Name: 嗨 - C：一个方法研究基因组的三维架构。 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 27 s
Description: 学习Hi-C方法用于研究基因组三维架构，通过甲醛交联、限制性内切酶消化、生物素标记及高通量测序技术，揭示染色体区域和染色质区室化特征。该方法为理解基因调控机制提供重要依据。

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感谢 A. Kosmrlj 提供的讨论和代码；感谢 A. P. Aiden、X. R. Bao、M. Brenner、D. Galas、W. Gosper、A. Jaffer、A. Melnikov、A. Miele、G. Giannoukos、C. Nusbaum、A. J. M. Walhout、L. Wood 和 K. Zeldovich 提供的讨论；感谢 L. Gaffney 和 B. Wong 在可视化方面提供的帮助。
本研究得到了Fannie和John Hertz基金会研究生奖学金、国家国防科学与工程研究生奖学金、美国国家科学基金会（NSF）研究生奖学金、国家太空生物医学研究所、美国国家人类基因组研究所（NHGRI）资助项目编号T32 HG002295（E.L.）；i2b2（生物与临床信息整合信息学）项目及美国国立卫生研究院（NIH）资助的布莱根妇女医院生物医学计算中心（L.A.M.）；NHGRI资助项目编号HG003143以及Keck基金会杰出青年学者奖（J.D.）的支持。原始及比对后的Hi-C测序数据已存入GEO数据库（<a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/">www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/</a>），登录号GSE18199。更多可视化数据可访问<a href="http://hic.umassmed.edu">http://hic.umassmed.edu</a>。

<ol><li>Lieberman-Aiden, E., Van Berkum, N. L., Williams, L., Imakaev, M., Ragoczy, T., Telling, A., Amit, I., Lajoie, B. R., Sabo, P. J., Dorschner, M. O., Sandstrom, R., Bernstein, B., Bender, M. A., Groudine, M., Gnirke, A., Stamatoyannopoulos, J., Mirny, L. A., Lander, E. S., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326, 289-293 (2009).</li>
<li>Kosak, S. T., Groudine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Form+follows+function%3A+the+genomic+organization+of+cellular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Dev%22%5BJournal%5D)">Form follows function: the genomic organization of cellular differentiation.</a> Genes and Dev. 18, 1371-1384 (2004).</li>
<li>Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+sequence%3A+cellular+organization+of+genome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Beyond the sequence: cellular organization of genome function.</a> Cell. 128, 787-800 (2007).</li>
<li>Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Regulation+in+the+Third+Dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene Regulation in the Third Dimension.</a> Science. 319, 1793-1794 (2008).</li>
<li>Cremer, T., Cremer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+territories%2C+nuclear+architecture+and+gene+regulation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells.</a> Nat Rev Genet. 2, 292-301 (2001).</li>
<li>Sexton, T., Schober, H., Fraser, P., Gasser, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulation+through+nuclear+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+and+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene regulation through nuclear organization.</a> Nat Struct and Mol Biol. 14, 1049-1055 (2007).</li>
<li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+Chromosome+Conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Capturing Chromosome Conformation.</a> Science. 295, 1306-1311 (2002).</li>
<li>Zhao, Z., Tavoosidana, G., Sjölinder, M., Göndör, A., Mariano, P., Wang, S., Kanduri, C., Lezcano, M., Sandhu, K. S., Singh, U., Pant, V., Tiwari, V., Kurukuti, S., Ohlsson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+chromosome+conformation+capture+%284C%29+uncovers+extensive+networks+of+epigenetically+regulated+intra-+and+interchromosomal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions.</a> Nat Genet. 38, 1341-1347 (2006).</li>
<li>Simonis, M., Klous, P., Splinter, E., Moshkin, Y., Willemsen, R., de Wit, E., van Steensel, B., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+organization+of+active+and+inactive+chromatin+domains+uncovered+by+chromosome+conformation+capture-on-chip+%284C%29+uncovers+extensive+networks+of+epigenetically+regulated+intra-+and+interchromosomal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions.</a> Nat Genet. 38, 1348-1354 (2006).</li>
<li>Dostie, J., Richmond, T. A., Arnaout, R. A., Selzer, R. R., Lee, W. L., Honan, T. A., Rubio, E. D., Krumm, A., Lamb, J., Nusbaum, C., Green, R. D., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+Conformation+Capture+Carbon+Copy+%285C%29%3A+A+massively+parallel+solution+for+mapping+interactions+between+genomic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Chromosome Conformation Capture Carbon Copy (5C): A massively parallel solution for mapping interactions between genomic elements.</a> Genome Res. 16, 1299-1309 (2006).</li>
<li>Miele, A., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+Cis-+and+Trans+Chromatin+Interaction+Networks+Using+Chromosome+Conformation+Capture+%283C%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mapping Cis- and Trans Chromatin Interaction Networks Using Chromosome Conformation Capture (3C).</a> Methods Mol Biol. 464, 105-121 (2009).</li>
<li>Maccallum, I., Przybylski, D., Gnerre, S., Burton, J., Shlyakhter, I., Gnirke, A., Malek, J., McKernan, K., Ranade, S., Shea, T. P., Williams, L., Young, S., Nusbaum, C., Jaffe, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALLPATHS+2%3A+small+genomes+assembled+accurately+and+with+high+continuity+from+short+paired+reads%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol+%22%5BJournal%5D)">ALLPATHS 2: small genomes assembled accurately and with high continuity from short paired reads.</a> Genome Biol . 10, R103-R103 (2009).</li>
</ol>

