Name: 成像错配修复和DNA损伤的细胞反应枯草芽孢杆菌 /em (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-08T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 学习利用GFP融合蛋白实时成像枯草芽孢杆菌DNA修复复合物形成的方法。该技术通过荧光标记错配修复蛋白，帮助研究人员深入理解细胞DNA损伤响应机制及基因组稳定性维持过程。

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作者谨此感谢Philina S. Lee博士和Alan D. Grossman博士最初对L.A.S.在荧光显微镜技术方面的培训。作者还感谢Melanie Berkmen博士和Hajime Kobayashi博士在成像方面提供的帮助与建议。本研究得到了密歇根大学文学、科学与艺术学院以及分子、细胞与发育生物学系启动资金的支持。

用于显微镜观察的细胞培养
1. 成像前一至两天，准备含有您希望观察的翻译融合蛋白的 B. subtilis 菌株。需要进行步骤1A和1B的试运行，以确定哪种培养条件可为您的菌株提供最佳图像。大多数情况下，应在对数生长阶段对细胞进行成像。
<ol class="ualpha">
<li>对于某些 B. subtilis 菌株（特别是由于在内源位点整合了目的基因与 GFP 的翻译融合而导致生长不良的菌株），成像前需进行为期两天的初始培养以获得高质量图像。第一天，在含有选择性抗生素的 LB 琼脂平板上划线接种待成像的 B. subtilis 菌株，并于 30°C 培养过夜。第二天，用单个菌落接种 100 μl 0.85% 生理盐水，并在含选择性抗生素的 LB 琼脂平板上进行三次 10 倍系列稀释，每个稀释度各取 100 μl 涂布，随后于 30°C 培养过夜。第三天，选择细胞呈轻度融合生长的稀释平板。平板上轻度融合的生长状态可为后续培养提供健康且处于指数生长期的起始接种物，从而有望获得优异的成像结果（见步骤 4）。此步骤对于使用染料 FM4-64 进行最高质量的膜成像尤为有用。 </li>
<li>其他 B. subtilis 菌株则可在成像前一天直接用无菌接种针蘸取单菌落接种于选择性 LB 琼脂培养基上，并于 30°C 培养过夜。次日，该平板上的菌体即可作为成像用的接种物（见步骤 4）。 注意：对于 B. subtilis，液体培养基中的过夜培养并不合适，因为芽孢形成和群体感应反应的共同作用会导致较长的滞后期 1。</li>
</ol>
2. 成像当天早晨，将10 mL S750 1-3 培养基加入一个125 mL的无菌锥形瓶中。
3. 用最多2 mL的S750培养基重悬LB琼脂平板上的单菌落或轻度融合生长的细胞，以制备接种物。
4. 向含有10 mL S750培养基的锥形瓶中加入足量的S750培养基-菌液接种物，使培养液初始在600 nm处测得的光密度（OD600）约为0.08至0.1。此步骤中，必须保证至少10倍的空气与培养基体积比，因此我们在125 mL锥形瓶中使用10至12.5 mL的接种培养基。
5. 将每种培养物在30°C下培养，直至培养物的OD600达到约0.5–0.8。建议使用振荡水浴摇床，转速为每分钟150–200转。使用DNA损伤剂或错配诱导剂处理的培养物，应处于对数生长早期的OD600，以确保在所需处理时间（见表1）的额外培养后，细胞能够达到目标OD600。 
 例如，2-氨基嘌呤需要处理一小时，因此经2-氨基嘌呤处理的培养物应处于OD600约0.3–0.4的阶段，使得经过一小时的处理/生长后，OD600达到约0.5–0.8，此时细胞已准备好用于成像。
样品制备
1. 用移液器将300 μl培养的细胞转入1.5 mL微量离心管中。
2. 若需对细胞膜进行成像，可将FM4-64膜染料（Invitrogen）从1 mg/mL的储存液中按1:1000稀释后加入各样品中。为获得理想的荧光信号，可能需要对FM4-64进行滴定优化。典型的滴定浓度范围为1:100、1:1000和1:10,000。
