Name: 利用鸡胚神经管破译基因定义的组的神经元轴突途径在OVO电穿孔 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-02T20:17:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 学习利用鸡胚神经管电穿孔技术可视化基因定义神经元的轴突路径。该方法结合开放式脊髓制备，为研究神经发育和神经回路形成提供可靠工具。

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本工作获得了以色列科学基金会、以色列卫生部以及德国研究基金会（DFG）向 AK 提供的资助。

一、电穿孔
卵的处理
<ol>
 <li>将鸡蛋置于设定为37-38°C的加湿培养箱中孵育，最好使用带有摇摆托盘的培养箱。</li>
 <li>孵育约66小时后，当胚胎发育至Hamburger &amp; Hamilton（HH）18-20期时进行电穿孔。在此阶段，头部与躯干呈直角（称为颈弯曲），并可见大量胚外血管结构，如前、后、右侧及左侧卵黄静脉。此时期是依赖增强子实现特异性表达的最佳阶段1,3,4。为获得存活且发育同步的胚胎，必须严格监控培养箱内的温度和湿度。</li>
 <li>孵育66小时后，从培养箱中取出鸡蛋，水平放置，静置5-10分钟，此时胚胎位于蛋的上极。</li>
</ol>
准备工作
<ol>
 <li>制备含青霉素/链霉素（P/S）的 Hank's 溶液（1:100 稀释）。</li>
 <li>将玻璃毛细管（直径 0.5 mm）拉制成微毛细管。</li>
 <li>将电极（钨丝）安装至显微操作器，并将电极连接至脉冲发生器（ECM 830）。</li>
 <li>设置脉冲发生器参数如下：电压 30 V，脉冲次数 3 次，脉冲时长 50 ms。</li>
 <li>准备口吸管、注射器针头和胶带。</li>
 <li>配制所需浓度的 DNA 混合液（2–5 μg/μl），并加入快绿染料。</li>
</ol>
窗化与电穿孔
<ol>
 <li>使用注射器从每个鸡蛋中吸取 5–6 ml 的白蛋白。</li>
 <li>用小剪刀在鸡蛋的上部打开一个椭圆形窗口。</li>
 <li>用 0.5–1 ml 的 Hank's + P/S 溶液润湿胚胎。</li>
 <li>使用口吸移液管将 DNA 混合物吸入玻璃微毛细管中。</li>
 <li>将胚胎尾部朝向操作者放置。在此阶段，胚胎的脊髓清晰可见，因此无需使用任何对比增强技术。脊髓在头端和尾端均封闭，但如果微毛细管足够细，即可以较小角度刺入神经管并穿透其中。合适直径的微毛细管应能轻松吸入 DNA，穿透神经管时不造成损伤，并可通过平稳呼气将 DNA 释放。</li>
 <li>使用口吸移液管注入 DNA。绿色染料应从尾尖扩散至发育中的脑泡区域。</li>
 <li>将电极平行放置于神经管两侧，尽量靠近但不要接触神经管本身，然后施加电脉冲。施加脉冲时，电极必须被液体覆盖以保证电导性。通常，最初加入的 Hank's 溶液量已足够；若不足，可在电脉冲前再添加一滴 Hank's 溶液。</li>
 <li>小心移除电极，并用胶带密封窗口。必须完全密封鸡蛋，以防止在后续孵育过程中胚胎干燥。</li>
 <li>将鸡蛋放回孵育箱中。</li>
</ol>
II. 脊髓开放式制备
将脊髓从胚胎中分离
<ol>
 <li>在E6时期，从鸡蛋中取出电穿孔后的胚胎，并将其放入涂有硅胶并含有PBS的培养皿中。</li>
 <li>切除膜结构，并用大头针将胚胎腹侧展开并固定。</li>
 <li>使用锋利的钨制微毛细管，从后脑至尾部沿顶板做一条纵向切口。</li>
 <li>在脊髓两侧额外各做一条纵向切口，将背根神经节（DRGs）从脊髓上分离。</li>
 <li>从尾部开始向后脑方向将底板从组织上分离，保持脊髓完整。</li>
 <li>使用精细剪刀在后脑处对脊髓进行横切，并将其从身体上分离。</li>
</ol>
固定
<ol>
 <li>将分离的脊髓置于一个新的涂有硅胶并含有 PBS 的培养皿中，用固定针从后脑至尾部将其展开，制成平铺标本。</li>
 <li>倒掉培养皿中的 PBS，加入含 4% 多聚甲醛的磷酸盐缓冲液。</li>
 <li>在室温下孵育 1 小时。</li>
</ol>
免疫组织化学
<ol>
 <li>将固定的脊髓转移至含有PBS中一抗的离心管中。</li>
 <li>在4°C下轻轻振荡孵育过夜。</li>
 <li>用PBS洗涤抗体5次，每次洗涤1小时，期间轻轻振荡。</li>
 <li>加入二抗，在4°C下轻轻振荡孵育过夜。</li>
 <li>用PBS洗涤抗体5次，每次洗涤1小时，期间轻轻振荡。</li>
</ol>
用于成像的开放式样本固定
<ol>
 <li>在载玻片上涂抹呈矩形的润滑脂或硅脂，并在其中滴加 PBS。</li>
 <li>用镊子将脊髓置于矩形中央并拉直，用巴斯德吸管吸除其周围的液体。</li>
 <li>在脊髓上滴加 1–2 滴封片介质，盖上盖玻片，轻轻压平以避免产生气泡。</li>
 <li>将载玻片置于 4°C 避光保存。</li>
 <li>使用共聚焦显微镜观察脊髓组织。</li>
</ol>

