利用鸡胚神经管破译基因定义的组的神经元轴突途径在OVO电穿孔
May 2nd, 2010
本视频演示了如何进行可视化基因定义组在鸡胚脊髓利用线中的神经元轴突途径在OVO电记者基因特定的增强子元件的控制下。
嗨，我是来自耶路撒冷希伯来大学医学神经生物学系 Dr.Review Klar 实验室的 Ham。大家好，我是 Sophie Esman，我也来自 Lars 实验室。今天，我们将向您展示 Innovo、电穿孔和脊髓开书制备的程序。
我们在实验室中使用该程序来研究胚胎脊髓中遗传定义的神经元群的轴突轨迹。那么让我们开始吧。要开始此过程，请将受精的白来角鸡蛋从室温转移到加湿的培养箱中，最好使用 37 至 38 摄氏度的摇摆盘。
监测培养箱的温度和湿度以获得可存活和同步的胚胎非常重要。当雏鸡胚胎达到汉堡和 Hamilton 或 HH 阶段 18 至 20 时，对其进行电穿孔，这是增强子依赖性特异性表达的最佳阶段。在这个阶段，头部与躯干成直角。
同样在 HH 第 18 至 20 期，还应看到大量的胚胎外血管，例如右前、后、左重要线血管。雏鸡胚胎在孵化 19 小时后达到 HH 阶段 20 至 66，此时将鸡蛋从孵化器中取出，取出鸡蛋后，将它们水平放置并等待 5 到 10 分钟。胚胎现在位于鸡蛋的上极。
在电击之前，胚胎用每毫升 100 单位的青霉素和每毫升 0.1 毫克的链霉素制备 Hank 溶液。制备所需的 DNA 混合物，每微升 2 至 5 μg，并添加几粒固绿染料，以便于观察注射的 DNA。准备好一个口腔移液器、一个无菌注射器针头、小剪刀和一条胶带。
用移液器拉拔器拉动直径为 0.5 毫米的玻璃毛细管，制备微毛细管。将钨电极放入微型纵器中，并将电极连接到脉冲发生器。将脉冲发生器上的电压设置为负 30 伏，将每个脉冲的长度设置为 50 毫秒，将脉冲数设置为 3。
在暴露和处理胚胎之前进行电穿孔。将注射器插入鸡蛋的窄杆处，从每个鸡蛋中取出 5 到 6 毫升白蛋白。去除白蛋白以避免其溢出。
下一步剪时，用小剪刀剪。露出雏鸡胚胎后，在鸡蛋上侧打开一个椭圆形窗口，用 0.5 至 1 毫升的绞纱和青霉素链霉素溶液润湿。接下来，使用口孔加载玻璃微毛细管。
使用 DNA 染料混合物时，正确直径的微毛细管应能轻松加载 DNA。在双眼位置下，胚胎用于将 DNA 注射到神经管中。将胚胎的尾巴朝向您放置。
在这个发育阶段，脊髓清晰可见，因此不需要对比技术。脊髓的头部和尾端都被密封。然而，随着微毛细管在神经管上刺穿更多的孔并以较浅的角度穿透它，足够薄且直径正确的微毛细管应该可以穿透管而不会损坏它。
使用口腔注射 DNA。正确直径的微毛细管应通过定期呼气释放 DNA。绿色染料应从尾巴尖端扩散到发育中的大脑的囊泡。
注射直到神经管充满 DNA，首先需要电穿孔才能使注射的 DNA 进入细胞。将电极与神经管平行放置，并尽可能靠近神经管，不要接触神经管本身。确保电极被液体覆盖，以便在脉冲期间导电。
通常，在暴露胚胎后立即添加的 Hank 溶液就足够了。但是，如果在脉冲之前没有滴一滴 Hank 溶液，将电极定位并浸没在液体脉冲中以进行电作，然后小心地取下电极并用胶带密封窗口和鸡蛋。重要的是要完全密封鸡蛋，以防止在接下来的孵化期内胚胎干燥。
将鸡蛋放回培养箱中并孵化，直到雏鸡胚胎达到发育胚胎。第 6 天或 E 第 6 天，当电穿孔胚胎达到发育胚胎时，该进行成像了。电穿孔后第 6 天、第 6 天，将其从鸡蛋中取出，并使用细剪刀将其放入含有 PBS 的硅胶涂层培养皿中。
切掉膜，使用推入硅胶的销钉将其固定到位，将胚胎的腹侧拉伸。使用锋利的钨微毛细管。沿着屋顶板从后脑向下到尾巴做一个纵向切口。
在脊髓两侧再做两个纵向切口，将背根神经节或 DRG 从脊髓上分离。从尾部到后脑，从组织上拆下底板，保持脊髓完好无损。最后，用细剪刀在后脑的横切面上剪断脊髓，将脊髓与身体分开。
现在脊髓已经被分离出来，将其铺展在含有 PBS 的新型硅涂层培养皿中，使用针将其从后脑固定到尾部，从而产生平面安装制剂。在免疫组织化学程序之后，在室温免疫染色中将脊髓固定在 PBS 中的 4% 异构醛中 1 小时免疫染色，详细并随附的书面方案将脊髓打开。影像学检查的书籍准备。
将油脂或硅胶涂在载玻片上，呈矩形，并在矩形内滴入 PBS。用镊子放置脊髓，拉伸矩形的中间并吸出周围的液体。每只宠物吃一个意大利面，在脊髓上滴一到两滴封固剂，然后用盖玻片盖住。
对盖玻片施加压力。避免气泡。将载玻片置于 4 摄氏度的黑暗中。
使用共聚焦显微镜检查脊髓。以下是对照实验中小鸡脊髓间神经元轴突排斥的一些代表性结果，其中 RFP 利用来自 CMV 的普遍增强子元件在所有神经元中表达，大多数神经元及其轴突被标记。无法破译神经元亚群的轴突轨迹。
然而，当应用特定的增强元件时，揭示了本例中特定亚群 DI 两个神经元的定义轴突通路。因此，我们刚刚向您展示了如何在 E 3 处使用特定的神经元增强子对脸颊神经管进行电作，以及如何在 E 6 处准备开卷脊髓。当您进行此程序时，您应该记住要小心和耐心。
所以就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。祝你好运。
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概述
该视频演示了使用卵内电穿孔在胚胎鸡脊髓中可视化遗传定义的神经元轴突通路的程序。该方法允许研究人员有效地研究轴突轨迹。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 电生理学
背景
- 理解轴突通路对于神经科学研究至关重要。
- 卵内电穿孔是一种用于引入报告基因的技术。
- 胚胎鸡脊髓作为研究神经元发育的模型。
- 遗传定义的神经元群体可以提供特定神经回路的洞察。
研究目的
- 在胚胎脊髓中可视化轴突通路。
- 利用卵内电穿孔进行基因表达研究。
- 增强对神经元发育和连接性的理解。
所用方法
- 将受精的鸡蛋转移到加湿孵化器中。
- 保持孵化温度在37至38摄氏度。
- 进行卵内电穿孔以引入报告基因。
- 准备脊髓开放书式制备以进行可视化。
主要结果
- 成功可视化了脊髓中的轴突通路。
- 证明了卵内电穿孔的有效性。
- 对遗传定义的神经元群体轨迹的洞察。
- 建立了一种研究神经元发育的可靠方法。
结论
- 该方法为神经科学研究提供了宝贵的工具。
- 卵内电穿孔在胚胎模型中有效用于基因递送。
- 理解轴突通路可以为神经回路形成的研究提供信息。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables precise visualization of axonal trajectories in genetically defined neuronal populations, addressing a key challenge in target validation where bilateral labeling obscures ipsilateral versus contralateral projections. By restricting reporter expression to one side of the neural tube via unilateral in ovo electroporation, researchers achieve mechanistic de-risking of neuronal circuit hypotheses early in discovery. The approach supports predictive confidence in target selection by clarifying pathway-specific connectivity patterns relevant to neurodevelopmental disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating axonal projections of specific neuronal subpopulations defined by enhancer-driven reporters.
