大蛋白复合物结构质谱分析

以下实验的总体目标是使用结构质谱法表征大型蛋白质组装体。这是通过制备用于纳流电喷雾电离的镀金毛细管来实现的。第二步，制备样品并校准质谱仪以进行高质量测量。

接下来，优化实验条件，以保持蛋白质复合物在气相中完好无损。然后获取 MS 和串联 Ms.Spectra。MS 谱图显示与完整复合物质量相对应的电荷态，而串联 MS 实验产生单体和剥离复合物的缔合模式。

嗨，我是来自怀特曼科学研究所 Miron 实验室的 Naam Kiba，我是 Isaac Ky.我也来自米其隆实验室。今天，我们想向您展示通过应用结构光谱法分析大型蛋白质复合物的基本程序，我们在实验室中使用该程序来表征蛋白质复合物，以定义您的储备几何形状、组成和相互作用网络。那么让我们开始吧。

使用 EMME plus 或 qua 毛细管通过空气喷雾免疫技术进行非电流结合蛋白复合物的分析。该毛细管 C 可以拉到大约 1 微米直径的细尖，然后用金等导电材料进行涂层。这些毛细管是市售的，您可以在这里看到。

但是，使用起来更具成本效益。玻璃毛细管 eh 可以冷却并涂布到即用型冷却状态，在此针头共用装置上进行，并在该 eh 涂层设备上进行涂层。要开始此过程，请将两张双面胶垫贴在培养皿的底部，使条带相距两厘米。

将玻璃棒放在其中一个垫子的中央。粘性垫将毛细管固定到位，玻璃棒支撑准备好的毛细管，并防止毛细管的尖端破裂。使用外径为 1 毫米、直径为 0.78 毫米的 Boris 硅酸盐玻璃毛细管。

将一个毛细管插入针头，将毛细管轻轻聚集到位并调整其位置，使其位于加热丝的中心。轻轻拧紧夹具，直到毛细管在两端保持牢固。使用此处显示的预定义程序拉动毛细管。

但是，请记住，对拉拔器进行编程的过程是一个反复试验的过程。在获得可接受的尖端形状之前，每个拉动的毛细管都会产生两个最终形状的毛细管。从仪器中取出拉出的毛细管并检查尖端，丢弃任何变形或破损的尖端。

使用钝头定位镊子将毛细管放入培养皿中。毛细管的底部连接到胶垫上，上部靠在玻璃棒上，尖端朝上。继续拉动毛细管，直到培养皿装满。

大约 80 个毛细管适合一个直径为 10 厘米的培养皿。接下来，在毛细管上涂上金。将板插入镀金镀锌板中。

确保根据制造商的说明选择气体供应，并激活预定义的涂层周期。涂层重复 3 到 6 次，直到毛细血管均匀呈金黄色。毛细管准备好后，继续校准质谱仪。

在 MultiPro 复合物上进行的大多数实验都是通过像这样的 al Electrospray 四倍飞行时间质谱仪进行的。Inupt 来自水域，针对高质量进行了改性。在加载蛋白质样品之前，使用碘化铯校准质谱仪。

首先，在纯净水中制备每毫升 100 毫克的铯溶液，铯用于高质量校准。由于单电荷盐簇的质量范围很广，从 393 桅杆与电荷比到远超过 10， 000 个。使用钝镊子，从培养皿中取出涂层毛细管，然后将两微升铯溶液加载到毛细管中。

使用加载 einor 凝胶的尖端。将溶液滑向毛细管尖端，手动或使用降速适配器。将毛细管插入毛细管支架，并调整毛细管，使尖端距离支架边缘约 10 毫米。

将毛细管放在光学显微镜下，并使用锋利的 AA 型镊子修剪尖端。重要的是要验证毛细管内没有可能阻塞液流的气泡，并且毛细管没有堵塞。此外，请确保金涂层未从毛细管上剥离。

如果是这样，请更换毛细管或修剪尖端并去除未涂层的部分。接下来，将毛细管支架连接到纳流 ESI 接口。向后旋转 XY、Z 载物台以避免损坏毛细管并将载物台推入其激活位置。

毛细管应放置在距锥孔口 1 至 10 mm 的距离处。施加毛细管电压和低纳流压力，直到开始喷雾。然后尝试将纳流压力降低到最小值。

通过调整 XYZ 载物台的位置、毛细管电压、纳流压力和 diss 溶剂化气体流量来优化信号强度。为了检测较宽质量范围的季节峰值序列，应优化加速电压。这里使用的参数是毛细管 1.3 至 1.7 千伏样品锥、80 至 150 伏、萃取锥、1 至 3 伏，以优化高质量离子的传输，这需要温和的干燥条件。

在源和分析仪之间的初始真空阶段，前级压力升高到 5 到 6 毫巴。为了提高前级压力，通过部分关闭隔离阀，小心地降低源真空管路到涡旋泵的电导率，同时监测对信号强度的影响。设置质谱仪完成后，以每秒一次扫描的速度收集约 30 次扫描，主电荷比范围为 1000 至 15， 000 次采集后，使用适当的校准表校准飞行时间。

