Name: 单分子成像核运输 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: 学习单分子显微成像技术用于研究核孔复合体的物质运输机制。该方法利用荧光标记和延时成像可视化单个分子通过核膜的动态过程，为细胞生物学研究提供高分辨率定量数据。

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本项目由鲍灵格林州立大学研究能力提升资助计划支持。

1. 单分子实验细胞系统的制备
<ol>
<li>至少提前一周，从冻存株中解冻，开始培养新的HeLa细胞系 37°C 并放入25 cm2 含5 mL培养基的培养瓶，将细胞置于培养箱中孵育 37°C 在5% CO₂条件下2 将细胞在培养箱中孵育24小时，并至少传代3次，以提供细胞最佳的生长条件。然而，由于细胞生长速率会显著下降，传代次数不应超过20次。HeLa细胞先前经过基因工程改造，使其表达与核膜孔蛋白POM121融合的GFP（绿色荧光蛋白），这对于核膜的精确定位是必要的。</li>
<li>实验前一天，应将用于单分子实验的细胞接种于无菌培养皿中已灭菌的盖玻片上。将盖玻片置于含4.5 g/L葡萄糖、862 mg/L GlutaMAX-I、15 mg/mL酚红、100 U/mL青霉素的DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基，Grand Island，NY）中悬浮培养。 100μg/mL 链霉素和10%新生牛血清。每张盖玻片的培养液体积应为1 mL，并均匀分布于整个表面。随后将含有盖玻片的培养皿置于CO₂培养箱中2 培养箱中孵育，并在实验前静置24小时。为使细胞培养适用于单分子实验，盖玻片上的细胞汇合度不应超过70%，以确保洗涤缓冲液及目标蛋白在进行核转运时具有足够的空间自由度。</li>
<li>实验当天，通过在盖玻片上方添加顶部盖玻片，并使用两条硅脂作为间隔物来构建流室。制备过程中必须确保细胞不会干燥。我们通常倾向于在一张盖玻片上制作两个流室，以便为实验设置两种不同条件。将顶部盖玻片（用金刚刀切割成约6 mm²的小片玻璃盖玻片）倒置于无尘纸（Kimwipe）上。使用10 mL塑料注射器沿盖玻片边缘精细涂抹两条硅脂，注射器前端 tightly 连接移液器吸头，并用Parafilm密封，以控制硅脂液滴的大小。</li>
<li>将覆盖有 HeLa 细胞的载玻片滴干后，用润滑脂作为粘合剂固定在自制的铝制框架——回火装置中，用于将载玻片固定在显微镜样品架上。</li>
<li>然后用尖头镊子夹起带有两条油脂线的盖玻片，翻转后覆盖在细胞包被的载玻片上，形成流动腔室。通过轻轻按压盖玻片的油脂边缘，使其牢固附着。</li>
<li>由于我们在一张细胞包被的载玻片上制作了两个独立的腔室，因此必须进行良好的密封以防止交叉污染。为此，从载玻片顶部到底部，在两个腔室之间涂抹多道硅脂以实现隔离密封。同时，在腔室的外侧边缘也涂抹多道硅脂。</li>
<li>随后向流室中加入DMEM培养基，以防止细胞干燥。通过一小片滤纸从流室出口端吸收液体，从而促进溶液流动。操作时保持手部稳定，可用移液器一手从流室一侧缓慢加入溶液，同时另一手用滤纸从另一侧吸收液体。 </li>
<li>构建完成后，用湿润的棉签擦拭载玻片底部，先用水清洗两次，再用100%乙醇清洗两次。</li>
<li>将载玻片置于显微镜上后，用 2 X 洗涤细胞 25 μL 导入缓冲液（20 mM Hepes，110 mM KOAc，5 mM NaOAc，2 mM MgOAc，1 mM EGTA，pH 7.3）。随后，细胞用 2 X 处理约 2 分钟以实现通透化 25 μL 40 μg/mL 进口缓冲液中的皂苷素并用2 X再次洗涤 25 μL 导入缓冲液（20 mM HEPES，110 mM KOAc，5 mM NaOAc，2 mM MgOAc，1 mM EGTA，pH 7.3），添加1.5%聚乙烯吡咯烷酮（PVP；360 kDa）。可使用明场实时监测透化过程。在皂苷处理后的所有导入缓冲液中均加入PVP，以防止细胞核发生渗透性肿胀。完整的细胞核结合可控的胞质环境，构成了高度简化的转运系统，使我们能够逐步阐明复杂的核转运过程。此前在该系统中开展的群体及单分子实验，已为核转运机制提供了重要见解。</li>