- Operational Value: Provides unilateral labeling to distinguish ipsi- and contra-laterally projecting axons, reducing ambiguity in circuit mapping.
- Predictive Value: Supports biological de-risking of targets by clarifying whether a neuronal population engages excitatory or inhibitory pathways critical for disease mechanism.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable axonal trajectory data as a phenotypic readout for screening genetic or pharmacological modulators of neuronal guidance.
- Operational Value: Produces standardized, reproducible whole-mount preparations compatible with high-resolution confocal imaging and automated analysis pipelines.
- Scalability Value: Utilizes chick embryo model amenable to scale for multi-condition testing of enhancer activity or electroporation efficiency.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maps disease-relevant axonal pathways in vertebrate spinal cord models, enabling alignment with human neurodevelopmental disorder biomarkers.
- Mechanistic Continuity: Bridges discovery-stage target validation with preclinical assessment of circuit-level drug effects on axonal growth or guidance.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing whether a target modulates specific projection patterns linked to functional recovery or pathology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis generation through lead identification, providing mechanistic insights that precede functional assay development and support translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of enhancer-specific gene expression in defining neuronal subpopulations and their axonal trajectories.
- Screening: Enables assay-ready biological systems with standardized, unilateral reporter expression for evaluating compound effects on axon guidance.
- Analytics: Delivers quantitative spatial readouts of axonal projection patterns, facilitating comparison across genetic or treatment conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by establishing disease-relevant axonal pathway models for biomarker correlation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative testing of genetic constructs, enhancer elements, or electroporation parameters across multiple neuronal targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by resolving axonal projection directionality, a critical factor in assessing circuit-specific drug effects.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through defined electroporation parameters (voltage, pulse length, number) and staged embryo handling.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets whose axonal pathways are misaligned with desired therapeutic mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying targets that modulate specific projection patterns relevant to clinical endpoints in neurodevelopmental indications.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryological techniques, including embryo staging, microinjection, and electroporation parameter optimization.
- Depends on instrumentation such as pulse generators, micro manipulators, tungsten electrodes, and confocal microscopy for imaging.
- Necessitates standardization of DNA concentration, enhancer element selection, and electrode placement across users and labs for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when transferring the model to other vertebrate systems or neuronal types beyond spinal interneurons.
- Practical limitations include embryo viability sensitivity to incubation conditions and the technical challenge of achieving uniform unilateral electroporation without tube damage.
