利用荧光标记的HIV克隆与活细胞共聚焦显微镜观察HIV的细胞间传递

该实验利用活细胞成像技术，可视化表达HIV的jerk CAT T细胞与未感染的原代T细胞之间通过病毒突触传递GFP标记的HIV的过程。细胞间传递实验首先用HIV gag IG FP转染jerk CAT T细胞，该质粒为一种具有感染性的HIV-1荧光克隆。转染后表达HIV gag.IG FP的jerk CAT细胞与C-M-T-M-R标记的未感染原代T细胞混合，并接种至成像培养皿中，从而可观察GFP标记的HIV通过病毒突触的转移过程。

利用图像分析软件对获得的数据进行分析，以揭示HIV通过T细胞病毒学突触转移的详细过程。大家好，我叫Benjamin Dale，来自西奈山医学院医学系Ben Chen实验室。我是Greg McNerney，来自加州大学戴维斯医学中心美国国家科学基金会生物光子学中心Thomas Huser博士的实验室。

我是Deanna Thompson，同样来自Thomas Huser博士的实验室。今天我们将向您展示一种利用活细胞共聚焦显微镜观察细胞间HIV-1转移的实验方法。在本实验中，Jurkat细胞被转染了一种具有感染性的HIV分子克隆，仅限经培训的实验室人员在认证的生物安全实验室中操作。

二级以上或生物安全三级组织培养室可进行本视频所示的实验操作。在成像设施中操作具有感染性的HIV必须获得当地机构生物安全办公室的批准。用于作为供体细胞的Jurkat细胞应维持在每毫升2×10⁵至8×10⁵个细胞的浓度范围内。

在Jerk猫细胞培养中，当细胞浓度超过每毫升8×10⁵个细胞时，会导致转导效率下降。实验开始时，使用Amax核酸转染法（具体操作详见随附的书面实验方案），将5×10⁶个Jerk猫细胞与病毒质粒HIV gag IGFP共转染，并让细胞过夜恢复。外周血单个核细胞通过Ficoll密度梯度离心法从人全血的血沉棕黄层中分离纯化获得。

通过使用CD4阳性T细胞分离试剂盒进行负向选择，从外周血单个核细胞中纯化出原代CD4阳性T细胞。将负向选择得到的CD4阳性T细胞从磁性柱中收集，并在含有10% FPS及10单位/毫升重组人IL-2的RPMI培养基中进行培养。也可将分离得到的原代CD4阳性T细胞分装，并借助冻存管进行冷冻保存。将冻存管置于-70°C冰箱中，至少冷冻3至4小时。

随后将细胞转移至液氮中进行长期保存。在震颤头细胞转染完成且目标原代CD4阳性T细胞已被分离后，于转染次日进行细胞的清洗及标记。目前，这些震颤头细胞已表达出具有感染性的荧光HIV构建体。

处理传染性样本时，我们穿戴前开式实验服和两副手套。通过在Fial高密度培养基上离心，去除转染细胞中的细胞碎片。首先，在15毫升锥形管底部加入1.5毫升Fial Pack培养基。

然后用五毫升的PMI培养基，将转染的jerk hat细胞轻轻覆盖在梯度材料上。此时，转染的jerk hat细胞已能够产生具有感染性的HIV。因此，所有接触过表达HIV细胞的移液器吸头都必须用10%的次氯酸钠溶液进行消毒。

在将离心管丢弃至生物安全柜内的容器之前，先盖上管盖，并用70%乙醇溶液喷洒管外壁，然后用干燥的无尘纸擦拭。在室温下以400 ×g离心20分钟，离心时关闭刹车。离心结束后，使用移液器小心地从细胞与培养基界面处吸取细胞，转移至一个新的15毫升锥形管中。用我们的PMI培养基将细胞稀释至总体积15毫升，并在300 ×g下离心10分钟。

在室温下，将沉淀重悬于 3 毫升 jerk hat 培养基中，并转移至六孔板的一个 2 厘米孔内。将六孔板置于组织培养孵箱中，直至次日使用。在同一天晚上，标记用作靶细胞的初始 CD4 阳性 T 细胞，以便将其与供体细胞区分开。首先，通过以 400 ×g 离心 10 分钟，沉淀六份初始 CD4 阳性 T 细胞中的四份，每份为 10⁶ 个细胞。

然后用 5 毫升 PBS 重悬细胞并洗涤。在 2 毫升 PBS 中重悬细胞，加入细胞示踪染料橙（cell tracker orange），使其终浓度为 1.5 µM，并在 37 °C 下孵育数分钟。细胞孵育结束后，加入 8 毫升完全 ChicA 培养基，在 400 ×g 离心 10 分钟。

