Name: 分离人脐静脉内皮细胞（HUVEC） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: 学习从人脐带中分离人脐静脉内皮细胞（HUVEC）并进行体外培养的标准化实验方案。该方法使用胶原酶消化技术，为血管生物学和血管生成研究提供可靠的细胞来源。

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实验步骤
<ol>
<li>将脐带置于洁净垫上，轻拍去除多余血液。在脐带两端做新鲜切口。</li>
<li>插入21½ G针头 保留塑料针套，将针插入静脉。（静脉是最大的开口；另外两个较小的为动脉）</li>
<li>夹紧针头 用止血钳固定，并将装有Hanks液的20 cc注射器连接到针头上。</li>
<li>将Hanks缓冲液推过 用中等压力冲洗血管。将废液收集到含漂白剂的烧杯中。（一只手握住针头和导管，另一只手推进，可防止针头脱出血管。）如果血管内血液较多，需再次冲洗。</li>
<li>将导管置于垫上，夹住静脉的另一端。用几毫升 Hanks 液灌注 检查泄漏 沿导管回抽5 mL血液，然后松开底部夹子。</li>
<li>断开20 cc注射器，从10 cc注射器中取出活塞，将10 cc注射器连接到针头。 加入10 ml胶原酶 并替换推杆。将胶原酶推入静脉，直至看到少量液体从开口端流出。重新夹闭开口端，并继续注入胶原酶，直至充满 静脉中度扩张过度扩张会导致平滑肌污染。</li>
<li>轻轻按摩脐带.</li>
<li>将脐带（附有止血钳、针头和注射器）在37°C的DPBS中孵育15分钟。 </li>
<li>孵育期间，继续对2进行步骤1-8nd 脊索</li>
<li>孵育结束后，将脐带从烧杯中取出，同时将脐带悬于50 mL离心管上方，剪去末端 上方 底部夹具 务必确保将所有物质收集到离心管中将剩余的胶原酶推过脐带，然后连接20 mL注射器，以适中压力推入Hanks液。</li>
<li>若不需要平滑肌细胞，此时可弃去组织块；否则，将同一组织块放入含约5 ml胶原酶的第二个50 ml离心管中，于37°C孵育30–60分钟。 </li>
<li>将试管保留，直至所有脐带处理完毕。</li>
<li>离心管 在约1200 rpm下离心5分钟。</li>
<li>吸弃上清液（保留约1-2 mL）。 重悬 将沉淀重悬于5 ml PHEC+中，并接种至T25培养瓶中。</li>
<li>37°C孵育 含5% CO2 过夜。</li>
<li>次日去除上清液，更换新鲜培养基。若红细胞较多，用M199洗涤一次，然后加入PHEC+。继续常规培养，直至培养板细胞融合（1–4天）。将细胞传代至经明胶包被的T75培养瓶中。 </li>
<li>T75 培养瓶长满后，按 1:3 传代。每瓶冻存两管。</li>
</ol>
注意：内皮细胞（未活化状态）呈鹅卵石样形态。内皮细胞在分离后有时会立即进入活化状态（细长且尖端突出），经过几次传代后通常会恢复为未活化状态。
清理
<ol>
<li>非常小心地将针头丢弃至锐器容器中。</li>
<li>将注射器丢弃至大型生物危害容器中。</li>
<li>将所有组织放入小型生物危害袋中。封好袋子&nbsp;，并在 -20°C 冷冻，直至焚烧处理。</li>
<li>将所有器械浸泡于杀病毒剂中至少 10 分钟。</li>
<li>将培养基加入废液/漂白剂烧杯中，静置至少 10 分钟。</li>
<li>将实验台垫板丢弃至生物危害废物容器中。</li>
<li>用杀病毒剂喷洒烧杯内外表面、实验台面以及水浴锅盖，静置 10 分钟后擦拭干净。</li>
<li>用温水冲洗烧杯和器械，并悬挂在架子上晾干（用纸巾擦干器械，防止生锈）。</li>
<li>将已去污染的废弃物倒入水槽中处理。</li>
<li>将未使用的培养基放回冰箱。</li>
<li>将手套丢弃至生物危害废物容器中。</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.1% 胶原酶 </td><td></td><td></td><td>每根脐带使用 10 mL，预热至 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>组织培养瓶</td><td></td><td></td><td>T75，每根脐带使用一个。</td></tr><tr><td>汉克氏培养基</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td></td><td></td><td>无菌</td></tr><tr><td>烧杯</td><td></td><td></td><td>无菌</td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

