Name: 微图案的表面上的蛋白质-蛋白质相互作用的体内检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-19T17:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 学习微图案技术用于活细胞中蛋白质-蛋白质相互作用的高通量定量分析。该方法可检测弱相互作用并分析T细胞信号传导中的动态过程，为细胞生物学研究提供强大工具。

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我们感谢奥地利林茨大学的Quentina Beatty提供的帮助，感谢瑞士日内瓦大学的Katharina Strub提供hCD71-GFP质粒，以及感谢瑞士康斯坦茨大学的Daniel Legler提供GPI-GFP-DAF质粒。本研究得到了奥地利科学基金（FWF；项目编号Y250-B03）和奥地利联邦科学与研究部GEN-AU项目的支持。

微接触印刷：
<ol>
	<li>使用手术刀切割出PDMS印章上的微图案区域</li>
 <li>用乙醇（100%）和蒸馏水冲洗含有微图案的区域进行清洗。</li>
 <li>用氮气或氩气吹干PDMS印章。</li>
 <li>将50 μl BSA-Cy5工作溶液（0.67 mg/ml）移液至PDMS印章上，确保整个微图案区域被溶液覆盖。室温孵育30分钟。</li>
 <li>用磷酸盐缓冲盐水（PBS）和蒸馏水冲洗微图案区域。</li>
 <li>用氮气或氩气吹干PDMS印章。</li>
 <li>将PDMS印章依靠自身重量放置于一张环氧涂层盖玻片的中央，并在培养皿中室温孵育30分钟。</li>
 <li>在盖玻片背面标记PDMS印章的位置，并用镊子将印章从玻片上剥离。</li>
 <li>在盖玻片上微接触印刷的区域上方贴上Secure Seal杂交腔室。标记有助于定位该区域的中心。</li>
 <li>向反应腔室中加入60 μl链霉亲和素工作溶液（50 μg/ml），室温孵育60分钟。</li>
 <li>通过向腔室的一个端口加入1 ml PBS缓冲液，同时用泵从第二个端口同步移除液体，对样品进行洗涤。</li>
 <li>向反应腔室中加入60 μl生物素化抗体工作溶液（10 μg/ml，溶于含0.1% Tween 20的PBS缓冲液中，即“PBST”），室温孵育60分钟。</li>
 <li>依次使用1 ml PBST和1 ml PBS洗涤样品，方法为向腔室的一个端口加入缓冲液，同时用泵从第二个端口同步移除液体。</li>
 <li>将制备好的微图案表面保存在PBS中，避光、室温存放，直至细胞准备接种。</li>
</ol>
细胞在微图案化表面的孵育：
<ol>
 <li>在3 cm组织培养皿中将贴壁细胞培养至50%汇合度。</li>
 <li>使用乙二胺四乙酸（EDTA）溶液消化表达目标诱饵蛋白和猎物蛋白的细胞，并在1,000 rpm转速下离心5分钟。</li>
 <li>弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于相应的生长培养基中。</li>
 <li>在1,000 rpm转速下离心5分钟。</li>
 <li>弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于适当的生长培养基中。</li>
 <li>用60 μl细胞悬液替换微图形化盖玻片反应腔中的PBS。</li>
 <li>通过将无菌垫浸入蒸馏水中并放入培养皿内，构建一个加湿环境，以防止样品干燥。</li>
 <li>将细胞在37 °C、5% CO2条件下于微图形化表面孵育过夜。</li>
 <li>在显微镜下分析细胞前，将培养基更换为含Ca2+和Mg2+的Hank's平衡盐溶液。</li>
</ol>
显微镜技术：
<ol>
 <li>将盖玻片置于合适的载物台上，在白光下检查细胞形态。</li>
 <li>通过647 nm激发检查BSA-Cy5图案的质量。</li>
 <li>在全内反射（TIR）激发下，于488 nm或514 nm记录荧光捕获蛋白（GFP或YFP）的微米级图案。</li>
</ol>
代表性结果：
如果在微图形化表面上生长的细胞中目标蛋白之间存在相互作用，则捕获蛋白将跟随诱饵蛋白的重新分布。由此产生的微图形可通过捕获蛋白的荧光标记进行可视化。重要的是，所获得的对比度可直接反映相互作用的强度（见图1）。因此，无需对测得的原始数据进行进一步处理，即可简单地评估两种蛋白之间的相互作用。
<img src="/files/ftp_upload/1969/1969fig1.jpg" alt="用于蛋白质定位分析的细胞结构荧光显微镜图像。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 活细胞质膜中诱饵分子在不同相互作用强度下的重排。显示了转染了以下物质的T24细胞的全内反射（TIR）图像：(a) CD71-GFP与CD71抗体、(b) CD4与胞质YFP与CD4抗体、(c) GPI-GFP-DAF与CD59抗体微阵列。这些数据分别代表强相互作用（a）、无相互作用（b）和弱相互作用（c）。(a) 重印自（Weghuber et al., in press），(b) 重印自（Schwarzenbacher et al., 2008）。