3. 将样品在室温下静置最多十分钟，或在制备载玻片的同时进行静置，载玻片制备方法如下所述（见“载玻片制备”中的步骤1），即使用1%琼脂糖的1X Spizizens培养基。
4. 如果需要浓缩细胞，我们更倾向于使用0.2 μm滤膜和真空装置过滤细胞。随后可在观察前用PBS、其他合适的缓冲液或培养基轻轻将细胞从滤膜表面洗脱下来。
载玻片制备
1. 配制含1X Spizizens的1%琼脂糖凝胶。 取5 mL 10X Spizizens母液加入45 mL ddH2O中，再加入0.5 g琼脂糖，微波加热至完全溶解。高温熔化的琼脂糖难以用移液器操作，而凝固的琼脂糖则无法吸入移液器吸头。应将琼脂糖溶液置于水浴中平衡至约55–65°C，以便在移液过程中不会在吸头内凝固。
2. 用移液器枪头吸取含有1%熔化琼脂糖的20 μl Spizizen溶液。将琼脂糖溶液轻轻挤出，每孔滴加一滴（约1–2 μL）至载玻片的每个孔中（我们使用15孔载玻片，见表2），形成浅层琼脂糖垫。琼脂糖会立即凝固。载玻片必须在细胞接种前即刻制备。若琼脂糖垫单独置于室温下，数分钟内即可脱水，导致无法使用。 
琼脂糖垫应居中放置并填满每个孔，但高度应尽量低，以避免干扰盖玻片；若液滴过高（呈气泡状）或样品扩散超出孔的边界，可用Kimwipe纸巾将孔擦拭干净后重新添加新的琼脂糖垫。
3. 将全部300 μl样品（见步骤6）加到载玻片上，均匀分布在每个琼脂糖垫的顶部。此细胞量应足以覆盖载玻片上的每个孔。
4. 将载有细胞的载玻片在室温（23°C）下静置约十分钟。此步骤可使细胞沉降到琼脂糖垫上，从而固定不动，准备成像。根据特殊实验需求，该温度可能需要调整，例如在进行需要温度变化的实验时4。
5. 吸去每个孔中多余的培养基，注意不要移走垫片本身。
6. 将盖玻片盖在载玻片上，均匀而轻柔地在整个玻片区域施加压力。检查盖玻片是否紧贴载玻片，确保盖玻片没有翘起或高于载玻片表面。
细胞的可视化
1. 多种不同的荧光显微镜均可良好工作。关键是要配备100倍油镜。Simmons实验室使用的是：
<ul>
 <li>配备1.45数值孔径（NA）TIRFM 100倍油浸物镜的Olympus BX61显微镜</li>
 <li>Hamamatsu ORCAR2 CCD制冷相机</li>
 <li>Prior Lumen 200弧光金属光源</li>
 <li>用于GFP（FITC）检测，滤光片激发波长为460-500，发射波长为510-560</li>
 <li>用于FM4-64（TRITC）检测，滤光片激发波长为510-560，发射波长为572-648</li>
 <li>图像使用SlideBook 4.2采集（图1）</li>
</ul>
2. 使用白光将细胞调至焦点。
3. 使用适用于每种荧光染料的适当滤光片捕获图像。
代表性结果
图1展示了代表性图像。GFP焦点应清晰可辨，而FM4-64染色应明亮且清晰4-7。GFP或膜图像可用任意颜色进行伪彩处理，以便在不丢失任何数据的情况下呈现最高质量的图像。
<img src="/files/ftp_upload/1736/1736fig1.jpg" alt="显示带有GFP标记蛋白的细菌细胞显微图像，经2AP/MMC处理后的荧光分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1：枯草芽孢杆菌（B. subtilis）翻译融合蛋白的代表性GFP图像。 GFP蛋白显示为绿色，FM4-64膜染色显示为红色。白色比例尺表示3 μm。（A） MutS-GFP［相关基因型：mutS-gfp (spc)，amyE::PspacmutL (cat)］，在含有600 μg/mL 2-氨基嘌呤和1 mM IPTG的条件下。未显示FM4-64信号，以便更清晰地展示MutS-GFP焦点。（B） MutL-GFP［相关基因型：mutL::mutL-GFP (spc)］，在含有2-氨基嘌呤的条件下。（C） DnaX-GFP［相关基因型：dnaX::dnaX-GFP (spc)］。（D） RecA-GFP［相关基因型：recA::recA-GFP (spc)］，在含有20 ng/mL丝裂霉素C的条件下。（E） TagC-GFP［相关基因型：tagC::tagC-GFP (spc)］，在含有1 μg/mL丝裂霉素C的条件下。