</ol>
2. 核转运实验所需关键蛋白的制备
<ol>
<li>通过常规细菌转化方法，对大肠杆菌（E.coli）特殊菌株（JM109）进行基因工程改造，使其过表达上述目标蛋白的相关基因，并将菌种保存于-80°C。对于NLS-2xGFP，我们使用Invitrogen公司的pTrcHisB载体。取一环或约50 μL表达荧光蛋白或 cargo 蛋白的E. coli冻存菌液，接种至5 mL LB培养基中，加入5 μL氨苄青霉素（U 1000），于37°C、225 rpm条件下有氧振荡培养过夜。</li>
<li>24小时后，取500 μL饱和培养物转入500 mL LB培养基中，在37°C培养箱中继续振荡培养5–6小时，随后加入250 μL IPTG（异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷），再继续孵育5–6小时。此步骤是必要的，因为IPTG是乳糖代谢产物，可激活lac操纵子的转录，其中lacZ基因已被目标基因取代，因此IPTG可用于诱导目标基因的表达。</li>
<li>将培养物在预冷的高速离心机中以12000 rpm离心15分钟，弃去上清液。将菌体沉淀重悬于40 mL CelLytic B溶液中（CelLytic B可实现快速高效的蛋白提取，适用于亲和纯化与分析），溶液体积应按每1克菌体沉淀使用10 mL计算。加入28 μL巯基乙醇以断裂二硫键，加入400 μL苯甲基磺酰氟（PMSF）以抑制蛋白酶活性，防止细胞裂解后目标蛋白被降解。同时加入“蛋白酶抑制剂混合物”（400 μL 0.2 mg/mL 胃蛋白酶抑制剂A、400 μL 0.2 mg/mL 亮抑蛋白酶肽、400 μL 2 mg/mL 胰蛋白酶抑制剂），确保蛋白提取物在分析前不发生降解。随后加入400 μL 1 M咪唑（用于洗脱与层析柱珠粒表面Ni离子结合的标签蛋白）以及1 mM DNase I（用于将不需要的单链和双链DNA降解为5'-磷酸二核苷酸和寡核苷酸片段）。</li>
<li>将混合物置于冰上避光搅拌30分钟，以确保充分反应，然后在预冷离心机中以10000 rpm离心60分钟。收集上清液，准备进行层析。通过在微量离心管中加入Ni-NTA（镍-次氮基三乙酸Superflow，Qiagen公司产品）并以最大转速离心3分钟，随后用裂解缓冲液洗涤，重复离心与洗涤步骤直至混合物无蓝色残留，完成Ni-NTA的加载。将所得混合物在冰上避光缓慢搅拌60分钟。</li>
<li>进行柱层析，共收集12个组分，具体如下：第一组分为上一步中10 mL上清液与Ni-NTA混合后的穿流液；第二组分为10 mL裂解缓冲液（50 mM Na-磷酸盐，300 mM NaCl，20 mM咪唑，pH 8.0）；第三组分为10 mL缓冲液（10 mM咪唑，100 mM NaCl，pH 8.0）；第四组分及后续各组分为0.5 mL洗脱缓冲液（250 mM咪唑，100 mM NaCl，pH 8.0）。</li>
<li>制备SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶，取4 μL组分样品与1 μL 5X SB（300 mM Tris pH 6.8，25% BME，10% SDS，50%甘油）混合配制样品。以Invitrogen公司的100 kb DNA Ladder作为标准分子量标记。上样前将样品于沸水浴中加热5分钟。上样后以120 V恒压电泳60分钟。随后进行染色、脱色，并在专用凝胶干燥仪中80°C干燥2小时。</li>