<ol><li>Brameshuber, M., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schuetz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reply+to+%22Uncoupling+diffusion+and+binding+in+FRAP+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Reply to "Uncoupling diffusion and binding in FRAP experiments.</a> Nat. Methods. 6, 183-184 (2009).</li>
<li>Kim, P. W., Sun, Z. J., Blacklow, S. C., Wagner, G., Eck, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Zinc+Clasp+Structure+Tethers+Lck+to+T+Cell+Coreceptors+CD4+and+CD8%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Zinc Clasp Structure Tethers Lck to T Cell Coreceptors CD4 and CD8.</a> Science. 301, 1725-1728 (2003).</li>
<li>Ramm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+screening%3A+a+technology+in+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Image-based screening: a technology in transition.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 16, 41-48 (2005).</li>
<li>Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Brameshuber, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+for+quantitative+analysis+of+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Micropatterning for quantitative analysis of protein-protein interactions in living cells.</a> Nat. Methods. 5, 1053-1060 (2008).</li>
<li>Weghuber, J., Brameshuber, M., Sunzenauer, S., Lehner, M., Paar, C., Haselbruebler, T., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Paster, W., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+protein-protein+interactions+in+the+live+cell+plasma+membrane+by+quantifying+prey+redistribution+upon+bait+micropatterning%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Detection of protein-protein interactions in the live cell plasma membrane by quantifying prey redistribution upon bait micropatterning.</a> Methods in Enzymology. , Forthcoming Forthcoming.</li>
</ol>