一种关于Hi-C方法的临时专利（编号61/100,151）正在审查中。

我们介绍一种通过无偏倚、全基因组范围的染色质相互作用作图来研究基因组三维结构的方法。最关键的实验步骤——也是使该技术区别于以往工作的核心环节——是在交联片段的限制性酶切末端连接之前，引入生物素标记的核苷酸。成功完成这一步骤可实现对所有连接位点的深度测序，从而赋予Hi-C技术广泛的覆盖范围和强大的分析能力。 测序读段的数量最终将决定相互作用图谱的分辨率。此处展示的是利用约3000万条可比对读段绘制的人类基因组1 Mb分辨率的相互作用图谱。为了将“通用”分辨率提高一个数量级 n，测序读段数量必须增加一个倍数 n2. Hi-C 技术可轻松与其他技术结合使用，例如在文库构建后进行杂交捕获（以靶向基因组的特定区域），或在连接反应后进行染色质免疫沉淀（以研究与特定蛋白质相关的区域的染色质环境）。

<table><tbody><tr><td>蛋白酶抑制剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340-5ml</td><td>步骤 1.2</td></tr><tr><td>生物素-14-dCTP</td><td>Invitrogen</td><td>19518-018</td><td>步骤 1.6</td></tr><tr><td>Klenow</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210</td><td>步骤 1.6 和 2.2</td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>Invitrogen</td><td>15224</td><td>步骤 1.9</td></tr><tr><td>T4 DNA 聚合酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203</td><td>步骤 1.17 和 2.2</td></tr><tr><td>10x 连接缓冲液</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202</td><td>步骤 2.2 和 3.4</td></tr><tr><td>T4 多核苷酸激酶（T4 PNK）</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201</td><td>步骤 2.2</td></tr><tr><td>Klenow (exo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212</td><td>步骤 2.3</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1 磁珠</td><td>Invitrogen</td><td>650.01</td><td>步骤 3.2</td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶 HC</td><td>Enzymatics</td><td>L603-HC-L</td><td>步骤 3.5</td></tr><tr><td>Phusion HF 预混液</td><td>New England Biolabs</td><td>F531</td><td>步骤 3.8</td></tr><tr><td>Ampure 磁珠</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>A2915</td><td>步骤 3.9</td></tr></tbody></table>

