Name: 的RNA分离方法的改进火炬松（ P。火炬松 L）和其他针叶树种 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 学习从火炬松（Pinus taeda）的木质部和韧皮部组织中高效分离高质量RNA的改进方法。该技术克服了针叶树种中高含量酚类和多糖类物质对RNA纯化的干扰，为林木基因组学研究提供可靠的实验方案。

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我们谨向以下各位致以诚挚感谢，若无他们的帮助，松树组织的采集工作将无法完成：Dr. Joe Nairn、Matt Bryman、Michael Bordeaux、Ujwal Bagal、Huizhe Jin 和 Amanda Bouffier。

第1部分：树木采收
选定树木并将其砍伐后，应尽快仔细操作。每种不同类型的组织在采集后，应立即分别放入液氮容器中，以避免样品材料之间的交叉污染。该RNA提取方案具有可扩展性。
<ol> 
 <li>将原木截成约 0.5–0.75 m 长的段，并使用链锯沿原木纵轴方向在树皮上划开两到三处刻痕。</li>
 <li>使用木凿从刻痕处开始撬动，使树皮逐渐与木材分离；一边继续用凿子操作，一边向后拉扯树皮，直至其完全从茎干上剥离。</li>
 <li>用直边单面剃刀沿已去皮原木的纵轴方向刮取次生木质部。佩戴乳胶手套以尽量减少组织污染。</li>
 <li>位于树皮内侧的韧皮部可通过手工剥离轻松获取。</li>
 <li>反应木材从枝条的下侧采集，采集前需用喷漆标记以指示其相对于地面的原始方向。</li>
 <li>将枝条截成 1–2 m 长的原木段，并沿纵轴方向在相对的两侧划痕，以大致标示出两种反应木材的位置：对侧木材（位于枝条上侧）和压应力木材（位于枝条下侧）。按上述方法将树皮从枝条上分离，但每次仅去除覆盖某一类反应木材的树皮。然后按上述方法采集次生木质部或韧皮部，并立即放入液氮中。</li>
 <li>其他样品（如针叶、嫩梢和幼嫩球果）可根据需要用手或修枝剪采集。</li>
 <li>采集后用液氮速冻的样品应放入标记好的袋子或合适的容器中，并用干冰包装后运回实验室。</li>
</ol>
第2部分：样品的冷冻研磨机处理
 <ol>
 <li>向SPEX 6850冷冻研磨机的储罐中加入液氮，并将冲击杆放入其中一个研磨瓶中，加入液氮进行预冷。倒出液氮后，将样品加入研磨瓶中。</li>
 <li>确保研磨腔内无残留的过量液氮，并在安装端盖密封腔体前，彻底排出多余的氮气。</li>
 <li>将研磨瓶插入研磨载体中并关闭盖子。</li>
 <li>对木质样品以14号速率设置进行两次研磨，每次1分钟。</li>
 <li>使用经液氮预冷的刮勺将研磨后的样品（木粉）转移至已预冷并含有少量液氮的烧杯中。</li>
 <li>将液氮与样品的混合物倒入储存容器中，并于-80°C保存，直至使用。</li>
 </ol>
第3部分：RNA提取，第1天
 <ol>
 <li> 将 20 mL RNA 提取缓冲液加入一个 50 mL 带盖 Falcon 管中，加入 400 μL β-巯基乙醇，短暂涡旋混匀，然后置于 60°C 水浴中加热。</li>
 <li> 向每根管中加入 4 g 冷冻组织。盖紧管盖，手动剧烈振荡，随后涡旋 10 秒。</li>
 <li> 向管中加入等体积的氯仿，轻轻颠倒混匀。将管子置于旋转轮上，进行头尾翻转混合 5 分钟。</li>
 <li> 将混合物倒入 50 mL Oak Ridge 管中，在 SS34 固定角转子中以 12,000 rpm（17,200 ×g）离心 5 分钟。</li>
 <li> 将水相转移至新的 Oak Ridge 管中，并加入半体积的氯仿。</li>
 <li> 涡旋 1 分钟，然后在旋转轮上继续混合 5 分钟。在 SS34 固定角转子中以 12,000 rpm（17,200 ×g）离心 5 分钟。</li>
 <li> 将水相转移至新的 Oak Ridge 管中，并加入半体积的氯仿。涡旋 1 分钟。在 SS34 固定角转子中以 12,000 rpm（17,200 ×g）离心 10 分钟。</li>
 <li> 将水相转移至 50 mL 高速聚丙烯管中，在 SS34 固定角转子中以 10,000 rpm（11,900 ×g）离心 20 分钟。</li>
 <li> 将上清液倾入 50 mL Falcon 管中，并向上清液中加入四分之一体积的 10 M LiCl 溶液。短暂涡旋后，于 4°C 放置过夜以进行沉淀。</li>
 </ol>
第4部分：RNA提取，第2天
 <ol>
 <li> 开始实验前，将 SSTE 缓冲液在 65° C 水浴中预热。</li>
 <li> 将经 LiCl 沉淀的样品倒入聚丙烯管中，在 4° C 条件下，使用 SS34 固定角转子以 11,000 rpm（14,450 ×g）离心 30 分钟，使 RNA 沉淀。</li>
