由不稳定的多蛋白质复合物的分离在体内控制细胞的交联和免疫磁性亲和层析
2010年3月9日
细胞透水交联剂DSP [dithiobis（琥珀酰亚胺丙酸）]稳定短暂和不稳定的相互作用在体内，这使得他们的隔离，使用严格的蛋白质复合体的净化技术。在这里，我们目前培养的交联，由免疫蛋白复合物的分离细胞的技术。
对于交联，然后进行免疫沉淀。将 80% 至 90% 密度的程序细胞与 1 毫摩尔冰冷一起孵育。仅 PBS、钙、镁或 DMSO 中的 DSP。
车辆控制。DSP 是一种同型双功能膜可渗透和可还原的交联剂，可自由交联，意味着彼此相距 12 埃以内。随后裂解交联细胞并使用标准对照进行免疫沉淀。
然后通过减少 SDS 页面、减少试剂裂解的 DSP 来分离蛋白质复合物，从而允许通过免疫印迹鉴定单个蛋白质。大家好，我是来自埃默里大学细胞生物学系 Victor Fonde 博士实验室的 Stephanie Ick。我是 Pearl Ryder，也来自 Fonde 实验室。
今天，我们将向您展示一种使用受控交联分离 myprotein 复合物的程序，然后进行免疫磁性亲和层析。我们在实验室中使用该程序来研究瞬时不稳定的蛋白质相互作用。那么让我们开始吧。
首先标记细胞板的底部以指示细胞类型和特定的实验条件。此处的正号表示 DSP 处理包括仅负 DMSO 的载体对照。将培养基添加到板中，以准备用于细胞接种板。
以 1 至 5 稀释度接种 HEK 细胞，以便每个标准管反应可分离 500 μg 蛋白质。单管就足以通过质谱分析的免疫印迹鉴定目标蛋白质的推定结合伴侣。将标准反应的数量增加至少 10 次。
还要准备交联实验中使用的大多数溶液的茎。这些包括补充有 0.1 毫摩尔氯化钙的 PBS 和一种称为 PBS 钙镁的氯化镁。钙离子和镁离子的添加对于细胞粘附到培养板上至关重要。
在实验过程中，将溶液储存在 4 摄氏度。其他储备液包括 50 X 完全蛋白酶抑制剂混合物交联剂淬灭液，每 20 分钟涡旋一次，直到沉淀溶解。20%Tritan X 100，储存在 4 摄氏度，应在一个月内使用 10 x 和 1 x 缓冲液 a 溶液。
按照随附的书面方案中详细说明准备并储存所有溶液。最后，准备由一种 X 缓冲液组成的裂解缓冲液。A 加 0.5%TRITTON X 100 和免疫磁沉淀缓冲液或由一个 X 缓冲液组成的 IP 缓冲液。
A 加 0.1%TRITTON X 101 至铺板后两天，细胞的共流畅度为 80% 至 90%，最适合交联。在高共流畅度条件下，细胞往往会相互堆积，导致细胞渗透联剂对所有细胞的可及性降低。将板放回培养箱中，直到准备好交联。
在应用于细胞之前立即准备 DSP 交联剂溶液。DSP 具有高度疏水性，因此在 DMSO 中溶解至 100 毫摩尔的浓度，然后稀释到 PBS 钙镁缓冲液中。为了进一步增强 DSP 在 PBS 钙镁缓冲液中的稀释度，加热和适当的体积，加入 10 微升 DSP 和 DMSO 储备液。
对于每 1 毫升温热的 PBS 钙镁，逐滴加入 D-S-P-D-M-S-O 储备液，重复混合，直到所有 DSP 溶解。此外，为每毫升 PBS 钙镁制备 10 微升 DMSO 的载体对照溶液。稀释 DSP 后，将所有 PBS 钙镁溶液在冰水浴中放置不超过 10 分钟。
接下来，准备一个冰水浴，用于容纳实验中使用的所有板。继续从 37 摄氏度培养箱中取出含有细胞的培养板，并立即将它们放入冰水浴中。用冰冷的 PBS 钙镁洗涤细胞两次，使用先前为与交联剂孵育 6 次准备的相同体积，孔板计算每孔 2 毫升，依此类推。
第二次洗涤后。将载体对照（即溶解在缓冲液中的 DMSO）或 DSP 交联缓冲液添加到在冰上孵育 2 小时的细胞中，并大约每 20 分钟检查一次，以确保所有细胞都被溶液覆盖。如果一些细胞暴露出来，倾斜并旋转培养皿以再次均匀覆盖它们，少量 DSP 沉淀是正常的。
在两小时孵育结束前与细胞孵育 2 小时期间，通过将茎稀释到 PBS 钙镁中来制备一 XDSP 淬灭溶液。将溶液保存在冰上，直到使用它通过灭活尚未反应的 DSP 来停止交联反应。两个小时结束后，从细胞中取出载体对照和交联溶液。
加入冰冷的 DSP 淬灭溶液，在冰上孵育 15 分钟。同时，将完全蛋白酶抑制剂混合物原液 1 至 50 稀释到细胞裂解缓冲液中。15 分钟结束后，用 PBS 钙镁洗涤细胞两次。
然后将含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液添加到细胞中，并在 4 摄氏度下振动 30 分钟。细胞裂解 30 分钟后，使用细胞刮刀从板中收集细胞。确保将裂解物保存在冰上，以尽量减少蛋白酶活性。
将细胞裂解物在 4 摄氏度下在台式微型离心机中以最高 15， 000 Gs 的速度旋转 15 分钟，将上清液移液到新试管中，弃去沉淀。使用 Bradford 测定法分析蛋白质水平并继续进行免疫沉淀。在螺口微量离心管中开始 2 小时的交联反应后，立即开始准备免疫沉淀。
将 30 μL 抗 IgG 免疫磁珠与 500 μL IP 缓冲液混合。添加针对目标靶标的抗体。应为每种抗原确定适当的抗体量。
在初步实验中，磁珠的可能阴性对照包括无抗体、磁珠和同型对照抗体珠，以将 IP 抗体与磁珠结合。在室温下在翻转末端摇床中孵育 2 小时孵育孵育结束时，快速旋转试管并将其滑入磁性支架中。磁珠将集中在磁体的一侧。