hi-c：一种研究基因组三维结构的方法

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

染色体的三维折叠使基因组形成区室化结构，并可将远端的功能元件（如启动子和增强子）在空间上拉近 2-6。解析染色体结构与基因组活性之间的关系，将有助于理解转录和复制等基因组过程。然而，目前对染色体如何折叠仍知之甚少。显微镜技术无法同时或在高分辨率下区分大量基因座。迄今为止，利用染色体构象捕获技术（3C）及其后续改进方法检测染色体相互作用时，必须预先选定一组目标基因座，因而无法实现全基因组范围的研究 7-10。
我们开发了Hi-C技术，这是3C技术的一种延伸，能够以无偏倚、全基因组范围的方式识别长距离相互作用。在Hi-C实验中，细胞首先用甲醛固定，使发生相互作用的基因位点通过共价的DNA-蛋白质交联而彼此结合。随后使用限制性内切酶对DNA进行切割时，这些相互作用的位点仍保持连接状态。在补平5'突出末端的过程中，引入生物素标记的核苷酸残基。接下来，在稀释条件下进行平末端连接，有利于发生交联的DNA片段之间的连接反应。由此生成一个全基因组范围的连接产物文库，其中每个连接产物对应于细胞核中原本空间位置相近的两个DNA片段。每个连接产物在其连接位点处均带有生物素标记。随后将文库片段化，并利用链霉亲和素磁珠富集含有连接位点的片段。纯化后的连接片段可进一步通过高通量测序仪进行分析，从而获得一份完整的相互作用DNA片段目录。
对所得接触矩阵的直接分析揭示了基因组结构的多种特征，例如染色体疆域的存在以及富含基因的小染色体之间的优先关联。对接触矩阵进行相关性分析表明，人类基因组被划分为两个区室：一个为结构较松散的区室，包含开放、可接近且具有活性的染色质；另一个为结构更致密的区室，包含闭合、不可接近且无活性的染色质区域。最后，结合理论推导和计算模拟对接触矩阵进行系综分析发现，在兆碱基尺度上，Hi-C 揭示的特征与分形球状构象相符。

Hi-C 方法能够无偏倚地在全基因组范围内鉴定染色质相互作用（1）。Hi-C 结合了邻近连接和大规模并行测序技术。由此产生的数据可用于在多个尺度上研究基因组结构：早期结果鉴定了染色体疆域、开放与封闭染色质的分离以及兆碱基尺度的染色质结构等特征。