 <li> 离心后，倒掉并弃去上清液，将管子倒置于 Kimwipes 纸上约 1 分钟，用移液器吸除残留的上清液。</li>
 <li> 使用移液器将每份沉淀重悬于 800 μL 预热的 SSTE 缓冲液中，充分混匀样品，然后将重悬后的样品转移至 2 mL Ambion 无 RNA 酶的微量离心管中。</li>
 <li> 在 65° C 加热样品 2 分钟，随后剧烈涡旋振荡，以确保完全重悬。</li>
 <li> 向每个样品管中加入等体积 pH 8 的苯酚-氯仿试剂，涡旋振荡 30 秒，然后在微量离心机中以 14,000 rpm 离心 3 分钟。</li>
 <li> 将水相转移至新的 2 mL Ambion 无 RNA 酶的微量离心管中，加入等体积的氯仿，每个样品涡旋振荡 30 秒，再在微量离心机中以 14,000 rpm 离心 3 分钟。</li>
 <li> 将水相转移至预先在 11,000 rpm 条件下离心 2 分钟处理过的 Phase-Lock Gel 管中，加入半体积的氯仿，轻轻吹打混匀。</li>
 <li> 以 11,000 rpm 离心 5 分钟，然后将水相转移至新的 2 mL Ambion 无 RNA 酶的微量离心管中。</li>
 </ol>
第5部分：RNA沉淀与乙醇洗涤
 <ol>
 <li> 向水相中加入 50 μL 3.0 M 醋酸钠（pH 4.8）和 1 mL 100% 乙醇。涡旋混匀后，在 -80°C 下沉淀 30 分钟，或在 -20°C 下过夜沉淀。</li>
 <li> 在 4°C 下以 14,000 rpm 离心样品 30 分钟，小心吸除上清液，切勿扰动沉淀。</li>
 <li> 用 1 mL -20°C 的 70%（v/v）乙醇洗涤 RNA 沉淀。在 14,000 rpm 下离心 1 分钟，然后吸除乙醇。</li>
 <li> 重复步骤 5.3。</li>
 <li> 打开管盖，在室温下晾干沉淀 3–5 分钟。</li>
 </ol>
第6部分：最终重悬与定量
<ol>
	<li> 每个沉淀物用 100 μL DEPC 处理水重悬。涡旋混匀后，于 65°C 孵育 2 分钟，然后置于冰上。必要时重复此步骤以确保样品充分重悬。</li>
 <li> 如有需要可合并同类样品，并用 10 mM Tris（pH 7.5）将样品稀释至 1:10，总体积为 50 μL，用于分光光度法定量。260/280 和 260/230 的吸光度比值通常分别大于 2.1 和 2.2。RNA 提取产量范围为每克冻存组织 60–120 μg。</li>
 <li> 取 1.5–2.5 μg RNA 在含 TAE 缓冲液的 1% 琼脂糖凝胶上进行电泳分析。对于要求更高的样品，可按照制造商说明书使用 Agilent 2100 Bioanalyzer 进行 RNA 分析。</li>
 </ol>
代表性结果：
 不同针叶树组织的RNA提取产量范围为60-120 μg/g 木质样品的冻组织通常可获得约70–80 g/g冻组织的产量。260/280和260/230的诊断比值通常均大于2.1，分别表明RNA样品中无显著的酚类或碳水化合物污染。经琼脂糖凝胶电泳分析并用EtBr染色后，样品应显示25S、18S和5S RNA三条清晰条带（图1）。在琼脂糖凝胶上判断28S与18S的化学计量比具有一定的主观性，凝胶电泳条件、染色方法及上样量等因素均可能影响结果。一般而言，28S:18S比值表现为 &gt; 1.5. 然而，某些针叶树样品的比值较低。例如，在进行 Agilent 2100 分析后，我们已观察到多个来自不同组织类型的针叶树样品，其化学计量比接近 1.2:1。因此，通过琼脂糖凝胶电泳显示的明显偏低的 28S:18S 化学计量比并不一定表明样品质量差。叶片、嫩枝和球果样品常因含有叶绿体核糖体 RNA 而出现额外的清晰条带。无法从加样孔迁移或具有高分子质量的溴化乙锭染色物质（&gt;8–10 kb）通常表明存在基因组DNA污染（图2）。在5S条带附近或低于5S条带处出现低分子质量弥散条带，以及核糖体条带染色减弱或明显的18S条带 &gt; 28S 的化学计量比是判断 RNA 是否发生降解的良好指标（图3）。在 Agilent 2100 电泳图谱分析中，基线应较低且相对平滑，主要峰对应于 18S 和 28S 核糖体 RNA，其 28S:18S 比值范围通常在 1.2 至 2.0 之间。Agilent RNA 完整性数值（RIN）可能是评估 RNA 质量更可靠的指标，用于制备微阵列靶标的 RNA 其 RIN 值应至少为 7 或更高。图4 显示了典型的 Agilent 2100 木质部 RNA 电泳图谱，其 28S:18S 比值为 1.4，RIN 值为 8.6；而图5 显示的是质量较差的木质部 RNA 样品，其基线显著升高，并表现出明显降解，28S:18S 比值为 0.65，RIN 值为 3.4。

