一个慢性双光子薄颅骨窗口技术在体内 Neuroinflammation模型小鼠小胶质细胞成像

在感染 HIV 的成年患者中，神经炎症会干扰正常的突触信号传导，导致神经认知缺陷，包括抽象、语言流利、注意力学习、新信息和记忆困难。HIV 一针一线会诱导炎症分子的分泌，这可以模仿 HIV 患者在这里看到的突触功能障碍。在单核细胞（包括小胶质细胞）中表达GFP的成年小鼠用于使用薄颅骨双光子显微镜研究HIV one tat诱导的神经炎症。

注射 tat 后小胶质细胞的反应可以在体内成像。所得图像显示小胶质细胞突起的缩短和增厚以及吞噬杯状结构的形成以及脑微血管中外周单核细胞的运输。大家好，我是来自罗切斯特大学 Harris Galbard 实验室和神经发育与疾病中心的 Dan Marker。

大家好，我是来自罗切斯特大学神经生物学和解剖学系 Esca 实验室的 EF Trombley。大家好，我是 Shain Luu，同样来自 Albas Lab。今天，我们将向您展示一种使用薄颅骨制备的双光子成像程序。

我们使用该程序来研究慢性神经炎症。那么，让我们开始 这里显示的实验。在包括小胶质细胞在内的单核细胞谱系中使用 OT 表达 GFP。

可以使用不同品系的小鼠来满足特定项目的需求。开始准备用于手术的芬太尼、咪达唑仑 meine 麻醉小鼠。首先，确保动物不再对痛苦的刺激做出反应，例如捏尾巴。

将动物放在加热垫上，以防止麻醉后体温过低。然后用保护性眼药膏覆盖动物的眼睛，以保持眼睛湿润。所有手术器械都应经过高压灭菌或用玻璃珠消毒器消毒，将器械浸泡在 70% 乙醇中进一步消毒。

用剪刀去除动物头皮上的毛发，然后使用 10% 聚维酮碘溶液和 70% 乙醇对该区域进行消毒。开始手术时，用小剪刀在头皮上做一个中线切口，从 4 到 5 毫米开始，沿着头骨向上推进到眼睛前部。这个切口应该足够长，这样皮肤就不会干扰在双光子成像期间稳定小鼠头部的板的粘合。

接下来，将 100% 乙醇涂在无菌棉签上，以干燥颅骨顶部的膜。用细镊子把它们刮掉。如果不去除膜，头板附着将不稳定。

在解剖范围下，确定要细化的区域。避免直接位于颅缝合线上的感兴趣区域，因为颅骨在这些区域不太稳定，下面的大血管和脑膜会干扰发送到感兴趣区域的观察窗的成像。然后，再次使用棉签，使用 10% 的氯化铁溶液再次尝试颅骨。

在头板下方的观察窗边缘放置一层薄薄的永久粘合 9 10 胶水。然后将板放在动物头骨上感兴趣的区域上，轻轻按压以粘合胶水。使用注射器在观察窗的边缘周围涂抹少量丙烯酸。

最后，将少量 Tite 4 54 涂抹在观察窗的边缘。防止泄漏。将头板拧到动物支架上，并在解剖显微镜下检查稳定性 用一对镊子轻轻探测，颅骨相对于头板不应有移动。

在观察窗上滴一滴盐水，以确保没有泄漏，为稀释做准备。使用无菌棉签和压缩空气的组合擦干颅骨。使用 IRF 0 0 7 钻头在微型到二钻头中稀释头骨。

转速为 4， 000 RPM。非常轻柔地开始减薄直径为 2 到 2.5 毫米的圆形区域。仅使用几乎平行于颅骨的轻微扫动动作。

不要使用直接向下的压力。每 20 到 30 秒停止钻孔一次，以使用压缩空气去除骨粉。钻孔中的这些中断使颅骨冷却，因此不会对下面的脑组织造成热引起的损伤。

随着钻孔的进行，请注意向称为 Diplo 的更湿润的多刺骨层的过渡。到达此层后，请格外小心地进行钻孔。偶尔将盐水放在薄区域并在解剖镜下观察来检查颅骨的薄度。

盐水将进一步实现散热。随着颅骨变薄，可以看到较小的脉管系统。使用牙科微刀片在盐水下实现最终稀释。

微刀片提供了有关颅骨稳定性的更多触觉反馈。这允许比单独使用钻头更薄的准备工作。成像的最佳颅骨厚度为 10 至 30 微米。

整个减薄过程通常需要 15 到 30 分钟。在落射荧光下多次检查颅骨的薄度，同时制作薄的颅骨窗口。可见小胶质细胞和脉管系统的清晰度和深度可以很好地指示窗口何时准备好进行成像。