<ol><li>Zisman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolysis+and+membrane+capture+of+F-spondin+generates+combinatorial+guidance+cues+from+a+single+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteolysis and membrane capture of F-spondin generates combinatorial guidance cues from a single molecule.</a> J Cell Biol. 178 (7), 1237-1249 (2007).</li>
<li>Arakawa, T., Iwashita, M., Matsuzaki, F., Suzuki, T., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paths%2C+elongation%2C+and+projections+of+ascending+chick+embryonic+spinal+commissural+neurons+after+crossing+the+floor+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Paths, elongation, and projections of ascending chick embryonic spinal commissural neurons after crossing the floor plate.</a> Brain Res. 1223, 25-33 (2008).</li>
<li>Avraham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+axonal+guidance+and+sorting+in+dorsal+interneurons+by+the+Lim-HD+proteins+Lhx9+and+Lhx1%5BTitle%5D)+AND+%22+Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1.</a> Neural Dev. 4 (1), 21(2009).</li>
<li>Timmer, J., Johnson, J., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+in+ovo+electroporation+for+the+rapid+analysis+of+neural-specific+murine+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">The use of in ovo electroporation for the rapid analysis of neural-specific murine enhancers.</a> Genesis. 29 (3), 123-132 (2001).</li>
<li>Reeber, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+Robo+expression+in+vivo+perturbs+commissural+axon+pathfinding+in+the+chick+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Manipulating Robo expression in vivo perturbs commissural axon pathfinding in the chick spinal cord.</a> J Neurosci. 28 (35), 8698-8708 (2008).</li>
</ol>

将质粒DNA电穿孔导入鸡胚已成为一种强大的体内异位表达技术。结合特定增强子与鸡胚电穿孔技术，可快速高效地解析由特定基因定义的神经元群体的轴突投射通路1,3,5。利用Cre/LoxP和Gal4/UAS扩增系统，可增强基因表达水平并延长表达时间。目前的研究表明，不同中间神经元亚群因其轴突投射方向不同，可产生复杂的轴突导向信号分化。此外，还可同时实现对两种神经元群体的分子特异性和空间限制性标记，从而提供有关神经环路结构的信息3。

利用 in ovo 电穿孔技术解析鸡胚神经管中遗传定义神经元群体的轴突通路

Deciphering Axonal Pathways of Genetically Defined Groups of Neurons in the Chick Neural Tube Utilizing in ovo Electroporation

利用增强子元件驱动报告基因在神经元中的表达，是追踪轴突投射的常用范式。在脊椎动物中追踪脊髓中间神经元的轴突投射时，通过生殖系靶向的报告基因通常会产生双侧对称的标记，因此难以区分同侧与对侧投射的轴突。对鸡胚神经管进行单侧电穿孔，可有效将报告基因的表达限制在中枢神经系统的一侧，从而实现对两侧轴突投射的追踪。1 ,2-5. 本视频首先演示了注射前如何处理鸡胚卵。在 Hamburger-Hamilton（HH）18-20 期时，将 DNA 注射至神经管的骶段，随后将钨电极平行置于胚胎两侧，通过脉冲发生器施加短暂的电脉冲。注射后的卵用胶带密封，并放回孵育箱中继续发育。三天后（E6），从胚胎中取出脊髓，制备成“开放式书页”结构，固定后进行整体免疫抗体染色。染色后的脊髓组织置于载玻片上，利用共聚焦显微镜观察成像。