去除含有未结合抗体的溶液，并立即清洗微珠以防止其变干。洗涤两次后，向适当的试管中加入 500 微升每毫升 1 微克的 DSP 阴性或 DSP 阳性细胞裂解物。在此阶段，可以通过将免疫原性肽（在初步实验中确定的浓度）添加到裂解物珠混合物中来制备肽竞争阴性对照。
在此阶段制备的另一种可能的阴性对照是仅缓冲液或无裂解物的反应，方法是仅向磁珠中加入 500 μL 裂解缓冲液来制备。轻轻重悬用于实验和对照反应的微珠。不要涡旋，因为这会导致微珠破裂，以 4 度孵育，并端到端旋转 2 小时。
2 小时后，使用磁性支架取出裂解液。用 1 mL IP 缓冲液快速离心并洗涤磁珠共 6 次。将每次洗涤液在 4 摄氏度下孵育 5 分钟。
为了逃避结合的复合物，将 1 x 凝胶样品缓冲液添加到 IP 管中，就在磁珠沉淀上方。要汇集试管底部的磁珠，请轻轻敲击试管底部，使所有磁珠重悬于凝胶样品缓冲液中。或者，为了进行免疫亲和分离，在 30 μL 缓冲液 a 中补充有免疫原性肽的微珠。
免疫原性肽的所需浓度是根据经验确定的。测试 10 至 200 微摩尔的范围后，将微珠在 4 度下孵育 2 小时，每 30 分钟敲击一次试管。使用磁性支架去除含有逃脱复合物的 30 微升，并保存在带有 IP 缓冲液的干净试管中洗涤并保存珠子。
对于两种洗脱方法，向磁珠中加入 1 x 凝胶样品缓冲液。除了使蛋白质变性外，还将 immuno 磁珠重新悬浮在 75 摄氏度的凝胶样品缓冲液中加热 5 分钟。此步骤还将保留 DSP 分子，从而允许解析复合物运行中的单个蛋白质。
用于蛋白质印迹的 SDS 页面凝胶上的样品。空的 Immuno 磁珠可通过离心排斥，并在上样前使用磁性支架从样品中取出。如果免疫亲和性 EUA 通过 SDS 页面的蛋白质染色或免疫印迹均不含 IgG，则适用于质谱分析。
以下是来自交联和非交联细胞裂解物的蛋白质印迹材料示例，然后使用针对 AP 三个亚基的单克隆抗体进行免疫磁性沉淀。Delta 交联允许检测在免疫磁性分离过程中非交联样品中未见的相互作用蛋白质。阴性对照显示，对于非交联和交联样品，使用无抗体和抗体同种型匹配对照使用针对转铁蛋白受体的 IgG 时，没有特异性蛋白下拉。
在本例中，使用亲和肽洗脱来回收与 IP 抗体结合的蛋白质。请注意，在肽洗脱过程中，Supernat 组分中不存在免疫抗体，而保留在搏动组分中。我们刚刚向您展示了如何使用化学交联剂 DSP 分离不稳定的 MultiPro 复合物，然后进行免疫磁性亲和纯化。
执行此程序时，请务必将细胞溶液和裂解物保持冷却，以保持交联过程中不稳定的相互作用，并最大限度地减少蛋白酶活性。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。
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概览
本文介绍了一种使用DSP（一种细胞可穿透的交联剂）交联细胞的方法，以稳定体内瞬时蛋白质相互作用。该技术允许通过免疫沉淀分离蛋白质复合物。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 蛋白质相互作用
背景
- DSP是一种同源双官能的可穿透膜的交联剂。
- 它交联相互之间距离在12埃内的蛋白质。
- 该技术增强了瞬时蛋白质相互作用的研究。
- 免疫沉淀是分离蛋白质复合物的标准方法。
研究目的
- 开发一种可靠的方法来交联培养细胞中的蛋白质。
- 促进蛋白质复合物的分离以进行进一步分析。
- 提高对体内蛋白质相互作用的理解。
使用的方法
- 细胞在PBS或DMSO中与1 mM DSP孵育。
- 交联后细胞被裂解。
- 使用标准控制进行免疫沉淀。
- 分离蛋白质复合物用于分析。
主要结果
- 交联方法有效地稳定了蛋白质相互作用。
- 分离的蛋白质复合物可以使用严格的纯化技术进行分析。
- 这种方法允许在受控环境中研究瞬时相互作用。
- 结果证明了DSP在蛋白质复合物研究中的实用性。
结论
- DSP交联技术是研究人员的一个有价值的工具。
- 它增强了研究体内蛋白质相互作用的能力。
- 该方法可以带来细胞生物学和神经科学方面的新见解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Isolation of labile multi-protein complexes using in vivo cross-linking and immuno-magnetic affinity chromatography addresses a critical gap in capturing transient or weak protein interactions that underpin cellular machinery. This capability enhances predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking at early discovery and preclinical inflection points. The method supports robust portfolio decisions by enabling the identification of protein networks that are otherwise inaccessible to standard purification workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Stabilizes transient protein interactions to clarify functional protein networks around targets of interest.