Hi-C：一种研究基因组三维结构的方法

染色体的三维折叠使基因组产生区室化，可将远端的功能元件（如启动子和增强子）拉近……

Hi.C 是一种以无偏倚的全基因组方式鉴定远端染色质相互作用的方法。首先，细胞用甲醛固定，然后裂解细胞，接着使用限制性内切酶对 DNA 进行片段化。随后，在填补五端突出端形成平末端的同时引入生物素标记的残基，并在稀释条件下进行连接，以促进交联的 DNA 片段之间的连接事件。将文库进行剪切，并用链霉亲和素磁珠下拉连接区域。纯化后的连接区域可随后利用高通量测序仪进行分析，从而获得相互作用片段的目录。这些结果使我们得以深入了解染色质的折叠方式，揭示了染色体区域的存在、基因组在开放与闭合染色质中的共区室化，以及在兆碱基尺度上分形团聚体（Fractal Glo）结构的证据。大家好，我是来自马萨诸塞大学医学院基因功能与表达项目Field Decker实验室的Nka Van Bergham。大家好，我是来自哈佛大学和麻省理工学院布罗德研究所Eric Lander实验室的Ez Lieberman Aiden。我是来自布罗德研究所分子生物学研发团队的Louis Williams，然后是来自麻省理工学院Len Muni实验室的Maxima Mackay。今天，我们将向您展示一种名为高通量染色体构象捕获（high C）的全基因组染色体确认捕获技术。我们在实验室中使用该技术来实验性地探究人类基因组的结构。该操作流程的第一部分将在马萨诸塞大学医学院进行，第二部分将在普鲁德研究所完成。我们还将向您展示如何利用 high C 实验的结果，在麻省理工学院（MIT）模拟基因组的动力学行为。那么，让我们开始吧。首先，C 实验从细胞交联开始，这是染色体构象捕获技术中常用的方法。首先培养数量为 2 × 10⁷ 至 2.5 × 10⁷ 的哺乳动物细胞，细胞可为贴壁或悬浮状态，使用匀浆器在 550 µL 裂解缓冲液中对细胞进行裂解并交联。以 5,000 RPM 离心染色质，将沉淀用 500 µL NEB 缓冲液 2 号洗涤两次，将沉淀分装至五个编号的离心管中，并向每管加入 NEB 缓冲液 2 号，使最终体积达到 362 µL。小心加入 38 微升 1% SDS 混合液，在 65 摄氏度孵育 10 分钟。立即将离心管放回冰上，并通过加入 44 微升 Triton X-100 轻柔混合以淬灭 SDS，终浓度为 400 单位 Hindi 三，在 37 摄氏度旋转孵育过夜。接下来的步骤为高 C 特异性操作，包括用生物素标记 DNA 末端，并对交联的片段进行平末端连接。此步骤将使连接接头能够在后续的离心管中被纯化。其中一管不应进行生物素洗脱步骤，而应作为三C对照，以确保消化和连接条件适宜，能够填补限制性片段的突出末端，并在其余四个离心管中的DNA末端标记生物素。向第2至第5管中加入D-A-T-P-D-G-T-P和DTTP。同时加入生物素标记的dCTP和Klino。轻轻混匀，在37摄氏度孵育45分钟。孵育结束后，将离心管置于冰上，然后向所有管中加入86微升10% SDS以灭活酶。将试管在65摄氏度下准确孵育30分钟，随后立即置于冰上。为了促进交联片段之间的连接反应，连接反应需在极低浓度条件下进行。在冰上操作，向五个15毫升试管中各加入7.61毫升连接反应混合液。然后将每份消化后的染色质混合物转移至相应的离心管中。向1号管中加入10微升T4 DNA连接酶，进行常规3C连接反应；向2至5号管中各加入50微升T4 DNA连接酶，进行平末端高通量C连接反应。通过倒置混匀各管，并在 16 摄氏度孵育 4 小时。孵育后，每管加入 50 µL 蛋白酶 K 以降解蛋白质并逆转 CNA 交联，于 65 摄氏度孵育过夜。次日每管再加入额外的 50 µL 蛋白酶 K，继续在 65 摄氏度孵育 2 小时。将反应混合物转移至五个50毫升的锥形管中。通过苯酚抽提法纯化这些管中的DNA。加入10毫升苯酚，涡旋振荡两分钟。将离心管在3,500 RPM条件下离心10分钟，小心地将尽可能多的水相转移至新的50毫升离心管中。使用苯酚-氯仿再次进行提取，并用乙醇沉淀DNA；将乙醇沉淀后的DNA在离心后，每份DNA沉淀溶于450微升1×TE缓冲液中，并转移至1.7毫升离心管中。进一步纯化通过两次苯酚-氯仿提取完成：每次加入500微升苯酚-氯仿，涡旋混匀1分钟，然后在14,000 RPM条件下离心5分钟，第二次提取后将水相转移至新的离心管中。将DNA进行乙醇沉淀，离心收集沉淀的DNA后，每个DNA沉淀物用70%乙醇洗涤一次，然后重悬于25 µL的1×缓冲液中。通过向每管加入1 µL RNase A以降解可能存在的RNA，并在37°C下孵育30分钟。收集第2至第5管的高C组分，同时保持第1管单独存放，作为3C对照。现在可以通过将等分试样在0.8% AASE凝胶中电泳来检查文库的数量和质量，以评估HI C连接效率。应使用PCR消化实验评估HI C文库的连接效率。HI C实验流程中的平末端生成和连接反应会为内切酶在HE一个位点处重新形成限制性酶切位点，从而使得来自3C和Hi-C文库的扩增片段能够用HindIII和NheI进行消化，以检测平末端生成的效果；部分片段将不会被连接。对于这些未连接的末端，应按照书面实验方案中所述，利用T4 DNA聚合酶的外切核酸酶活性去除生物素。使用苯酚-氯仿抽提法和乙醇沉淀法再次纯化DNA，并将DNA沉淀重悬于总体积为100 µL的水中。如果样品已通过质量控制检测，则继续进行生物素标记沉淀和测序。谢谢。为了使生物素标记的DNA适用于高通量测序，必须使用CAVAS S2仪器将DNA片段化至300至500个碱基对的大小。通过加入10×连接缓冲液、dNTPs、T4 DNA聚合酶、T4多核苷酸激酶、切刻修复DNA聚合酶和水，对剪切后的DNA进行末端修复，并在室温下孵育30分钟。孵育结束后，使用Kaya Gym MinElute柱根据制造商的建议纯化DNA。将DNA上样至柱子并洗涤后，用50微升1×TE缓冲液洗脱两次。随后，通过加入10×NEB缓冲液、dATP、水和缺乏外切酶活性的cile片段，将dATP连接到末端修复后的DNA的3'突出端。在37摄氏度下孵育反应30分钟，以灭活cile片段。随后在65摄氏度下孵育反应20分钟，并使用真空浓缩仪将反应物迅速冷却至冰上，将反应体积浓缩至20 µL。接下来，将DNA上样至含1×TAE的1.5%琼脂糖凝胶中，在80至90电压下电泳运行3.5小时。切下300至500个碱基对之间的DNA片段，并根据凝胶重量使用两到四个柱子，利用Qiagen凝胶回收试剂盒进行纯化。合并Kayak快速柱中的黄色八联管组分，并用XTLE缓冲液将最终体积调至300微升。