<img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig1.jpg" alt="电泳结果，RNA分离，28S、18S和5S条带，显示分子标记" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 高质量松树RNA的琼脂糖凝胶分析。第1道：NEB 1 kb标准分子量标记；第2道：来自火炬松次生木质部的典型总RNA提取结果，显示特征性的核糖体28S、18S和5S条带，以及明显的28S:18S比值 &gt;1.
<img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig2.jpg" alt="琼脂糖凝胶电泳结果；RNA分离，18S、28S条带；分子量标记。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2. 松树RNA样品中基因组DNA污染的琼脂糖凝胶分析。泳道1，NEB 1 kb标准，泳道2，显示基因组DNA污染的木质部RNA样品。
<img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig3.jpg" alt="凝胶电泳结果；RNA完整性；可见28S、18S rRNA条带；分子量标记。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3. 松树样品的琼脂糖凝胶分析，显示RNA降解及基因组DNA污染。泳道1：NEB 1 kb标准，泳道2：木质部RNA样品，显示基因组DNA污染和严重的RNA降解。
<img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig4.jpg" alt="显示晶体结构分析峰的X射线衍射图；数据可视化方法。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 图4. 使用所述方法从火炬松木质部分离的总RNA的Agilent 2100电泳图。28S:18S比值为1.4，RIN值为8.6
<img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig5.jpg" alt="显示保留时间与强度数据的色谱结果图，包含峰分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 图 5. 顶端尖端总RNA的Agilent 2100电泳图，显示严重降解和基因组污染。28S:18S比值为0.65，RIN值为3.4

<ol><li>Chang, S., Puryear, J., Cairney, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+method+for+extracting+RNA+from+pine+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Reporter%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient method for extracting RNA from pine trees.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 113-116 (1993).</li>
<li>Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Siműes, M., Dean, J. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+the+Loblolly+Pine+PtGen2+cDNA+Microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray.</a> Journal of Visualized Experiments. 25, (2009).</li>
</ol>

从针叶树物种中获取高质量RNA可能是一项困难的任务，因为其木质组织中含有较高水平的酚类和多糖化合物。在Chang等人（1）所建立的实验方案基础上，我们发现，采用更为严格的提取和纯化步骤，能够从多种针叶树物种的不同木质和非木质组织样本中稳定地分离出极高纯度的总RNA。本视频不仅展示了我们改进后的RNA分离方案，还介绍了在进行RNA提取之前，用于长叶松的野外采样及样品处理技术的具体步骤。这些采样和制备步骤对于最大限度减少野外采集样本中RNA的降解，以及提高RNA的质量和总得率，具有同等重要的意义。尤为重要的是，我们发现，采用该方法制备的RNA在用于与PtGen2长叶松微阵列（2）杂交的微阵列探针制备时，相较于其他方法，能够显著提高cDNA的合成得率。

