体内检测微图案化表面的蛋白质-蛋白质相互作用

解析活细胞内分子相互作用网络对于理解调控细胞代谢和功能的机制具有重要意义。越来越多能够提供定性和定量信息的方法学正在推动我们获得关于细胞功能的整体图景。共免疫沉淀、TAP标签或光交联实验可实现大分子复合物的体外纯化。

此外，已设计出多种方法用于分析活细胞中的蛋白质相互作用。这些方法包括双杂交筛选或荧光蛋白的互补实验。此外，已建立一些光谱学方法（如 fret 或 FCS）以及非光谱学方法来解决这一问题。

上述技术虽已用于记录大规模细胞群体，但由于其间接性较强，因此难以实现定量分析。相比之下，已有一些高端的定量方法被提出，然而，要将高通量能力与获取定量信息的可能性结合起来仍具有较大难度。

我们近期开发了一种用于鉴定蛋白质-蛋白质相互作用的新概念。此处的微图案技术示意图展示了将BSA Sci五的微图案SA网格打印在功能化玻璃盖玻片上，随后在间隙中填充链霉亲和素，再引入生物素标记的配体。在大多数情况下，使用针对膜蛋白的抗体。

在生长于此类微生物组芯片上的细胞中，蛋白质诱饵将根据抗体微图案排列在质膜上。通过测量共图案化的程度，来检测其与第二种荧光标记的蛋白质猎物之间的相互作用。使用具有方形阵列的硅模板PDMS印章，其特征尺寸和深度均经过精确设计。

将三微米的凝胶制备物切割成小块。将这些印模用100%乙醇和双蒸水冲洗，并用氮气吹干。随后，将其与0.67毫克/毫升的sci-fi孵育。

室温下孵育30分钟，使用标记的BSA溶液。孵育期间，环氧修饰的玻璃盖玻片以相同方式清洗。划线后，印章用PBS和水以相同方式清洗。用于BSA sci五转移。

将印章用氮气吹干后，立即在自重作用下置于玻璃盖玻片下30分钟。在盖玻片背面标记微图案区域的位置。移除印章后，用粘性硅胶掩膜密封盖玻片。

将链霉亲和素溶液（50 微克/毫升）加入到腔室中，孵育一小时，随后用一毫升 PBS 洗涤。接着，将链霉亲和素图案与 10 微克/毫升的生物素化抗体孵育一小时，用 PBS 洗涤后，将细胞加入腔室中。待细胞贴附于表面后，样品即可进行检测。

读取信号的唯一要求是具备能够在全内反射配置下照射样本的荧光显微镜。此类系统可从不同供应商处商业购得，且近年来对用户而言操作已变得简便。我们的检测系统基于倒置荧光显微镜构建。

氩离子和氪离子激光器用于选择性激发所用荧光染料样品的荧光。样品通过基于物镜的全内反射构型进行照明，使用100倍高数值孔径油浸物镜。经过标准滤光片组适当滤光后，荧光信号成像至背照式CCD相机。读出采用时间延迟积分模式，可实现大样品区域的扫描。为此，样品通过电动XY载物台移动，并与相机的行转移同步。

背向反射的激光束被成像在双区光电二极管上，其差分信号用于控制Z轴压电陶瓷以实现快速重新聚焦。读取器配备有在扫描过程中自动运行的自动聚焦保持系统，其中一次扫描使用488纳米激光选择性激发GFP，第二次扫描使用647纳米激光选择性激发PS Five。数据分析采用基于MATLAB编写的对比度计算程序，该程序依据捕获抗体区域内外的荧光强度进行计算。

通过分析对比度水平，从而快速分析大量细胞中蛋白质相互作用的程度。也可使用市面上可购得的自动化软件。例如，Olympus 公司提供的 scan R 成像软件已成功用于微图案实验中对比度的评估。

我们分析了如图所示的T细胞早期信号通路中CD4与LCK蛋白之间已知的相互作用。荧光标记的LCK明显在CD4抗体包被的区域重新分布。通过添加锌螯合剂破坏锌指结构（该结构是这两种蛋白相互作用的主要位点），会降低LCK微区分布的对比度。

总之，微图案技术的主要优势如下：可对局部空间分辨的蛋白质相互作用进行定量分析；此外，还能检测活细胞质膜中的弱相互作用、检测受调控的诱饵-猎物相互作用、分析静息状态，并且该方法适用于高通量分析。