<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0">
<tbody>
 <tr>
 <td>处理方法 / 浓度或剂量</td>
 <td>功能</td>
 <td>孵育时间</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mitomycin C (MMC) [20 至 150 ng/mL]</td>
 <td>DNA 烷基化试剂</td>
 <td>1 小时</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-氨基嘌呤 (2-AP) [600 μg/mL]</td>
 <td>诱导错配</td>
 <td>1 小时</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>羟基脲 (HU)</td>
 <td>耗竭 dNTP</td>
 <td>3 小时</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>紫外线 (UV) 20 J/m²</td>
 <td>胸腺嘧啶-胸腺嘧啶二聚体及 6-4 光产物</td>
 <td>根据光源不同而变化，通常为 20 秒</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>戈瑞 (电离辐射) 5 至 100 Gy</td>
 <td>双链断裂、单链断裂及碱基损伤位点</td>
 <td>根据光源不同而变化</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
表1. DNA损伤与错配诱导处理方法汇总

<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0">
<tbody>
 <tr>
 <td>试剂名称</td>
 <td>公司</td>
 <td>目录编号</td>
 <td>备注（可选）</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Multitest slide, 15-well</td>
 <td>MP Biomedicals</td>
 <td>6041505E</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microscope Cover Glass</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>12-544-B</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP160-500</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mitomycin C</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M0503-2MG</td>
 <td>诱变剂，需戴手套</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-Aminopurine</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A3509-250MG</td>
 <td>需戴手套</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydroxyurea</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>H8627-25G</td>
 <td>需戴手套</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FM4-64</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>T13320</td>
 <td>避光</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
表2. 特定试剂与设备列表：

<ol><li>Hardwood, C. R., Cutting, S. M. Molecular Biological Methods for Bacillus. , John Wiley and Sons. Chichester. (1990).</li>
<li>Berkmen, M. B., Grossman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+organization+of+the+Bacillus+subtilis+replication+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle.</a> Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).</li>
<li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clp+and+Lon+proteases+occupy+distinct+subcellular+positions+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Clp and Lon proteases occupy distinct subcellular positions in Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 190, 6758-6768 (2008).</li>
<li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+is+required+for+the+RecA+localization+response+to+DNA+damage+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Replication is required for the RecA localization response to DNA damage in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 1360-1365 (2007).</li>
<li>Simmons, L. A., Davies, B. W., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((b+Clamp+Directs+Localization+of+Mismatch+Repair+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">b Clamp Directs Localization of Mismatch Repair in Bacillus subtilis.</a> Mol. Cell. 29, 291-301 (2008).</li>
<li>Simmons, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+responses+to+double-strand+breaks+between+Escherichia+coli+and+Bacillus+subtilis+reveals+different+requirements+for+SOS+induction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction.</a> J. Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).</li>
<li>Smith, B. T., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+mismatch+repair+in+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of mismatch repair in bacterial cells.</a> Mol. Cell. 8, 1197-1206 (2001).</li>
</ol>