本视频包含由奥林巴斯公司提供的图像，或来自布朗大学可视化研究实验室主页的图像，或取自（Kim et al., 2003）的图像。

配套视频演示了一种用于检测活细胞质膜中蛋白质-蛋白质相互作用的方法（Schwarzenbacher et al., 2008; Brameshuber et al., 2009; Weghuber et al., in press）。原则上，任何基于全内反射荧光（TIRF）的显微镜平台均可用作检测系统。只有在需要高灵敏度时（例如检测单个分子），才需使用先进的显微镜设备。为获得最佳结果，在制备过程中需特别注意以下关键步骤：
<ol class="lroman">
 <li>将Cy5储备液在避光条件下保存，以防止荧光染料漂白，并在微接触印刷前新鲜配制BSA-Cy5工作溶液。</li>
 <li>使用移液器枪头时注意不要划伤PDMS上的微图案，并将样品在避光条件下孵育，以防止荧光染料漂白。</li>
 <li>将盖玻片置于无菌垫上，以防止玻片粘附到培养皿上。一旦PDMS印章粘附到玻片上，就不要再移动。</li>
 <li>避免反应室中产生气泡，并将样品在避光条件下孵育，以防止荧光染料漂白。</li>
 <li>不要让样品干燥超过2分钟，以避免盐晶体形成。</li>
 <li>在细胞解离过程中不要使用胰蛋白酶，因为它会切割已表达的膜蛋白的胞外结构域。避免使用胰蛋白酶有助于低周转率蛋白在细胞贴附到表面后立即形成微图案。</li>
 <li>在显微镜下控制孵育的细胞数量，确保细胞融合度不超过30–50%。由于细胞在抗体包被的表面上贴附迅速，必须立即去除过量的细胞。</li>
 <li>只有具有高质量BSA-Cy5图案的玻片才能用于后续分析。</li>
 <li>由于每扫描可分析的细胞数量更多，稳定表达荧光捕获蛋白更为理想。</li>
 <li>由于存在胞质背景信号，适当的全内反射荧光（TIRF）调节对于可视化图案至关重要。</li>
</ol>
微图案技术为蛋白质-蛋白质相互作用的分析提供了多种可能性。首先，该技术不仅能够对局部的、空间分辨的蛋白质-蛋白质相互作用进行定量分析，还能检测弱相互作用或间接相互作用，且不会带来假阳性或假阴性结果过多的问题。其次，该技术使研究者能够在活细胞的质膜环境中分析蛋白质-蛋白质相互作用，而这一点通过酵母双杂交等生化方法难以实现。第三，该方法可用于检测受环境变化（如温度、不同蛋白质或其他分子的存在，以及翻译后修饰）调控的诱饵-猎物相互作用。因此，该检测方法可在活细胞背景下筛选特定相互作用对的调节因子。此外，通过降低捕获配体的表面密度或使用单价配体，还可实现对静息状态的分析。最后，若采用适当的扫描平台，所分析的细胞数量足以满足制药公司在药物筛选中对高通量的需求（Ramm, 2005）。

体内检测微图案化表面的蛋白质-蛋白质相互作用

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

揭示分子间相互作用网络体内对于理解调控细胞功能和代谢的机制至关重要。目前已开发出多种用于研究细胞内分子相互作用的方法，但大多数方法较为间接，因此难以实现准确定量。相反，尽管已有一些高端的定量技术被引入，但这些技术难以扩展到高通量应用。为了将高通量能力与获取定量信息的可能性相结合，我们近期提出了一种新的蛋白质-蛋白质相互作用鉴定概念（Schwarzenbacher）等., 2008)。在此，我们描述了一种详细的方案，用于设计和构建该系统，该系统可用于分析荧光标记蛋白（“猎物”）与膜蛋白（“诱饵”）之间的相互作用。体内细胞被接种在包被有针对诱饵蛋白胞外域抗体的微图案化表面上。通过荧光标记的捕获蛋白的重新分布来检测诱饵-捕获物之间的相互作用。该方法具有高灵敏度，可达到单分子水平，能够检测弱相互作用，并具备高通量能力，因此可作为筛选工具使用。