现在校准已完成，可以加载蛋白质样品。样品是在校准质谱仪之前制备的，需要低微摩尔浓度。如有必要，使用离心超滤装置浓缩样品。

使用前确认蛋白质复合物未被设备膜吸收。通过检查体积和 UV 吸光度，NESI 只能使用挥发性溶液，因此通常需要更换缓冲液。微量离心凝胶过滤柱可用于去除所有痕量盐、缓冲分子或任何其他非挥发性加合物。

相反，请暂停样品。乙酸铵水溶液。这个关键步骤决定了光谱的质量。

以最小稀释度重复缓冲液更换最多 3 次，每个装置的稀释度小于 1.3 倍，直到达到最大交换量。如果同时需要浓缩和缓冲液更换，可以使用离心超滤一起完成，如本节开头所示。接下来，如图所示加载碘化铯校准样品并开始喷雾。

首先对喷雾进行初始优化，直到检测到信号。使用所示的平均电荷态方程，其中 M 是复合物的质量。然而，在道尔顿中，电荷态的确切位置取决于蛋白质。

为防止复杂解离，请勿加热铁源。要么关闭加热器，要么将温度保持在 40 摄氏度以下。改变毛细管位置、样品锥和萃取器电压。

为了最大限度地提高铁传输率，一个可能的起点是锥体电压、100 伏提取锥体、1 伏特和毛细管电压 1.5 千伏。检查光谱中产生的变化。优化这些参数并结合纳流压力，以改善神化并去除残留水和缓冲成分。

增加碰撞池中气体压力的偏置电压。典型的偏置电压在 10 至 100 伏特范围内，捕集气体流量为每分钟 1 至 10 毫升。请小心执行此作，以防止复合物的关联，调整陷阱并转移碰撞能量。

传输高质量离子通常需要更高的电压，通常在 10 到 30 伏的范围内。此时，重要的是要避免碰撞诱导的复合物解离，如图所示。在达到稳定信号后，建议在保持稳定喷雾的同时，将纳流压力和毛细管电压降低到最小值。

收集几次扫描后，继续通过串联质谱法鉴定复合物的组分。一旦为蛋白质复合物获得了最佳且稳定的信号，即可选择将质量中心设置为分离宽度的母离子。通常，低质量分辨率为 12 和质量分辨率在 13 到 15 之间，使用较宽的质量范围来检测高质量、低电荷解离产物，然后将其降低到所需的值来执行毫秒。

MS 解离前驱体铁 通过增加碰撞能量（缩写为 CE 和碰撞室上的压力），以 10 至 20 伏的步长逐渐增加捕集阱或转移 CE，并将碰撞气体压力提高到每分钟 0 至 5 毫升。监测谱图的变化，直到达到最佳活化条件。高活化能可诱导一个或多个亚基与完整复合物解离，并阐明不同亚基的相互作用亲和力。

为 ms MS 分析选择多个电荷。在组分重叠的情况下，获取一组串联 MS 谱图有助于解析不同群体的电荷级数。此外，与低电荷态叠加 MS 和 ms 相比，较高的电荷态更容易解离。

Ms 谱图验证所选母离子的分离情况。除了通过 MS 和 ms 表征完整复合物外，MS 还会在温和变性条件下生成更小的子复合物和溶液，并对其进行表征。

亚复合物的 MS 和 ms MS 分析构成了定义复合物亚基结构的基础，用于部分破坏亚基亚基相互作用逐渐添加浓度高达 50% 的有机溶剂或通过添加浓度高达 4% 的氨或甲酸来改变溶液的 pH 值最后， 为了确定组成复合物的各个亚基的质量，在变性条件下获取谱图非常重要。这可以使用拉链尖端 C four 进行，水乙腈比例为 25 至 75，以 1% 甲酸作为 elucian 溶剂，收集所有数据，按照随附的书面方案中详细说明处理和分析结果。在加载蛋白质复合物样品之前，质谱仪使用碘化铯进行校准。

红色标记的一系列等距峰的范围很广，从 393 的主电荷比到远高于 10， 000 的电荷比。它们被分配用于铯加复合物的一般组成的单电荷盐簇。以黑色标记的主峰之间的其他信号是由系列铯二加络合物和铯三加络合物的双电荷和三电荷物质引起的。

在初始真空阶段增加压力对于检测高质量团簇至关重要。压力对高质量峰的影响在这里以 1.2 和 5.3 毫巴的压力读数反驳进行演示。此处显示了扩展的较高压力的质量谱。

这是凝集素变体复合物的质谱分析示例，该复合物在 3000 和 5， 000 主电荷比之间产生电荷态分布。然而，由于离子的充分干燥，峰很宽。将偏置电压从 4 伏增加到 15 伏，这会导致加速条件的增加，导致残留水和缓冲成分的剥离，产生高分辨率的光谱，测量的质量对应于五聚体复合物。

然后选择加 15 电荷态进行串联 MS 分析。碰撞能量的增加导致释放出以 1,664 主装药比为中心的高电荷单体和 5,000 至 8,000 质量装药比范围内的剥离四聚体络合物。还在导致复合物结合的变性条件下检查了凝集素变体复合物。

通过这种方式，可以确定构成复合物的各个亚基的精确质量数。我们刚刚向您展示了如何获取质谱和串联高质量离子的 Ms 光谱。执行此程序时，请务必正确制备样品，并仅使用与质谱兼容的挥发性缓冲液。

就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。