寻找每种菌株获得最高质量图像的曝光条件需要进行反复试验；我们发现，白光图像的曝光时间以1毫秒为宜，而GFP（FITC）和FM4-64（TRITC）图像的曝光时间则在100至2000毫秒之间较为合适。曝光时间会因所使用的成像设备不同而有所变化。为简化成像过程，建议每个15孔载玻片上只使用一种菌株，因为如果同一载玻片上存在多种菌株，琼脂糖垫的质量以及细胞从垫边缘扩散可能会影响菌株的区分。图像质量直接取决于细菌所处琼脂糖垫的质量。当细菌并排排列时，从琼脂糖垫上获得的图像质量最高。若琼脂糖垫导致细菌细胞聚集，无法形成单层，则会得到质量较差的图像。过厚的垫会产生较高的背景荧光信号，而脱水的垫则无法使细胞正常贴附。这些琼脂糖垫的缺陷通常会导致图像质量显著下降。若某个孔成像效果不佳，可直接转至下一个孔进行成像。每幅图像中捕获50至200个细胞为宜。荧光显微镜技术已提供了大量信息，详细揭示了指导DNA修复和复制蛋白组装成焦点的细胞信号 体内通过练习，该技术可成功应用于多种细菌物种中的多种蛋白质复合物。

<table><tbody><tr><td colspan="4">特定溶液配方&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;:</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;10x S7&lt;sub&gt;50&lt;/sub&gt; 盐&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 0.5 M MOPS&lt;br/&gt; 100 mM 硫酸铵&lt;br/&gt; 50 mM 磷酸二氢钾&lt;DNA修复和复制复合物在单个细菌细胞中的荧光成像&gt; 过滤除菌，并包裹 S7&lt;sub&gt;50&lt;/sub&gt; 储存前将培养基用铝箔包裹</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;100倍金属溶液&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 0.2 M MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 70 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 5 mM MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 0.1 mM ZnCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 100 &amp;#x03BC;g/mL 盐酸硫胺素&lt;br/&gt; 2 mM HCl&lt;br/&gt; 0.5 mM FeCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;*&lt;br/&gt; dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O至终体积&lt;br/&gt; FeCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 最后添加，以防止沉淀。&lt;br/&gt; 过滤除菌后，用铝箔包裹100倍金属溶液。</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;S7&lt;sub&gt;50&lt;/sub&gt; 培养基&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 1x S7&lt;sub&gt;50&lt;/sub&gt; 盐类&lt;br/&gt; 1x 金属&lt;br/&gt; 1% 葡萄糖&lt;br/&gt; 0.1% 谷氨酸&lt;br/&gt; 40 &amp;#x03BC;g/mL 色氨酸&lt;br/&gt; 40 &amp;#x03BC;g/mL 苯丙氨酸&lt;br/&gt; 蒸馏水 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O至终体积</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;10x Spizizens（克/升）&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 151.4 mM 硫酸铵（20 g/L）&lt;br/&gt; 803.8 mM 磷酸二氢钾（140 g/L）&lt;br/&gt; 440.9 mM 磷酸氢二钾（60 g/L）&lt;br/&gt; 34.0 mM 柠檬酸钠（10 g/L）&lt;br/&gt; 16.6 mM MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (2 g/L)&lt;br/&gt; dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O至终体积&lt;DNA修复和复制复合物在单个细菌细胞中的荧光显微成像 
关键词：荧光显微镜；DNA修复；DNA复制；错配修复；同源重组；SOS反应；枯草芽孢杆菌&gt; 过滤除菌</td></tr></tbody></table>

成像dna损伤修复及细胞对dna损伤的应答 枯草芽孢杆菌

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

原核生物和真核生物均会通过一系列复杂的生理变化来响应DNA损伤。多种DNA损伤和错配的DNA碱基对可刺激基因表达的改变、已有蛋白质的重新分布以及新蛋白质复合物的组装。荧光显微镜作为一种强大的实验工具，已被用于在活细胞复杂的亚细胞结构中可视化和定量这些对DNA损伤的响应，并监测DNA复制状态。通过将荧光报告蛋白与DNA复制和修复机制的组分进行翻译融合，已用于确定将DNA修复蛋白靶向其对应损伤位点的信号线索in vivo并了解这些蛋白质在细菌细胞内的组织方式。此外，与DNA损伤诱导型启动子相连的转录和翻译融合报告系统揭示了群体中哪些细胞激活了基因毒性应激反应。在本综述中，我们提供了利用荧光显微镜对单个细菌细胞中DNA修复和DNA复制复合物的组装进行成像的详细实验方案。特别是，本研究重点对错配修复蛋白、同源重组、DNA复制以及一种SOS诱导型蛋白的成像进行了阐述Bacillus subtilis此处所述的所有步骤均适用于对多种细菌物种中的蛋白质复合物进行成像。