<li>观察凝胶结果，确定获得最佳条带的组分。根据目标蛋白的分子量，条带应出现在相应位置。选择该组分用于后续MonoQ和Superdex 200（Amersham Pharmacia公司产品）进一步蛋白纯化。</li>
<li>通过Nanosep滤膜（截留分子量10K）在14 rpm条件下离心5分钟，对最浓缩的组分进行浓缩，每次离心后均用洗脱缓冲液洗涤。为进行后续蛋白标记实验，需利用BSA法测定最终蛋白浓度。</li>
<li>NLS-2xGFP的内在绿色荧光由于光稳定性差且与细胞自发荧光光谱重叠，无法用于核转运的单分子成像。因此，我们在室温下用过量的巯基反应性有机染料（Molecular Probes公司的Alexa555或Alexa 647马来酰亚胺）对cargo分子进行标记，反应体系为50 mM磷酸钠、150 mM NaCl，反应前先用TCEP（三(2-羧乙基)膦）还原20分钟。反应结束后用2-巯基乙醇淬灭，并对蛋白溶液进行透析以去除游离染料。</li>
</ol>
3. 单分子显微镜技术
<ol>
<li>我们的显微镜系统配备了一台 Olympus IX81 显微镜，搭载 1.4 数值孔径的 100 倍油浸物镜（UPLSAPO 100XO，Olympus）、35 mW 的 633 nm 氦-氖激光器（Melles Griot）、用于 GFP 的汞灯滤光片组、片上乘法增益电荷耦合器件相机（Cascade 128+，Roper Scientific），以及用于数据采集与处理的 Slidebook 软件包（Intelligent Imaging Innovations）。使用一个光学斩波器（Newport）产生激光激发的开关模式。GFP 荧光由汞灯激发，Alexa647 荧光由 633 nm 激光器激发。绿色和红色荧光发射信号由同一物镜收集，经由二向色镜（Di01-R405/488/561/635-25x36，Semrock）和发射滤光片（NF01-405/488/561/635-25X5.0，Semrock）过滤后，由相同的 CCD 相机成像。</li>
<li>在单分子实验中，我们确保单个货物分子的荧光光漂白时间长于其运输时间。为确定光漂白时间，将0.1 nM的货物分子滴加到玻璃盖玻片上，由于非特异性吸附，30分钟后分子变为静止状态，随后测量其荧光随时间的变化过程。根据目标蛋白的不同，光漂白时间会因能够与马来酰亚胺反应的半胱氨酸数量不同而有所差异，因此应调整光照强度和照明区域，以避免提前发生光漂白，并确保用Alexa 647标记的货物分子的荧光持续时间长于其与核孔复合体（NPCs）相互作用的时间。</li>
<li>在透化细胞的导入实验中，将货物分子与必需的转运辅助因子一同加入。典型的导入货物反应体系包含 1 mM GTP， 0.5 μM 输入蛋白-， 0.5 μM Importin-1, 2 μM Ran 和 1 μM NTF2用于协助运输，10KDa葡聚糖（0.1 nM）用于被动运输。荧光货物浓度为 &gt; 体相实验中为 100 nM，单分子检测中约为 100 pM。在这些浓度下， &gt;预计99%的货物会与Importin 和Importin 形成复合物。通过落射荧光显微镜（若仅需相对速率）或共聚焦荧光显微镜（若需要绝对速率）监测运输速率。</li>
<li>首先，通过宽场落射荧光显微镜确定核膜的位置：开启HBO汞灯，使用一组GFP滤光片拍摄核膜（NE）图像。对垂直于核膜方向的一行或一列像素的强度值进行高斯拟合。特定像素强度范围对应的高斯曲线峰值位置即被视为该行或列的核膜位置。随后，将一系列此类高斯曲线的峰值位置用二次多项式进行拟合，从而得到整幅图像中核膜的路径。</li>
<li>一旦定位到核膜（NE），必须利用633 nm He-Ne激光彻底消除所有自发荧光，直至完全光漂白，通常持续超过60秒即可达到效果。</li>