- Enables mechanistic de-risking by capturing weak or dynamic associations critical for pathway interrogation.
- Supports predictive confidence in target validation by providing access to otherwise labile complexes.
Screening & Assay Development
- Prepares validated protein complexes for downstream immunoblot or mass spectrometry analysis.
- Facilitates assay standardization by enabling reproducible isolation of protein assemblies.
- Enables quantitative assessment of protein-protein interactions for reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker discovery by preserving native protein complexes for identification.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by supporting the study of disease-relevant protein networks.
- Reduces biological risk in preclinical models by ensuring detection of physiologically relevant interactions.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical research, enabling robust characterization of protein complexes at each stage.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by stabilizing and isolating labile protein assemblies.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for downstream immunoblot and mass spectrometry workflows.
- Analytics: Provides measurable readouts of protein complex composition, enabling comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Preserves disease-relevant complexes for biomarker alignment and preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for repeated use across diverse targets and cell systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes isolation of protein complexes, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein chemistry, immunoprecipitation, and analytical techniques such as western blot and mass spectrometry.
- Needs access to cross-linking reagents, magnetic bead platforms, and cold-chain infrastructure for sample preservation.
- Demands rigorous cross-team standardization of controls and analytical protocols.
- Adaptable to various cultured cell systems but may require empirical optimization for each target or model.
- Limited to interactions within the cross-linker’s spacer arm and may not capture all relevant associations.
