一种用于慢性双光子成像的薄颅窗技术 体内 神经炎症模型中鼠类小胶质细胞的成像

在感染 HIV 的成年患者中，神经炎症会干扰正常的突触信号传导，导致神经认知功能障碍，表现为抽象思维、语言流畅性、注意力、学习新信息和记忆等方面的困难。HIV 的 Tat 蛋白可诱导炎症分子的分泌，从而模拟 HIV 患者中观察到的突触功能障碍。本研究使用在单核细胞（包括小胶质细胞）中表达 GFP 的成年小鼠，通过颅骨变薄的双光子显微镜技术来研究 HIV Tat 蛋白诱导的神经炎症。

通过注射 tat 后的小胶质细胞反应可以在体内进行成像。所得图像显示小胶质细胞突起缩短增粗，形成类似吞噬杯的结构，以及外周单核细胞在脑微血管中的迁移。大家好，我是来自罗切斯特大学哈里斯·加尔巴德实验室及神经发育与疾病研究中心的 Dan Marker。

大家好，我是来自罗切斯特大学神经生物学与解剖学系Esca实验室的EF Trombley。大家好，我是Shain Luu，也来自Albas实验室。今天我们将向您展示一种使用薄颅骨制备方法进行双光子成像的实验操作流程。

我们采用此方法研究慢性神经炎症。现在开始本实验。本实验使用在包括小胶质细胞在内的单核细胞系中表达GFP的OT小鼠。

可使用不同品系的小鼠以满足特定项目的需求。开始准备用于手术的芬太尼、咪达唑仑混合麻醉小鼠。首先，确保动物对尾部夹捏等疼痛刺激不再有反应。

将动物放置在加热垫上，以防止麻醉后低体温。然后用保护性眼膏覆盖动物的眼睛，以保持眼睛湿润。所有手术器械应经过高压灭菌或使用玻璃珠灭菌器进行灭菌，并通过浸泡在70%乙醇中进一步消毒器械。

使用剪刀去除动物头皮上的毛发，然后用 10% 聚维酮碘溶液和 70% 乙醇对区域进行消毒。用小剪刀开始手术，在头皮上做一正中切口，从颅骨后方 4 至 5 毫米处开始，向前延伸至眼睛前方。该切口应足够长，以确保皮肤不会干扰在双光子成像过程中用于固定小鼠头部的固定板的粘贴。

接着，用无水乙醇润湿无菌棉签，擦干颅骨顶部的膜组织，然后用精细镊子将其刮除。如果未清除这些膜组织，头固定板的安装将不稳固。

在解剖显微镜下，确定需要减薄的区域。应避免直接位于颅缝上方的区域，因为这些部位的颅骨稳定性较差，且下方较大的血管和脑膜会干扰成像，影响目标区域在观察窗口中的显示效果。然后，再次使用棉签，以10%的氯化铁溶液处理颅骨。

在头板下方的观察窗边缘周围均匀涂抹一层薄薄的Perma Bond九一〇胶。然后将头板轻轻按压在动物颅骨的目标区域上，以使胶水粘合牢固。使用注射器在观察窗边缘周围施加少量丙烯酸树脂。

最后，在观察窗边缘涂抹少量 Tite 4 54 以防止泄漏。将头板拧紧至动物固定器上，并在解剖显微镜下检查其稳定性；用镊子轻轻探触，颅骨相对于头板应无任何移动。

在观察窗处滴加一滴生理盐水，以确保在进行颅骨变薄前无渗漏。使用无菌棉签和压缩空气相结合的方式干燥颅骨。使用微钻上的红外线 0 0 7 钻头将颅骨变薄。

在 4,000 RPM 下，非常轻柔地开始减薄直径为 2 至 2.5 毫米的圆形区域。仅使用轻微的扫动动作，动作方向几乎与颅骨平行。

不要施加直接向下的压力。每钻孔20至30秒后暂停一次，使用压缩空气清除骨屑。钻孔过程中的这些间歇有助于颅骨冷却，从而避免因热量导致 underlying 脑组织受损。

随着钻孔的进行，注意观察向较湿润的棘状骨层（称为Diplo层）的转变。一旦到达此层，需对钻头格外小心。可通过在较薄区域滴加生理盐水，并在解剖显微镜下观察，以定期检查颅骨的厚度。