本视频演示了如何利用在特定增强子元件调控下通过in ovo电穿孔将报告基因导入鸡胚脊髓中遗传学定义的神经元群体，以可视化其轴突投射通路。

利用增强子元件驱动神经元中报告基因的表达是追踪轴突投射的常用范式。用于追踪……

大家好，我是来自耶路撒冷希伯来大学医学神经生物学系Klar博士实验室的Ham。大家好，我是Sophie Esman，我也来自Lars实验室。今天我们将向您展示一种体内电穿孔及脊髓“开书”制备的操作方法。我们在实验室中采用此方法研究胚胎脊髓中遗传学定义的神经元群体的轴突投射路径。现在开始操作。首先，将受精的白来航鸡鸡蛋从室温转移至加湿的孵育箱中，最好使用带有摇动托盘的孵育箱，温度设置为37至38摄氏度。为了获得具有活力且发育同步的胚胎，必须监测培养箱的温度和湿度。当鸡胚发育至汉堡-汉密尔顿（Hamburger-Hamilton，HH）18至20期时，是进行电穿孔操作的最佳时期，此阶段适合实现增强子依赖性的特异性表达。在此时期，胚胎头部与躯干呈直角。 在HH 18至20期时，还应观察到大量胚外血管，例如前、后、右侧和左侧的卵黄囊动静脉血管。鸡胚在孵化66小时后达到HH 19至20期，此时应将鸡蛋从孵育箱中取出。取出鸡蛋后，将其水平放置，并静置5到10分钟。此时胚胎位于鸡蛋的上极。电穿孔前，将胚胎置于含有每毫升100单位青霉素和每毫升0.1毫克链霉素的Hank's溶液中进行准备。配制浓度为每微升2至5微克的DNA混合液，并加入少量快绿染料以便于观察注射的DNA。同时准备好口吸管、无菌注射器针头、小剪刀和胶带。使用拉针仪将直径为0.5毫米的玻璃毛细管拉制成微毛细管。将钨电极插入显微操作器中，并将电极连接至脉冲发生器。将脉冲发生器的电压设置为-30伏，每个脉冲持续时间为50毫秒，脉冲次数设置为3次。在暴露和操作胚胎之前，先进行电穿孔。将注射器插入卵的窄极，从每个卵中抽出5至6毫升的蛋清。抽出蛋清是为了防止其溢出。在下一步切割时，使用小剪刀进行操作。暴露鸡胚后，在卵的上部开一个椭圆形窗口，并用0.5至1毫升的Hanks青霉素-链霉素溶液润湿。接着，用口吸装置将玻璃微毛细管上样。使用DNA染料混合物时，应选择合适直径的微毛细管，以便于加载DNA。在双目显微镜下定位胚胎，将DNA注射至神经管内。放置胚胎时，使其尾部朝向操作者。在此发育阶段，脊髓清晰可见，因此无需使用对比技术。脊髓在头部和尾部两端均处于封闭状态。然而，通过微毛细管以较小的角度在神经管上穿刺出更多小孔时，只要微毛细管足够细且直径合适，即可穿透神经管而不对其造成损伤。使用口吸管注入DNA。选择合适直径的微量毛细管，通过平稳呼气即可释放DNA。绿色染料应从尾部尖端扩散至正在发育的脑室泡。注射直至神经管充满DNA，这是电穿孔使注入的DNA进入细胞所必需的步骤。首先，将电极平行放置于神经管两侧，并尽可能靠近神经管但不接触管壁本身。确保电极被液体完全覆盖，以保证脉冲期间的电导性。通常在暴露胚胎后立即加入汉克溶液即可。但如果未加，则需在电极定位并浸入液体中进行电脉冲前，滴加一滴汉克溶液，然后进行电转操作。接着小心取出电极，并用胶带将窗口和蛋完全密封。在后续孵育期间，必须将蛋完全密封，以防止胚胎干燥。将鸡蛋放回培养箱中继续孵育，直至鸡胚发育至胚胎发育第6天（E6），此时可进行成像。在转染后第3天，当胚胎达到胚胎发育第6天（E6）时，将其从蛋中取出，并用精细剪刀转移至含有PBS的硅化培养皿中。用大头针将胚胎腹侧展开并固定在硅胶上，去除膜状物。使用锋利的钨制微毛细管，从后脑沿顶板向下至尾部做纵向切口。在脊髓两侧再做两个纵向切口，将背根神经节（DRGs）从脊髓上分离。从尾部开始向后脑方向将底板从组织上剥离，保留脊髓完整。最后，使用精细剪刀在后脑处对脊髓进行横切，将脊髓与身体分离。脊髓分离后，将其置于一个新的含 PBS 的硅胶涂层培养皿中，用固定针从后脑至尾部将其展开，制成平铺标本。在室温下用含 4% 多聚甲醛的 PBS 固定脊髓 1 小时，随后按照免疫组织化学实验步骤及配套书面方案进行免疫染色，并将脊髓展开。制备成书页状以供成像。在载玻片上以矩形方式涂抹润滑脂或硅油，并在矩形区域内滴加 PBS。用镊子将脊髓置于矩形中央并轻轻拉直，吸去周围液体。用移液枪头在脊髓上滴加一至两滴封片介质，然后盖上盖玻片。压紧盖玻片，以避免产生气泡。将载玻片置于黑暗环境中，4 °C 保存。使用共聚焦显微镜观察脊髓。以下是一些对照实验的代表性结果，在这些实验中，利用来自CMV的普遍性增强子元件在所有神经元中表达RFP，大多数神经元及其轴突均被标记，因此无法解析特定神经元亚群的轴突投射路径。然而，在应用特定的增强元件时，此例中特定亚群DI两个神经元的明确轴突通路得以显现。我们刚刚向您展示了如何在E3时期利用特定的神经元增强子对胚胎颊部神经管进行电转染，以及如何在E6时期制备展开书状的脊髓。在进行该操作时，您应当牢记要细心且耐心。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验顺利。祝您好运。

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