最后，使用Qubit的QU检测试剂测定DNA浓度，并计算本实验步骤中DNA的总量。从DNA文库中纯化连接接头，从而通过成对末端测序高效鉴定相互作用的染色质片段。后续所有步骤均需在低吸附DNA管中进行。准备用于生物素的磁珠。通过使用400微升1×Tween缓冲液将重悬的磁性Strep A珠子洗涤两次，每次150微升，进行下拉。后续的洗涤包括五个步骤：向珠子中加入缓冲液，将混合物转移至新管，室温下旋转样品3分钟，使用磁性粒子浓缩器回收珠子。我正在去除上清液。将磁珠与 300 微升不含吐温的 2× 缓冲液混合，并加入 300 微升高浓度 cDNA。将生物素标记的高浓度 cDNA 与链霉亲和素磁珠混合后，在室温下旋转孵育 15 分钟，使生物素标记的 cDNA 与磁珠结合。使用磁性颗粒浓缩器回收与磁珠结合的DNA-链霉亲和素A复合物，并移除上清液。用400微升含1×无Tween缓冲液洗涤磁珠，随后用100微升1×连接缓冲液洗涤。将磁珠重悬于50微升1×连接缓冲液中，并将混合液转移至新管中。为了准备用于Illumina双端测序的DNA，取用户输入的用于生物素富集的总DNA量（此前已通过定量检测计算得出），将其除以20，以估算被富集并可用于连接的高浓度cDNA量。每微克可用于连接的高浓度cDNA，加入六个POLS的Illumina双端接头。使用1,200单位的T4 DNA连接酶将接头连接至DNA。在室温下孵育两小时。通过回收高结合量的cDNA磁珠，并用400微升1×Tween缓冲液洗涤磁珠两次，去除未连接的成对末端接头。用200微升1×不含Tween的缓冲液洗涤磁珠，随后依次加入200微升和50微升1×NEB缓冲液进行洗涤。最后一次洗涤后两小时。将珠子重悬于 50 µL NEB buffer 2 中，并转移至新管。为确定生成足够用于测序的 PCR 产物所需的循环数。设置四组测试性PCR反应，分别进行6、9、12或15个循环。将PCR产物在5%聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并用Cyber Green染色，通过观察条带情况确定最佳循环数，确保无非特异性条带，且在400–600碱基对之间出现弥散条带（该长度为连接接头后共有产物的长度）。随后，使用最佳PCR循环数对高复杂度文库的去链产物进行大规模PCR扩增，反应体系中保留磁珠。从各个独立孔中回收PCR产物，并重新收集磁珠。保留1%的大规模PCR产物用于凝胶电泳，其余PCR产物按照生产商的建议，使用1.8倍体积的纯化磁珠进行纯化。用50 µL的XTLE缓冲液洗脱DNA，并将经PU磁珠纯化的PCR产物的1%与原始PCR产物的1%等分试样在5%聚丙烯酰胺凝胶上进行比较。为确保成功去除PCR引物序列，采用Illumina双端测序构建的高C文库可通过MAC软件对每端独立比对，以鉴定相互作用的染色质片段。当高通量染色体构象捕获（high C）实验技术操作良好时，应获得以下结果，这些结果可作为质量控制标准。质量控制步骤应显示，三C（three C）和高通量C（high C）文库均呈现为明显且紧密的条带，大小超过10千碱基。若出现DNA弥散条带，则表明连接效率较低。通常，与三C模板相比，高C文库的连接效率略低。可通过消化三C PCR产物来估算高C标记效率和连接效率。三C连接处可被HindIII切割，而不会被NheI切割。对于高C连接位点，情况则相反。该PCR消化实验显示，70%的高C扩增产物可被NHE I切割，而不能被Hind III切割。三、验证连接位点标记的有效性：对测序读段的分析应表明，来自染色体内和染色体间相互作用（分别由蓝色和红色线条指示）的读段，相较于绿色所示的随机生成读段，更显著地靠近Hind III限制性位点。在一次成功的实验中，55%的可比对读段对代表染色体间相互作用，15%代表相距小于20千碱基的染色体内部相互作用，30%为相距超过20千碱基的染色体内部读段对。该分布可在高通量测序之前进行取样，作为质量控制的一种形式。克隆并进行Sanger测序约100个克隆通常已足够。染色质相互作用可呈现为热图，其中x轴和y轴代表低分辨率的基因组顺序，每个像素代表两者之间观察到的相互作用次数。通常情况下，在线性基因组中彼此非常接近的DNA片段倾向于频繁地相互作用。在染色体内或热图中，这表现为一条显著的对角线。以下结果展示了分析数据的不同方法，以揭示基因组的不同层级结构。将接触概率相对于基因组距离作图表明，接触概率随基因组距离的增加而降低，最终在每个距离上达到一个平台期。实线所示的染色体内相互作用相对于由虚线表示的染色体间相互作用更为富集。这直接表明存在染色体区域；通过计算所有染色体对之间染色体间相互作用的实际观测数与期望数，揭示了特定染色体对之间的优先关联。小的、基因富集的染色体优先相互作用，由亮红色表示。也可以对单条染色体进行分析。可通过使用预期热图对原始热图进行调整，以校正基因组上位点对之间的距离差异，从而得到“观测值与预期值比值”的热图。随后，可通过计算“观测值与预期值比值”热图的行与列之间的相关性，生成相关性矩阵。通过相关性分析，已证明人类基因组可分离为两个区室。这一点由棋盘格模式得以展示。在利用高 C 数据绘制的相关性热图中，人们对染色质在兆碱基尺度上的折叠方式获得了新的认识。染色质折叠的普通聚合物模型会预测染色质以平衡态GLO方式折叠。绘制接触概率与距离的关系图表明，接触概率随基因组距离呈幂律关系，其斜率约为负一。这与平衡态GLO的行为不一致，但却符合一种称为分形GLO的替代结构的预期。此处展示了两种规则结构。颜色对应于从一端开始的距离，由蓝色到青绿色、黄色、橙色，再到红色。与平衡态凝胶球类似，分形凝胶球在分形Glo中缺乏缠结。沿着轮廓位置相近的位点在三维空间中也倾向于彼此靠近，从而形成单色区块。这类区块在平衡态Glo中并不存在。通过移除对胶状颗粒的约束力，使其得以扩张，可证明缺乏缠结的现象：分形Glo会迅速去凝聚；而平衡态Glo则不会发生此现象，因其结构过于缠结。我们刚刚向您展示了如何构建高通量染色质相互作用分析（high C）文库。在进行该实验流程时，重要的是要记住设置适当的对照，以确保高通量染色质相互作用连接和纯化的效率。测序读段的数量最终将决定相互作用图谱的分辨率。我们已使用约 3000 万条测序读长，在约 1 兆碱基的分辨率下构建了人类基因组的相互作用图谱。为了将分辨率提高 N 倍，测序读长的数量需要增加 N² 倍。希望您能享受了解人类基因组结构的过程。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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跨尺度染色体构象捕获