<li>样品分子应保存在1.5%的PVP溶液中，取25 μL该混合液加入流动室，并通过滤纸芯吸作用使其流经腔室。在核膜定位后，需立即向透化细胞中加入输入货物蛋白，此时必须格外小心，因为任何剧烈动作都可能轻易破坏焦点结构。</li>
<li>一旦加入货物分子，即使用633 nm He-Ne激光照射以记录分子转运轨迹。应启用Newport光学斩波器，频率设为约5 Hz，以避免因激光功率密度过高导致的光漂白，同时使新的未发生光漂白的单分子能够接近核膜（NE）。应使用高速CCD相机（最高可达2500 Hz）采集一系列单分子转位过程的视频。</li>
</ol>
4. 典型结果
正确执行本方案后，我们成功收集了一系列视频，展示了单个货物分子在经去垢剂处理的 HeLa POM121 细胞中与核孔复合体相互作用并发生易位的过程（图1）。我们旨在对稳定表达 GFP-POM121 的海拉细胞中，经皂素透化的细胞内葡聚糖分子通过核孔复合体（NPC）的瞬时转运过程进行成像与追踪。将细胞与低浓度标记葡聚糖分子共同孵育。通过488 nm汞灯激发GFP荧光，将细胞核赤道面调至焦平面，可清晰观察到绿色的环状荧光信号。对GFP标记的核膜（NE）进行长时间曝光，可获得优异的信噪比（SNR），从而精确定位核膜的中平面。此前研究表明，10 kDa的葡聚糖分子可在约2 ms内扩散通过核膜，其空间分辨率为20–40 nm，检测帧速率为500 Hz或1000 Hz。该时空分辨率仅能捕捉到葡聚糖分子通过核孔复合体的一至两步扩散过程，不足以揭示被动扩散更精细的空间信息。为以更高的时空分辨率捕捉葡聚糖分子在核孔复合体内的更多细微扩散步骤，我们进行了两项主要改进：（i）采用更快的检测帧速率（2500 Hz），以捕捉更精细的扩散步骤；（ii）使用更高强度的照明光密度，激发单个分子释放更多光子，从而实现更高的空间分辨率。上述改进使我们能够在633 nm激光照射（光强为100 kW/cm2）下，以12 nm的空间分辨率和400 ms的时间分辨率，成功捕捉到Alexa647标记的葡聚糖分子跨核膜的多个瞬时扩散步骤。
如图1所示，记录了一系列葡聚糖分子典型转运事件的静态图像。通过追踪单个穿行葡聚糖分子的空间轨迹，可区分其通过核膜（NE）扩散的精细步骤。我们发现，约有30%的核膜相互作用事件可明确识别其起始和目的区室。其中，从细胞质向核膜移动的葡聚糖分子有两个去向：在通过核膜扩散后进入细胞核，或在与核膜相互作用后返回细胞质。输出事件也出现类似情况：从细胞核起始的葡聚糖分子在与核膜相互作用后，进入细胞质或重新扩散回细胞核。此类图像序列包含了单个分子相对于核孔复合体（NPC）的空间位置信息，以及分子在核孔复合体中停留时间的时间信息。通过分析葡聚糖分子在核膜区域附近的轨迹，可确定其转运时间、效率和进入频率。本研究中的转运时间可定义为输入或输出时间，即经历输入或输出过程的葡聚糖分子在核孔复合体内的平均停留时间。输入或输出效率定义为完整输入或输出事件数占完整事件与中止事件总数的百分比。输入或输出进入频率指每秒内与核膜发生相互作用的分子数量。
<img src="/files/ftp_upload/2040/2040fig1.jpg" alt="细胞质动态图像；显微镜，葡聚糖，核质运输；时间序列。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 图 1. 葡聚糖分子通过核膜（NE）的典型运输事件的选录视频帧。（A）一个从细胞质到细胞核的运输事件。单个葡聚糖分子（红色斑点）从细胞质出发，与核膜（绿色像素线）相互作用，最终进入细胞核。该事件的轨迹（蓝色线条和空心圆点）被确定并叠加在核膜（黑色线条）上。绿色和红色线条分别表示在细胞质侧和核侧距离核膜 100 nm 的位置。C，细胞质；N，细胞核。比例尺：2 mm。（B）一个细胞质到细胞质的事件。（C）一个细胞核到细胞核的事件。（D）一个细胞核到细胞质的事件。