人脐静脉内皮细胞（huvec）的分离

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

血管生成是一个复杂的多步骤过程，在血管生成刺激因子的作用下，由现有脉管系统形成新的血管。这些步骤包括：基底膜降解、内皮细胞（EC）增殖和迁移（出芽）进入细胞外基质、内皮细胞排列成索状结构、管腔形成、血管吻合以及新基底膜的形成。目前已开发出多种体外检测方法用于研究这一过程，但大多数方法仅能模拟血管生成的某些阶段，且在形态学上形成的血管往往与体内血管存在差异。本文展示了一种优化的体外血管生成检测方法，该方法利用人脐静脉内皮细胞（EC）和成纤维细胞。该模型可重现血管生成的所有关键早期阶段，尤为重要的是，所形成的血管具有由极化内皮细胞包绕的通畅细胞间管腔。这些血管可通过相差显微镜和延时显微镜轻松观察，并可被纯化回收用于后续应用。

本视频方案演示了从人脐带中分离和培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的方法。分离后的细胞可用于体外血管生成实验，例如 Hughes 实验室所展示的优化纤维蛋白凝胶微珠实验。

人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的分离

血管生成是一个复杂的多步骤过程，在血管生成刺激因子的作用下，新的血管从已有的脉管系统中形成。这些步骤……

您好，我叫Jager Davis，今天我将向您展示如何分离人脐静脉内皮细胞，也称为HUVCE。我们将使用多种培养基，首先使用Hank's平衡盐溶液，用于清除血管中的红细胞或其他可能存在的污染物。其次，我们将使用在DPBS中重悬的胶原酶，该溶液用于从脐静脉中解离HUVCE，然后我们将细胞接种于20%效应培养基中，该培养基为含有热灭活FBS和青霉素-链霉素溶液的M199培养基。我们还将使用 BD Biosciences 的内皮细胞生长补充剂来补充 Resus 悬浮液。好的，我有一把解剖剪刀。我将像这样在脐带上方直接剪开一个切口。接下来，我将清理脐带。我需要辨认出动脉和静脉，其中有两条动脉和一条静脉。我通常成对地辨认动脉。它们朝向你的一侧延伸出来。因此，我们在这里有一条动脉，另一条动脉就在这附近。如您所见，静脉实际上正进入脐带，这正是我们要放置蝶形针的位置。我们使用的是21号、3/4英寸的Accutane蝶形针。现在打开它。就这样直接进入。再次确认，我将辨认出动脉。我们有一条动脉和第二条动脉，然后是我们的静脉。现在我将使用蝴蝶针非常轻柔地插入静脉，但你可能会遇到一些阻力。我喜欢稍微旋转一下导管，同时推进针头，采用这种动作，持续推进，直到蝴蝶针的两翼与导管齐平，就像这样。我们已经准备就绪，接下来可以进行夹闭。现在我要做的是，用20 mL的墨水填充两支20 mL的注射器。接下来，我将用5 mL的20% effect填充一个50 mL的锥形管。然后，我将用移液器从DPBS中吸取10 mL加入其中一个15 mL的锥形管中。因此，这15毫升DPBS中，我将加入10毫克胶原酶粉末，粉末用量将在天平上称量。我将通过反复倒置试管数次，使胶原酶充分重悬，直至管壁上的粉末完全脱落，大约5到6次即可。随后，我将使用10毫升注射器连接滤器，对胶原酶溶液进行无菌过滤。现在我们准备将这些培养基通过导管。我已将剩余的DPPS倒入这个一升的烧杯中，然后将其放入37°C水浴中加热，使其升温。该培养基将用于孵育我们的导管约15分钟。这是我们的过滤胶原酶溶液。我将把此锥形小瓶放入37摄氏度水浴中，使其升温，稍后在实验步骤中用于从静脉内壁上解离脉络膜。接下来，我将在蝴蝶针的位置夹闭脐带，并向脐带中灌注20毫升的Hanks液，以冲洗掉其中的任何血细胞。固定好蝶形针后，我将缓慢推注20毫升的汉克氏液。操作需非常缓慢，以防止静脉破裂。液体流出的速度应大致如此，但切勿让汉克氏液呈流状持续流出。这意味着你操作过于用力了。所以我通常会一点一点地、逐滴进行。同时再次将纱线束推过，以彻底清理血管。然后暴露我们的末端细胞。在此之后，我们将所有悬垂部分推过。接下来，我将把导管平放，随后夹闭导管的下端，取下注射器，并将其放入生物危害袋中固定。接下来，我将连接一个新的10毫升注射器。好的，下一步我将把胶原酶溶液推过脐带，目的是