生理盐水将进一步促进散热。随着颅骨变薄，更小的血管结构会变得可见。在生理盐水环境下使用牙科微刀完成最终的薄化操作。

微型刀片能够提供关于颅骨稳定性的更多触觉反馈，从而实现比单独使用钻头更薄的制备。成像的最佳颅骨厚度为10至30微米。

整个减薄过程通常需要15到30分钟。在制作薄颅窗时，需多次在落射荧光下检查颅骨的薄度。可见的小胶质细胞和血管结构的清晰度与成像深度可良好地指示颅窗何时已准备好进行成像。

待窗口制备完成后，使用直径为1毫米的玻璃移液管将少量Cy丙烯酸胶滴加至颅骨较薄区域，并小心地将一片盖玻片轻轻覆盖其上。然后轻压盖玻片，使多余的胶水挤出，注意避免在盖玻片与颅骨之间产生气泡，以免影响观察视野。待胶水完全干燥后，使用微型刀片仔细去除残留在盖玻片表面的胶水，为双光子成像做好准备。

用生理盐水覆盖颅骨薄层皮层窗，并在落射荧光下定位目标区域。为便于后续成像，使用相机拍摄一张图像。此处展示的是定制的双光子显微镜，其钛宝石激光器调谐至 920 纳米。

使用光电倍增管（PMT）在全视野检测模式下检测荧光，并采用581/80发射滤光片。成像过程中使用20倍水浸物镜。将物镜的激光功率最大输出设置在50至65毫瓦之间。

接下来，选择一个感兴趣的区域，即果皮表面下方深达150微米的皮层第一层或第二层。为了便于重新成像，可在1倍、2倍和3倍数字放大下对同一视野拍摄图像。在后续成像过程中，血管可作为解剖标志，帮助快速定位相同的视野。

在3倍放大倍数下，每次以80至90个Z轴步进采集多个Zacks，每步0.69微米，每隔5分钟采集一次，持续最长30分钟。这可在Zacks采集间隔期间实现对小胶质细胞形态和行为随时间变化的良好采样。在采集过程中，需验证生理盐水水平及麻醉深度。如有必要，可在操作期间给予原始麻醉混合剂剂量三分之一的追加剂量，以防止注射前数天内麻醉剂在注射器和针头表面沉积。

通过抽吸定径溶液直至其充满35号针头和10微升微量注射器的内腔，对二者进行内壁硅化处理。室温下静置五分钟，然后将注射器中的溶液排空，取出活塞，并让注射器和针头完全干燥。最后，用去离子水彻底清洗注射器和针头。

经过硅化处理后，注射器和针头可在需要重新处理前使用超过六个月。在注射当天，将一滴TAT溶液置于硅化玻璃载片上。使用硅化移液枪头，从此液滴中吸取所需体积的溶液，注入微量注射器中。

使用钻头，在双光子成像所获得的薄颅骨皮层窗前方或外侧 3 毫米处，进行直径为 0.5 毫米的小型颅骨开窗。操作时，先小心磨薄颅骨，然后用锋利的镊子去除薄层骨组织。

使用显微操作器将选定的35号针头和注射器与颅骨开孔对齐。然后小心地将针头推进至剥离表面以下700至900微米的深度。使用微处理器控制的注射泵，以每分钟80纳升的速度注入3微升液体。

该图显示了在植入薄颅骨皮层窗后，通过双光子成像观察到的GFP标记的小胶质细胞，成像深度位于剥离表面下方约50微米处。在植入薄颅骨皮层窗后的第0天（即植入后15至30分钟）、第7天以及第17天所获取的单层双光子图像表明，窗口保持清晰，且在无炎症刺激的情况下小胶质细胞仍处于激活状态。这凸显了该方法在研究免疫效应细胞与其他神经细胞类型之间正常及炎症状态下相互作用方面的实用性。

体内实验显示，在注射 HIV 神经毒素 TAT 后 6 小时和 24 小时拍摄的 Z 轴投影图像中，小胶质细胞呈现出显著的活化形态学变化。这进一步证明了我们能够在急性和慢性神经炎症模型中实时研究小胶质细胞的形态学改变。刚才我们向您展示了如何制备薄颅窗并利用它来研究神经炎症。在进行该操作时，请注意以下事项。

在处理颅骨时，务必记住要耐心操作，以避免因制备过程本身造成任何损伤。就到这里。感谢观看，祝您的实验顺利成功。