本文详细描述了一种对枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）细胞中DNA修复复合物实时形成过程进行成像的实验方案。

成像DNA损伤修复及细胞对DNA损伤的应答 枯草芽孢杆菌

原核生物和真核生物均通过一系列复杂的生理变化响应DNA损伤。基因表达的改变、蛋白质的重新分布……

构建含有错配修复蛋白与 GFP 融合的翻译融合蛋白的 Baus TLU 菌株。将融合蛋白菌株在选择性培养基上划线培养。挑取划线生长的菌落用于液体培养中的新鲜接种。将细胞培养至 OD 600 达到 0.3 至 0.4，随后施加所需的诱导错配处理，并继续培养细胞，直至 OD 600 达到 0.5 至 0.8 时收集细胞。如需要，可加入膜染料 FM 4-64，将细胞接种到预先制备好 agarose 垫片的载玻片上，去除多余培养基后，静置使其沉降。通过抽吸法去除液体。加盖盖玻片后，通过显微镜观察细胞。大家好，我是来自密歇根大学安娜堡分校分子、细胞与发育生物学系Lyle Simmons博士实验室的Andrew Kow博士。今天我们将展示一种用于观察DNA错配修复蛋白以及其他修复蛋白和核糖体蛋白在枯草芽孢杆菌中翻译融合表达的实验方法。我们采用此方法研究枯草芽孢杆菌活细胞中DNA错配修复蛋白与核糖体蛋白之间的相互作用。现在开始操作。首先，准备含有您希望观察的翻译融合蛋白的枯草芽孢杆菌菌株。在成像前一天开始培养即可。例如，当绿色荧光蛋白（GFP）与目标基因的翻译融合体被整合到基因的内源位点时，某些菌株（如 MU LGFP）能够良好生长。若在成像前一天开始培养，需在无菌条件下使用无菌接种针将细菌接种至含有选择性抗生素的LB琼脂平板培养基上。为了获得单菌落，需在30摄氏度下过夜培养，次日将使用这些菌落制备起始接种物。某些B sublist菌株需要在显微镜观察前培养两天才能获得高质量图像。由于翻译融合导致生长不良的特定菌株即需培养两天，例如rec A GFP；第一天需将细菌划线接种于选择性LB AED培养基上，并过夜培养。第二天进行梯度稀释。首先挑取单个菌落接种于100 µL 0.85%生理盐水中，然后进行四次十倍梯度稀释，分别取每种生理盐水稀释液以及原始菌落和生理盐水各100 µL，涂布于含有选择性抗生素的LB琼脂平板上，30°C条件下培养过夜。第二次过夜培养后，选择细胞呈轻度融合生长的稀释平板。这些可提供健康且呈指数生长的起始接种物，有望获得优良的成像结果。这对于膜染色的最高质量成像尤为有用。在成像当天早晨，将10毫升S750培养基加入到一个125毫升的无菌锥形瓶中，使用FM 4-64。因此需保持至少十倍的空气与培养基比例。用最多两毫升的S750培养基重悬来自LPPL的单菌落或类似汇合度的细胞，以制备接种物。将足量的S750培养基细胞接种物加入含有10毫升S750培养基的锥形瓶中，使培养液的初始OD600约为0.08至0.1。接下来，在适合成像 B 副列表菌株的温度下培养每种菌液。建议使用摇水浴，转速为每分钟 150 至 200 转。持续培养菌液，直至其 OD 600 达到约 0.5 至 0.8。对于使用DNA损伤剂或诱导错配试剂处理的培养物，应规划处理方案，使DNA修饰试剂的孵育期结束时间恰好与达到目标OD 600的时间一致。例如，2-氨基嘌呤（two amino purine）是一种DNA类似物，当其掺入基因组时可模拟错配碱基，需要1小时的孵育时间，可导致错配修复蛋白（如mut LGFP）形成焦点。然而，REC A GFP焦点的形成则需要与丝裂霉素C（mitomycin C）或其他DNA损伤试剂孵育1小时，以诱导双链DNA断裂，此时需同时添加2-氨基嘌呤和丝裂霉素C。当培养物的 OD 600 达到约 0.3 至 0.4，并在相应处理条件下继续生长一小时后，培养物的 OD 600 通常会达到 0.5 至 0.8，此时可进行成像。