<table><tbody><tr><td>RNA提取缓冲液</td><td></td><td></td><td>2% CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），2% PVP（聚乙烯吡咯烷酮；分子量30-40,000），100 mM Tris-HCl（pH 8.0），25 mM EDTA，2.0 M NaCl，0.5 g/L 亚精胺</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>菲舍尔科技公司</td><td>C298-4</td><td></td></tr><tr><td>超纯苯酚</td><td>英韦特罗根公司</td><td>15509-037</td><td></td></tr><tr><td>10 M LiCl</td><td></td><td></td><td>用DEPC处理水配制</td></tr><tr><td>SSTE缓冲液</td><td></td><td></td><td>1 M NaCl，0.5% SDS，10 mM Tris-HCl（pH 8.0），1 mM EDTA（pH 8.0）</td></tr><tr><td>3 M 醋酸钠（NaOAc），pH 4.8</td><td></td><td></td><td>用DEPC处理水配制</td></tr><tr><td>苯酚-氯仿（pH 8.0）</td><td></td><td></td><td>120 mL 苯酚，160 mL 氯仿，用0.5 M Tris-Cl（pH 8.0）多次平衡</td></tr><tr><td>橡树岭高速特氟龙管</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>#05-562-16B</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯50 mL高速离心管</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>#05-562-10K</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon，无菌带盖50 mL锥形一次性离心管</td><td>VWR国际公司</td><td>#21008-939</td><td></td></tr><tr><td>相锁凝胶重型，2 mL</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>#2302830</td><td></td></tr><tr><td>Ambion RNase-free微量离心管，2 mL</td><td>Ambion</td><td>#AM12425</td><td></td></tr></tbody></table>

一种改进的从湿地松（p. taeda l.）及其他针叶树种中分离rna的方法

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine (P. taeda L.) and Other Conifer Species

从松科等针叶树种中分离的组织，特别是像火炬松（Pinus taedaL.) 含有高浓度的酚类化合物和多糖，这些物质会干扰 RNA 的纯化。从这些物种中分离高质量 RNA 需要在野外进行严格的组织采集，并采用包含多个有机萃取步骤的 RNA 提取方案，以获得足以用于微阵列及其他基因组分析的高质量 RNA。从野外采集的火炬松样品中提取高质量 RNA 可能具有挑战性，但对标准组织和 RNA 提取流程进行若干改进后可显著提高结果。如果样品在野外未被正确采集和运输，尤其是大规模采收时，总 RNA 的降解程度会明显增加。在 RNA 提取前，使用液氮冷冻研磨仪将样品粉碎，可显著提高总 RNA 产量，特别是当样品来源于木质组织时。这主要是因为氧化剂（如酚类化合物）和多糖在大多数针叶树种木质组织提取物中含量较高。若不彻底去除，这些污染物可能残留下来，导致 RNA 降解等问题，从而造成产量低下和 RNA 样品质量差。酚类化合物和多糖的残留还可能降低甚至完全抑制逆转录酶或其他常用于 cDNA 合成的聚合酶的活性。特别是，若 RNA 将用于双链 cDNA 文库构建、PCR 或 qPCR 的单链 cDNA 合成，或微阵列探针材料的制备，则其质量必须达到最高标准，研究人员才能获得最佳实验结果。常用于其他许多植物物种的 RNA 提取技术往往难以有效去除针叶树样品中的这些污染物，因此无法获得适用于下游操作的总 RNA 样品。在本视频中，我们演示了针叶树组织的野外采集方法，从砍伐一棵四十年生的树木开始，到采集韧皮部、次生木质部和反应木木质部。我们还展示了一种 RNA 提取方案，该方案 consistently 获得高质量 RNA，适用于后续的酶学操作。

许多植物组织，包括来自湿地松（Pinus taeda L.）的韧皮部和木质部，含有高水平的酚类物质和多糖，这些成分会干扰RNA的纯化。本介绍讨论了从田间采集植物组织并分离出适用于微阵列及其他基因组分析的高质量RNA的技术。