<ol><li>Ma, J., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Snapshots+of+Three-Dimensional+Distribution+of+Transient+Interactions+in+Nuclear+Pore+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Snapshots of Three-Dimensional Distribution of Transient Interactions in Nuclear Pore Complex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Sarma, A., Goryaynov, A., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Imaging+of+the+Calcium-Regulated+Nuclear+Pore+Permeability%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Imaging of the Calcium-Regulated Nuclear Pore Permeability.</a> , Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Yang, W., Musser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+single+molecules+transiting+through+nuclear+pore+complexes+using+narrow-field+epifluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Visualizing single molecules transiting through nuclear pore complexes using narrow-field epifluorescence microscopy.</a> Methods. 39, 316-328 (2006).</li>
<li>Yang, W., Gelles, J., Musser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+single-molecule+translocation+through+nuclear+pore+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Imaging of single-molecule translocation through nuclear pore complexes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 12887-12892 (2004).</li>
</ol>

未声明利益冲突。

实验过程中必须确保核膜（NE）与单分子之间的正确共定位。尤其当由于标记效率低或光漂白导致信号较弱时，提供高信噪比尤为重要。定位精度受限于背景噪声（来源于离焦荧光、CCD读出噪声、暗电流及其他因素）。

单分子成像技术观察核转运

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

单分子荧光显微技术在过去十年中已被证实对理解生物反应具有重要价值。由于单个分子产生的信号本质上较弱，在细胞深层以高时空分辨率研究分子相互作用仍具挑战性。Yang 等人近期的研究表明，窄场落射荧光显微镜能够实现单分子水平上的核质运输可视化。通过单分子方法，已获得信号依赖性和非依赖性运输货物分子的关键动力学参数，如核转运时间与转运效率。本文介绍了一种方法学方案，其时空分辨率提升至0.4 ms和12 nm。分辨率的提高使我们能够在半完整细胞中捕捉通过核孔复合体（NPC）的瞬时主动运输与被动扩散事件。我们预期该方法将被用于揭示细胞内其他结合与运输事件。

单分子显微镜技术为核转运过程提供了新的见解。

单分子荧光显微镜技术在揭示生物反应机制方面已展现出极大的应用价值，可用于研究……

细胞的核膜含有约2000个核孔复合体，可介导水溶性分子（如RNA、核糖体、某些蛋白质、碳水化合物和信号分子）的转运。通过向通透性细胞中添加标记的货物分子，可利用荧光显微镜观察单个分子穿越核孔的过程。需要采集时间序列图像以确定分子的定位及其时空特征，例如转运时间、入核与出核效率以及进入频率。大家好，我是亚历克斯·奥夫（Alex ov），来自鲍灵格林州立大学生物学系单分子显微镜实验室的博士研究生。我是Asha P Shema，单分子显微镜实验室的硕士研究生。我是Juma，这里单分子显微镜实验室的博士后研究员。今天我们将向您展示一种在活细胞中对核孔复合体介导的核转运进行单分子成像的实验方法。我们实验室利用该方法研究多种分子通过核孔复合体的转位过程。现在让我们开始吧。为了准备核转运实验所需的蛋白质，常规转化表达核转运货物蛋白基因的JM109大肠杆菌，并在LB培养基中培养，然后用IPTG诱导表达。当细胞生长至对数期，光密度值达到0.7至0.8时，在4°C条件下以6,000 × g离心15分钟，弃去上清液，称量沉淀。随后，每克菌体沉淀用10毫升Celtic B缓冲液重悬，以提取适用于亲和纯化和分析的蛋白质。接着，在中底DNA和β-巯基乙醇中加入适量的蛋白酶混合液。将混合物置于冰上避光搅拌30分钟。然后在4°C条件下以25,000 × g离心20分钟。离心后，将上清液转移至新瓶中，以备层析使用。将400 µL镍NTA和丙酮加入四个微量离心管中。在16,000 ×g下离心3分钟。弃去上清液。然后加入 400 µL 裂解洗涤缓冲液。在最后一次洗涤后，重复之前的洗涤步骤三次。将镍-NTA 用裂解缓冲液重悬，并将全部四支试管中的内容物加入含有细胞上清液的瓶子中。在冰上避光容器中缓慢搅拌该混合物 60 分钟，期间持续搅拌。用铝箔包裹层析柱以避免荧光蛋白发生光漂白，从而制备一个 Econo-Pac 层析柱。同时将12个收集管放入层析柱下方的支架中。待混合物搅拌60分钟后，上样10毫升SNA镍NTA混合物，并使其完全流过层析柱。开始收集组分。接下来，加入10毫升裂解洗涤缓冲液，使其完全流过。然后加入10毫升IZO缓冲液，并使其流过。继续收集组分。随后，加入0.5毫升洗脱缓冲液并使其流过，重复加入洗脱缓冲液，直至收集完全部12个组分。为确定哪个组分中目标蛋白浓度最高，取每个组分4微升进行SDS-PAGE凝胶电泳，并用考马斯亮蓝染色。按照标准操作步骤，合并浓度最高的组分，并取500微升加入已用洗脱缓冲液预冲洗过的纳米滤膜（孔径为10千道尔顿）中。以16,000 × g离心5分钟，浓缩蛋白。弃去滤过液，混匀残留的蛋白组分，再向滤膜离心管中加入500微升样品。再次，对所有选定的组分重复上述步骤。接下来，用洗脱缓冲液将浓缩后的蛋白质终体积调至约 50 微升。然后，在用微量移液器轻轻搅拌滤膜表面的

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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