首先，用移液器将 300 微升培养细胞转移至 1.5 毫升微量离心管中。若需对细胞膜进行成像，可将浓度为每毫升 1 毫克的 FM 4 64 膜染料以 1:1000 的比例加入各样本中；但可能需要对 FM 4 64 进行滴定，以获得理想的荧光信号。典型的滴定范围为1到100、1到1001到10,000。让样品静置最多10分钟，或在制备载玻片的同时进行静置。如果需要浓缩细胞，使用0.2微米滤膜和真空装置过滤细胞。在细胞样品孵育的同时，用适当的缓冲液或培养基轻轻将细胞从滤膜上冲洗下来。用 FM 4 64 进行染色。通过将 5 毫升 10 x zen 储液加入 45 毫升蒸馏水并加入 0.5 克琼脂糖，微波加热溶解，配制 1% 琼脂糖溶液。将琼脂糖置于水浴中，使其温度平衡至约 65 摄氏度，吸取 20 微升样品。用含有 1% 熔化琼脂糖的枪头进行操作。若琼脂糖温度过高，则难以移液；若琼脂糖过冷，则会凝固而无法进入枪头。接下来，使用多孔测试载玻片（15孔），将约一到两微升的aROS溶液分别用移液器滴加到每个孔中，形成浅层aROS垫，aROS会立即凝固。载玻片应在接种细胞前立即制备，以避免脱水，否则载玻片将无法使用。Aros 垫应居中放置并填满每个孔，但高度应尽量低，以避免干扰盖玻片。如果液滴过高、呈气泡状或样本扩散超出孔的边界，只需用无尘纸擦拭孔内，重新添加一个新的 aros 垫即可。现在载玻片已准备就绪，将之前保留在微量离心管中的全部 300 微升样品加入载玻片，使样品均匀分布在每个气溶胶垫的表面。此细胞量应足以覆盖载玻片上的每个孔。将加样后的载玻片置于室温下静置约 10 分钟。此步骤可使细胞在琼脂糖垫上沉降并保持静止，从而在10分钟孵育结束时准备好进行成像。用移液器吸去每个孔中的多余培养基，注意不要移走琼脂糖垫本身。将盖玻片盖在载玻片上，均匀而牢固地轻轻按压整个区域，并检查确认盖玻片已紧贴载玻片表面，且盖玻片未高于载玻片。进行成像时，多种不同的荧光显微镜均可获得良好效果。必须配备100倍油镜。Simmons实验室使用的是Olympus BX 61显微镜，配备数值孔径为1.45的100倍油浸物镜，适用于全内反射、荧光显微镜或草坪显微镜（turf m）。显微镜还配备有CCD制冷相机和LU 200弧形金属光源。首先使用白光将细胞调至焦点。对每种菌群使用相应的滤光片。用于GFP检测时，采用激发滤光片460-500，发射滤光片510-560。用于FM 4-64检测时，采用激发滤光片510-560，发射滤光片572-648。使用适用于每层的滤光片捕获图像。通过载玻片书 4.2 软件进行四次成像。以下是成像DNA错配修复蛋白MU L的结果示例，该蛋白已与GFP在翻译水平上融合。未处理的MU LGFP对照培养物仅显示极少的焦点，大多数细胞中仅含有细胞质水平的mut LGFP融合蛋白。然而，大多数在存在两种氨基嘌呤的情况下生长的细胞会形成GFP焦点，表明mutal GFP蛋白参与了错配DNA碱基的识别与修复。其中，两种氨基嘌呤在整合入基因组时可模拟错配碱基。使用在DNA损伤诱导药物丝裂霉素C存在下培养的recA-GFP菌株，也可获得类似结果。在此情况下，大多数细胞在经丝裂霉素C处理后均出现recA-GFP荧光焦点，表明recA-GFP对DNA损伤产生响应，并启动了修复过程；而在未经丝裂霉素C处理的细胞中则未观察到phoIR现象。我们刚刚向您展示了如何在活的肺炎链球菌细胞中可视化观察修复蛋白。进行该实验操作时。需要记住的是，务必耐心操作，将细胞调整到合适的焦距，而这一过程可能需要一些练习。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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成像错配修复和DNA损伤的细胞反应枯草芽孢杆菌</em

我们介绍了一种利用二维琼脂糖凝胶分析来鉴定紫外线照射后产生的复制中间体结构的实验方法。...

