎腹侧朝上安装，并在 Leica M 2 0 5 荧光解剖显微镜上获取延时图像。He 细胞通过其红色标记的细胞核进行可视化。

电影从发育的第 12 至 13 阶段开始，此时 he 细胞离开头部并沿着腹侧中线迁移。大约一小时后，he 细胞开始从中线迁移，沿腹面分散到外侧位置。对于开发的其余部分。

血细胞高度活跃，在整个胚胎中迁移。我们必须向您展示如何监测约瑟夫胚胎以跟踪体内运动或血液侧。进行此程序时，小心处理胚胎很重要，尤其是在岩烫皿上，以避免一旦胚胎在油中损坏，它们相对耐脱水，但应注意不要漂白胚胎在去除冠状体时太久。

最后，通过安装多个胚胎，您将有最好的机会获得处于实时成像完美方向的胚胎。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。