isolation-of-human-umbilical-vein-endothelial-cells-huvec

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

分离人脐静脉内皮细胞（HUVEC）

脐带可通过不同方法用于分离平滑肌细胞。在本研究中，我们采用酶消化法来分离平滑肌细胞。...

人脐动脉平滑肌细胞（HUASMC）的分离

我们提供一种分离和培养纯化心脏瓣膜内皮细胞（VEC）群体的方法。VEC...

瓣膜内皮细胞的分离

本文首先描述了一种从人脐静脉中分离内皮细胞的实验步骤，然后展示了如何利用这些细胞在流动条件下研究中性粒细胞的跨内皮迁移。通过使用由具有玻璃光学特性的聚合物制成的低体积流动腔室，还可实现对稀有细胞群体的活细胞荧光成像。...

人脐静脉内皮细胞的分离及其在流动条件下中性粒细胞跨内皮迁移研究中的应用

一种中性粒细胞黏附定量方法的报道。该方法可构建类似于血管内环境的动态流动条件，能够在类似生理流动的环境中研究中性粒细胞与纯化的黏附分子（配体）或内皮细胞基质（HUVEC）之间的黏附。 体内...

人中性粒细胞流室黏附实验

本方案旨在分享我们分离小鼠冠状动脉内皮细胞的方法，以便进行成像或分子生物学实验。...

小鼠冠状动脉内皮细胞的分离

详细介绍了人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养、微管生长荧光标记物的瞬时转染、活细胞成像以及间期微管生长动态的自动化分析方案。...

活体人脐静脉内皮细胞中微管动态的高分辨率延时成像与自动分析

本实验方案的目的是从脐带血中分离内皮祖细胞。这些细胞的一些应用包括将其作为生物标志物用于识别心血管疾病风险患者、治疗缺血性疾病，以及构建组织工程化的血管和心脏瓣膜结构。...

从人脐带血中分离内皮祖细胞

本文介绍了一种整合性实验方案，通过特异性表面标志物和共聚焦荧光显微镜，在体外流动条件下检测单核细胞亚群的迁移行为。该方案可用于研究单核细胞募集的连续步骤，也可通过其他特异性表面标志物对其他白细胞亚型进行分析。...

在体外流动条件下同时研究单核细胞亚群的募集

尽管具有挑战性，肺内皮细胞的分离对于肺部炎症研究至关重要。本方案描述了一种高得率、高纯度分离大血管和微血管内皮细胞的操作步骤。...

肺源性样本中微血管和大血管内皮细胞的分离与纯化

本研究描述了一种利用实时细胞分析（RTCA）系统监测人脐静脉内皮细胞（HUVECs）在病毒感染过程中变化的实验方案。...

利用基于阻抗的实时细胞分析技术监测病毒感染下人脐静脉内皮细胞的变化

我们描述了一种分离和培养人隐静脉内皮细胞（hSVECs）的方案。同时提供了详细的方法，用于施加剪切应力和拉伸力，以研究hSVECs中的机械应力。...

人隐静脉内皮细胞的分离及其在可控剪切应力与拉伸条件下的暴露

学习从人脐带中分离人脐静脉内皮细胞（HUVEC）并进行体外培养的标准化实验方案。该方法使用胶原酶消化技术，为血管生物学和血管生成研究提供可靠的细胞来源。

人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的分离

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