本方案描述了染色质捕获结合高通量测序（Capture...

通过捕获式 Hi-C 解析高分辨率 3D 染色质结构 via Capture Hi-C

本文介绍了一种利用全基因组染色体构象捕获方法Micro-C-XL，以核小体分辨率绘制三维基因组结构的实验方案。...

利用 Micro-C-XL 绘制哺乳动物三维基因组相互作用

本文详细介绍了染色体构象捕获（3C）技术的一种改进方法，重点强调本科生的参与和学习过程。...

通过3C获得A：面向本科生的染色体构象捕获技术

基因表达受到基因启动子与远端调控元件相互作用的调控。本文介绍了低起始量的捕获染色体构象捕获技术（liCHi-C）如何实现对稀有细胞类型中这些相互作用的鉴定，而这些细胞类型在此前是无法测量的。...

一种用于在稀有细胞群体中研究以启动子为中心的时空基因组结构的整合工作流程

本文介绍了一种用于捕获与RNA相关的染色质DNA-DNA相互作用的实验方案，以绘制RNA相关的三维基因组结构图谱。...

RNA相关染色质DNA-DNA相互作用方法

学习Hi-C方法用于研究基因组三维架构，通过甲醛交联、限制性内切酶消化、生物素标记及高通量测序技术，揭示染色体区域和染色质区室化特征。该方法为理解基因调控机制提供重要依据。

Hi-C：一种研究基因组三维结构的方法

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