一种改进的从湿地松（P. taeda L.）及其他针叶树种中分离RNA的方法

从松科（Pinaceae）等针叶树种中分离的组织，特别是如火炬松（Pinus taeda L.）含有高水平的……

以下内容由佐治亚大学及沃内尔森林与自然资源学院的研究人员制作。本演示视频介绍了从火炬松（Pinus Teta，俗称lob lolly pine）中采集木质部和韧皮部组织并随后进行RNA提取的方法。火炬松是美国森林产品生产中最重要的针叶树种。树木伐倒后（本例为一棵40年生的树木），主干被截成若干段长约50厘米的原木。然后用链锯在原木上纵向切割几处刻痕，以便去除树皮。使用锤子和木工凿将树皮撬起，直至可以分段剥离。接着，手工去除韧皮组织，并从树皮内侧剥离下来，立即浸入液氮中。去除树皮后，可用单面剃须刀片刮取原木表面的次生木质部薄层。将湿润的木质部组织立即放入液氮中。在此次采集中，我们在从主茎上切割枝条之前，还采集了反应木样品，通常称为压应力木和对侧木。首先用喷漆标记枝条的方位，以确定枝条上部含对立材、下部含压缩材的区域。去皮过程中，先用链锯沿压缩材与对立材的分界线划痕，然后进行去皮操作，方法与主干原木相同，但仅去除与相应反应材类型相对应区域的树皮。采伐木材时，可在任意时间将其移除。通常从这些较细的枝条上剥离大块树皮更为困难。次生木质部的应变木材样品与普通次生木质部一样，用剃刀刮取后立即浸入液氮中收集。注意压应力木特有的红褐色。值得注意的是，从一棵大树采集和处理多个样品需要多人协作，每位参与者执行指定任务，以便同时采集所有类型的组织，从而帮助减少RNA降解。将冷冻的样品和液氮随后转移至已标记的储存袋中，并置于干冰上，运回实验室。我们的第一步是使用SPECS Model 6850冷冻研磨机对组织进行粉碎。与使用研钵和研杵研磨相比，该步骤显著提高了木质组织样品的RNA提取产量，同时利用液氮保持样品低温。首先将组织手工剪碎，并放入样品室中。将样品室插入载体并固定到位，然后对样品研磨两分钟。最终产物呈粗粉状。RNA 提取方案需耗时两天。第一天，将 2.5 克冷冻组织加入已加热至 65 摄氏度的 RNA 提取缓冲液中。样品需剧烈振荡混匀，然后加入等体积的氯仿，再通过轻柔颠倒混合样品。将样品置于旋转轮上旋转五分钟。随后将样品转移至高速特氟龙Oakridge管中，使用SS 34转子在12,000 RPM条件下离心五分钟。将上层水相转移至新离心管中，并加入等体积一半的氯仿。将样品涡旋振荡1分钟，然后再次置于旋转轮上旋转5分钟。第二次离心后，将水相再次转移至一个50 mL高速聚丙烯管中，在10,000 RPM条件下离心20分钟。为去除任何残留的颗粒物，将样品倾入一个50 mL Falcon管中，并向样品中加入四分之一体积的10摩尔氯化锂溶液。样品经振荡混匀后，于4 °C下静置过夜。第二天，将氯化锂沉淀的样品在4 °C条件下以11,000 RPM离心30分钟。倒出并弃去上清液，将离心管倒置在化学清洁纸上静置一分钟。为去除多余的液体，将可见的RNA沉淀重悬于800 µL已预热至65 °C的热SSTE缓冲液中。务必用移液器反复吹打数次，并在沉淀边缘周围充分吹打，以确保其完全溶解。接下来，将重悬的RNA转移至一个2毫升及以上且无RNA酶的微量离心管中。将样品在65摄氏度水浴中加热1至2分钟，随后涡旋振荡，以确保样品完全重悬。如有必要，可重复此步骤。现在，加入等体积的缓冲酚-氯仿。将样品涡旋振荡15至20秒，然后在14,000 RPM下离心3分钟。将水相转移至新的微量离心管中，并加入等体积的异丙醇。样品的涡旋和微量离心操作与前次提取相同。在最后的有机提取阶段，先将锁紧胶管在11,000 RPM下微量离心两分钟。接下来，将上一步提取的RNA样品加入相位锁定凝胶中，随后加入等体积一半的氯仿，通过轻轻吹打混匀。样品在11,000 RPM条件下离心5分钟，然后将水相RNA样品转移至新的Ambion RNA-free离心管中。下一步为简单的RNA沉淀步骤，向样品中加入十分之一体积的3摩尔乙酸钠（pH 4.8）和两倍体积的100%乙醇。将样品涡旋混匀，短暂置于-80 °C冰箱中冷冻30分钟，然后在4 °C条件下以微量离心机离心30分钟。小心吸除上清液，用1 mL冰预冷的70%乙醇洗涤白色沉淀物，吸除乙醇后重复洗涤一次。将离心管敞口置于实验台上5分钟，使残留乙醇自然挥发。将RNA沉淀物重悬于100 µL的DEPC水中，通过涡旋振荡并在65°C加热使其溶解。如有必要，可重复此步骤。测定样品浓度。通过分光光度法测定并计算260/280和260/30比值，以评估样品中蛋白质和碳水化合物污染的程度。采用1%琼脂糖凝胶电泳对样品质量进行定性评估，包括基因组DNA污染和RNA降解情况。对于关键样品，进一步使用安捷伦2100生物分析仪检测核糖体28S/18S比值及RNA完整性数值（RIN），以评价样品完整性。感谢您观看我们关于LOB杂交松树组织样品采集及总RNA提取的视频。以下人员负责本培训视频的拍摄与制作。

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生物学

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