窗口准备好后，使用直径为 1 毫米的玻璃移液器将一小滴 Cy 丙烯酸胶水滴在较薄的颅骨区域，然后小心地将一块盖玻片放到上面。然后轻轻按压头骨以挤出多余的胶水，避免在头骨和盖玻片之间形成气泡，这可能会阻碍视野。干燥后，使用微刀片小心地去除盖玻片顶部残留的任何胶水，为双光子成像做准备。

用盐水覆盖薄的颅骨皮质窗，并在 epi 荧光下定位感兴趣的区域。要对该区域进行后续成像，请使用摄影相机拍摄照片以进行成像。这里显示的是一台定制的双照相显微镜，其中钛蓝宝石激光器调谐到 920 纳米。

通过在全场检测模式下使用光电倍增管或 PMT 和 5 81 80 发射滤光片来检测荧光。在整个成像过程中使用 20 x 水浸镜头。将物镜激光功率的最大输出设置为 50 到 65 毫瓦之间。

接下来，选择皮质层一层或皮层二，在剥离表面下方最多 150 微米处选择感兴趣区域。为了便于重新成像，请在 1 x 和 2 x 和 3 x 数码变焦处拍摄相同的视野。血管可以作为标志，在随后的成像过程中轻松找到相同的视野。

在 3 倍变焦下，采集多个 Zack，每个 Zacks 有 80 到 90 个 Z 步长，每 5 分钟有一个 0.69 微米的步长，持续长达 30 分钟。这使得在采集 Zacks 之间随着时间的推移对小胶质细胞形态和行为进行良好采样，验证盐水水平和麻醉深度。如有必要，可以在手术过程中给予麻醉鸡尾酒原始剂量三分之一的加强剂量，以防止在注射前几天注射期间针牙沉积到注射器和针头上。

通过抽出施胶溶液直到它充满针头和注射器，对 35 号针头和 10 微升微量注射器的内衬进行筒仓化。让溶液在室温下静置 5 分钟，然后从注射器中清空溶液，取下柱塞，让注射器和针头完全干燥。最后，用去离子水彻底清洗注射器和针头。

一旦孤立起来，注射器和针头可以使用六个月以上，然后才需要重新编码。在注射当天，将一小滴 TAT 溶液滴在孤立的载玻片上。使用硅化移液器吸头，从该液滴中将所需量的溶液加载到微量注射器中。

使用钻头进行直径为 0.5 毫米的小开颅手术，可以是 3 毫米的嘴部或薄颅骨皮质窗的外侧，在那里已经获得了两个光子图像。为此，请小心地减薄头骨。然后用一把锋利的镊子去除薄薄的骨头层。

使用微型机械手将 35 号针头和注射器与开颅手术对齐。然后小心地将针头推进到果皮表面以下 700 至 900 微米的深度。使用微处理器控制的注射泵以每分钟 80 纳升的速度输送 3 微升。

该图显示了在植入薄颅骨皮质窗后，在果皮表面以下约 50 微米处，通过双光子成像可视化 GFP 标记的小胶质细胞。在第 0 天、植入薄颅骨皮质窗后 15 至 30 分钟以及 7 天和 17 天后拍摄的单个两个光子切片表明，在没有炎症损伤的情况下，窗口保持清晰，而小胶质细胞保持激活。这突出了这种方法在研究免疫效应细胞和其他神经细胞类型之间的正常和炎症相互作用方面的实用性。

在体内，在注射 HIV 神经毒素 TAT 后 6 小时和 24 小时拍摄的 Z 投影显示活化的小胶质细胞的显着形态变化。进一步证明了我们在急性和慢性神经炎症模型中实时研究小胶质细胞形态变化的能力。我们刚刚向您展示了如何准备一个薄的颅骨窗口并使用它来研究神经炎症 当进行此程序时。

重要的是要记住在照料头骨时要花点时间，以防止准备工作本身造成任何损害。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。