本视频展示了利用微图案化表面进行蛋白质-蛋白质相互作用实验及后续分析的方法。该方法能够在活细胞中检测蛋白质相互作用，兼具高通量能力与获取定量信息的优势。

揭示体内分子相互作用网络对于理解调控细胞功能和代谢的机制至关重要。大量……

解析活细胞内分子相互作用网络对于理解调控细胞代谢和功能的机制具有重要意义。越来越多能够提供定性和定量信息的方法学正在推动我们获得关于细胞功能的整体图景。共免疫沉淀、TAP标签或光交联实验可实现大分子复合物的体外纯化。此外，已设计出多种方法用于分析活细胞中的蛋白质相互作用。这些方法包括双杂交筛选或荧光蛋白的互补实验。此外，已建立一些光谱学方法（如 fret 或 FCS）以及非光谱学方法来解决这一问题。上述技术虽已用于记录大规模细胞群体，但由于其间接性较强，因此难以实现定量分析。相比之下，已有一些高端的定量方法被提出，然而，要将高通量能力与获取定量信息的可能性结合起来仍具有较大难度。我们近期开发了一种用于鉴定蛋白质-蛋白质相互作用的新概念。此处的微图案技术示意图展示了将BSA Sci五的微图案SA网格打印在功能化玻璃盖玻片上，随后在间隙中填充链霉亲和素，再引入生物素标记的配体。在大多数情况下，使用针对膜蛋白的抗体。在生长于此类微生物组芯片上的细胞中，蛋白质诱饵将根据抗体微图案排列在质膜上。通过测量共图案化的程度，来检测其与第二种荧光标记的蛋白质猎物之间的相互作用。使用具有方形阵列的硅模板PDMS印章，其特征尺寸和深度均经过精确设计。将三微米的凝胶制备物切割成小块。将这些印模用100%乙醇和双蒸水冲洗，并用氮气吹干。随后，将其与0.67毫克/毫升的sci-fi孵育。室温下孵育30分钟，使用标记的BSA溶液。孵育期间，环氧修饰的玻璃盖玻片以相同方式清洗。划线后，印章用PBS和水以相同方式清洗。用于BSA sci五转移。将印章用氮气吹干后，立即在自重作用下置于玻璃盖玻片下30分钟。在盖玻片背面标记微图案区域的位置。移除印章后，用粘性硅胶掩膜密封盖玻片。将链霉亲和素溶液（50 微克/毫升）加入到腔室中，孵育一小时，随后用一毫升 PBS 洗涤。接着，将链霉亲和素图案与 10 微克/毫升的生物素化抗体孵育一小时，用 PBS 洗涤后，将细胞加入腔室中。待细胞贴附于表面后，样品即可进行检测。读取信号的唯一要求是具备能够在全内反射配置下照射样本的荧光显微镜。此类系统可从不同供应商处商业购得，且近年来对用户而言操作已变得简便。我们的检测系统基于倒置荧光显微镜构建。氩离子和氪离子激光器用于选择性激发所用荧光染料样品的荧光。样品通过基于物镜的全内反射构型进行照明，使用100倍高数值孔径油浸物镜。经过标准滤光片组适当滤光后，荧光信号成像至背照式CCD相机。读出采用时间延迟积分模式，可实现大样品区域的扫描。为此，样品通过电动XY载物台移动，并与相机的行转移同步。背向反射的激光束被成像在双区光电二极管上，其差分信号用于控制Z轴压电陶瓷以实现快速重新聚焦。读取器配备有在扫描过程中自动运行的自动聚焦保持系统，其中一次扫描使用488纳米激光选择性激发GFP，第二次扫描使用647纳米激光选择性激发PS Five。数据分析采用基于MATLAB编写的对比度计算程序，该程序依据捕获抗体区域内外的荧光强度进行计算。通过分析对比度水平，从而快速分析大量细胞中蛋白质相互作用的程度。也可使用市面上可购得的自动化软件。例如，Olympus 公司提供的 scan R 成像软件已成功用于微图案实验中对比度的评估。我们分析了如图所示的T细胞早期信号通路中CD4与LCK蛋白之间已知的相互作用。荧光标记的LCK明显在CD4抗体包被的区域重新分布。通过添加锌螯合剂破坏锌指结构（该结构是这两种蛋白相互作用的主要位点），会降低LCK微区分布的对比度。总之，微图案技术的主要优势如下：可对局部空间分辨的蛋白质相互作用进行定量分析；此外，还能检测活细胞质膜中的弱相互作用、检测受调控的诱饵-猎物相互作用、分析静息状态，并且该方法适用于高通量分析。

in-vivo-detection-protein-protein-interactions-on-micro-patterned

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

微图案的表面上的蛋白质-蛋白质相互作用的体内检测

本方案描述了如何利用基于FRET的邻近检测技术对蛋白质-蛋白质相互作用进行成像。...

蛋白质-蛋白质相互作用成像 体内

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