一种改进的从湿地松（P. taeda L.）及其他针叶树种中分离RNA的方法

以下内容由佐治亚大学及沃内尔森林与自然资源学院的研究人员制作。本演示视频介绍了从火炬松（Pinus Teta，俗称lob lolly pine）中采集木质部和韧皮部组织并随后进行RNA提取的方法。火炬松是美国森林产品生产中最重要的针叶树种。树木伐倒后（本例为一棵40年生的树木），主干被截成若干段长约50厘米的原木。

然后用链锯在原木上纵向切割几处刻痕，以便去除树皮。使用锤子和木工凿将树皮撬起，直至可以分段剥离。接着，手工去除韧皮组织，并从树皮内侧剥离下来，立即浸入液氮中。

去除树皮后，可用单面剃须刀片刮取原木表面的次生木质部薄层。将湿润的木质部组织立即放入液氮中。在此次采集中，我们在从主茎上切割枝条之前，还采集了反应木样品，通常称为压应力木和对侧木。

首先用喷漆标记枝条的方位，以确定枝条上部含对立材、下部含压缩材的区域。去皮过程中，先用链锯沿压缩材与对立材的分界线划痕，然后进行去皮操作，方法与主干原木相同，但仅去除与相应反应材类型相对应区域的树皮。

采伐木材时，可在任意时间将其移除。通常从这些较细的枝条上剥离大块树皮更为困难。次生木质部的应变木材样品与普通次生木质部一样，用剃刀刮取后立即浸入液氮中收集。

注意压应力木特有的红褐色。值得注意的是，从一棵大树采集和处理多个样品需要多人协作，每位参与者执行指定任务，以便同时采集所有类型的组织，从而帮助减少RNA降解。将冷冻的样品和液氮随后转移至已标记的储存袋中，并置于干冰上，运回实验室。我们的第一步是使用SPECS Model 6850冷冻研磨机对组织进行粉碎。与使用研钵和研杵研磨相比，该步骤显著提高了木质组织样品的RNA提取产量，同时利用液氮保持样品低温。

首先将组织手工剪碎，并放入样品室中。将样品室插入载体并固定到位，然后对样品研磨两分钟。最终产物呈粗粉状。

RNA 提取方案需耗时两天。第一天，将 2.5 克冷冻组织加入已加热至 65 摄氏度的 RNA 提取缓冲液中。样品需剧烈振荡混匀，然后加入等体积的氯仿，再通过轻柔颠倒混合样品。

将样品置于旋转轮上旋转五分钟。随后将样品转移至高速特氟龙Oakridge管中，使用SS 34转子在12,000 RPM条件下离心五分钟。将上层水相转移至新离心管中，并加入等体积一半的氯仿。

将样品涡旋振荡1分钟，然后再次置于旋转轮上旋转5分钟。第二次离心后，将水相再次转移至一个50 mL高速聚丙烯管中，在10,000 RPM条件下离心20分钟。为去除任何残留的颗粒物，将样品倾入一个50 mL Falcon管中，并向样品中加入四分之一体积的10摩尔氯化锂溶液。

样品经振荡混匀后，于4 °C下静置过夜。第二天，将氯化锂沉淀的样品在4 °C条件下以11,000 RPM离心30分钟。

倒出并弃去上清液，将离心管倒置在化学清洁纸上静置一分钟。为去除多余的液体，将可见的RNA沉淀重悬于800 µL已预热至65 °C的热SSTE缓冲液中。务必用移液器反复吹打数次，并在沉淀边缘周围充分吹打，以确保其完全溶解。

接下来，将重悬的RNA转移至一个2毫升及以上且无RNA酶的微量离心管中。将样品在65摄氏度水浴中加热1至2分钟，随后涡旋振荡，以确保样品完全重悬。如有必要，可重复此步骤。

现在，加入等体积的缓冲酚-氯仿。将样品涡旋振荡15至20秒，然后在14,000 RPM下离心3分钟。将水相转移至新的微量离心管中，并加入等体积的异丙醇。

样品的涡旋和微量离心操作与前次提取相同。在最后的有机提取阶段，先将锁紧胶管在11,000 RPM下微量离心两分钟。

接下来，将上一步提取的RNA样品加入相位锁定凝胶中，随后加入等体积一半的氯仿，通过轻轻吹打混匀。样品在11,000 RPM条件下离心5分钟，然后将水相RNA样品转移至新的Ambion RNA-free离心管中。下一步为简单的RNA沉淀步骤，向样品中加入十分之一体积的3摩尔乙酸钠（pH 4.8）和两倍体积的100%乙醇。

将样品涡旋混匀，短暂置于-80 °C冰箱中冷冻30分钟，然后在4 °C条件下以微量离心机离心30分钟。小心吸除上清液，用1 mL冰预冷的70%乙醇洗涤白色沉淀物，吸除乙醇后重复洗涤一次。将离心管敞口置于实验台上5分钟，使残留乙醇自然挥发。

将RNA沉淀物重悬于100 µL的DEPC水中，通过涡旋振荡并在65°C加热使其溶解。如有必要，可重复此步骤。测定样品浓度。

通过分光光度法测定并计算260/280和260/30比值，以评估样品中蛋白质和碳水化合物污染的程度。采用1%琼脂糖凝胶电泳对样品质量进行定性评估，包括基因组DNA污染和RNA降解情况。对于关键样品，进一步使用安捷伦2100生物分析仪检测核糖体28S/18S比值及RNA完整性数值（RIN），以评价样品完整性。感谢您观看我们关于LOB杂交松树组织样品采集及总RNA提取的视频。

以下人员负责本培训视频的拍摄与制作。