紫外线诱导的复制中间体的可视化 E. coli 使用二维琼脂糖凝胶分析

电子能谱成像能够在纳米级分辨率下对核酸与蛋白质进行成像并加以区分。该技术可与miniSOG系统结合使用，后者能够在透射电子显微镜样品中特异性地标记目标蛋白。本文以双链断裂修复灶为例，说明这些技术的应用。...

miniSOG标记的DNA修复蛋白与电子光谱成像（ESI）联合可视化

本实验方案的目的是描述如何利用激光显微照射诱导不同类型的DNA损伤，包括相对简单的链断裂和复杂损伤，以研究DNA损伤信号传导及修复因子在损伤位点的聚集。 在体.

激光微辐照技术用于研究 体内 细胞对简单和复杂DNA损伤的反应

共聚焦荧光显微镜与激光显微照射技术可用于在细胞核内特定区域诱导DNA损伤，并监测DNA修复蛋白的响应。该技术极大地推动了我们对损伤识别、信号传导及蛋白募集过程的理解。本文展示了如何利用这些技术研究单链和双链断裂的修复过程。...

激光微照射技术在哺乳动物细胞单链与双链断裂修复研究中的应用

双链DNA断裂的修复是一个动态过程，不仅需要在断裂位点形成修复复合物，还要求在损伤被处理后对这些复合物进行解聚。本文中，我们采用免疫荧光显微技术，针对瞬时性和持久性双链断裂，作为解析基因组维持机制的工具。...

通过免疫荧光显微镜表征瞬时性和持久性DNA双链断裂中的DNA修复过程

中子混合束在硼中子俘获治疗（BNCT）中的应用所引发的辐射诱导DNA损伤应答尚未完全阐明。本方案提供了一步一步的操作流程，用于在中子混合束辐照后，通过免疫荧光染色法检测人结肠癌细胞系中DNA修复蛋白的辐射诱导焦点（RIF）。...

人结肠癌细胞中DNA损伤与修复灶的免疫荧光成像

DNA损伤后，人类细胞会激活重要的修复通路，以恢复基因组的完整性。本文描述了间接免疫荧光方法，用于检测DNA修复蛋白，分析其在时空上的招募动态，并有助于研究DNA损伤位点处的蛋白质-蛋白质相互作用。...

通过免疫荧光技术观察DNA修复蛋白的相互作用

本文介绍了免疫染色和染色质免疫沉淀的关键步骤。这些实验方案常用于研究与DNA损伤相关的细胞过程，并用于可视化及定量分析参与DNA修复的蛋白质的募集情况。...

可视化与定量内切酶介导的位点特异性DNA损伤

本实验方案描述了一种用于可视化DNA损伤应答中被激活的DNA双链断裂信号蛋白及其在有丝分裂过程中定位的方法。...

活细胞中DNA损伤应答蛋白的二维与三维实时成像

比率型双分子信标（RBMBs）可用于在活细胞中对单个工程化RNA转录本进行成像。本文中，我们描述了RBMBs的制备与纯化方法，通过微孔电穿孔将RBMBs递送至细胞，以及实时荧光成像单个RNA转录本的过程。...

活细胞中利用比率型双分子信标对单个工程化RNA转录本进行实时成像

学习利用GFP融合蛋白实时成像枯草芽孢杆菌DNA修复复合物形成的方法。该技术通过荧光标记错配修复蛋白，帮助研究人员深入理解细胞DNA损伤响应机制及基因组稳定性维持过程。

成像DNA损伤修复及细胞对DNA损伤的应答枯草芽孢杆菌

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