将细胞重悬于3 mL完全培养基中，培养基中添加10单位/毫升的IL-2，置于组织培养孵箱中过夜。过夜孵育后，供体细胞和靶细胞即可用于细胞间转移实验。在进行细胞间转移实验前，需准备好成像室，以缓冲室内温度波动对平台的影响。

为了屏蔽背景环境光，将一个大型黑色遮光罩覆盖在整个显微镜加热装置上，在系统周围形成一个隔热的空气层。通过使用带有T型热电偶探头的恒温加热器，并将探头置于样品附近以实现温度反馈，成像室可维持在稳定的37摄氏度。在安装样品前，需预先加热30分钟。

利用倒置光学显微镜结合转盘共聚焦成像技术，可获得HIV在细胞间转移的三维共聚焦图像。所有硬件及图像采集过程（包括Z轴步进装置）均由Andor IQ 1.8版本软件控制。成像通过CSU-10转盘共聚焦单元实现，该单元同时使用超过800个共聚焦光点，显著提高扫描速度，以匹配其高速性能。CSU-10配备高灵敏度电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）相机，可实现快速弱光成像，从而显著降低光漂白和光毒性。

荧光光源为多波长氩氪离子气体激光器。使用And/Or Oko光学可调滤光器（AOTF）来选择所需波长，此处为488纳米和568纳米，同时通过控制激光功率以进一步减少光漂白，延长成像时间。当相机未采集图像时，AOTF会在每次15至30毫秒的曝光后快速关闭激光，避免在图像从EMCCD相机传输至计算机期间产生不必要的曝光。

使用405、488、568、647四波段二向色镜将激光光源引入转盘系统，荧光发射光通过560纳米长通二向色镜结合图像分光器按波长分离。绿色通道采用525/50纳米带通滤光片过滤，红色通道采用609/54纳米带通滤光片过滤。两个通道并排投射到EMCCD相机上。

在成像腔室预热的同时，准备细胞间转移实验所需的细胞。使用血细胞计数板对表达 HIV gag IGFP 的细胞进行计数。将血细胞计数板置于培养皿中，以避免其直接暴露于表达病毒的细胞。

用不含二氧化碳的培养基洗涤细胞，并将细胞重悬于活细胞成像培养基中，浓度为每毫升1×10⁷至3×10⁷个细胞。使用不含二氧化碳的培养基可避免对二氧化碳培养环境的需求，适用于成像实验。

细胞还需进行计数、洗涤，并将标记的原代 CD4 阳性 T 细胞重悬，操作方式与前述 Jurkat T 细胞相同。接下来，启动细胞间转移：将 20 µL HIV gag-I-GFP 转染的 Jurkat T 细胞与 40 µL 标记的原代 CD4 阳性 T 细胞混合，取 50 µL 加入经组织培养处理的透气型 EBD 微室中，用塞子密封微室，并用封口膜包裹塞子与微室接口处以固定塞子。

使用浸有70%乙醇的化学清洁擦拭布擦拭成像室，并在生物安全柜中短暂晾干。将密封的成像室置于密闭容器中运输，以避免意外暴露。若在向IBD成像室加样细胞后运输过程中成像室意外掉落，请立即将装置安装到显微镜上。

使用60倍、数值孔径（NA）为1.42的油浸物镜拍摄细胞对的图像，因为高数值孔径可显著提高分辨率，从而最大限度地加快每组三维图像堆栈的采集速度。将EM CD相机的记录区域裁剪至细胞对的邻近区域。此外，在此条件下，将Z轴步进设置为0.45至0.75微米之间的较大值，也有助于加快图像采集速度。

图像以20至60分钟的时间间隔持续记录。对同一样本位点进行重复成像时，若采集得当，可延长至六小时且光漂白程度极低。每个数据段包含数万张图像，总数据量可能达到5至20吉字节。

为了便于大文件的传输和分析，每个文件将被分割并导出为一吉字节（GB）的TIFF图像文件片段。要分析所获取的图像，可使用多种图像分析软件程序之一。有关图像分析的详细信息，包括荧光强度漂白校正以及gag puncta的自动和手动追踪，请参阅随附的书面实验方案。

混合后10至15分钟内，可观察到表达HIV gag IGFP的jerk cat细胞黏附于原代CD4阳性T细胞的成像。通过这些结合体，可评估gag斑点在感染细胞及靶细胞中的运动情况。在突触形成后30分钟至3小时内，可观察到gag IGFP斑点向已被细胞示踪剂标记的靶细胞内移动。

我们刚刚向您展示了如何可视化HIV在T细胞之间的细胞间转移。在进行这些操作时，处理暴露于表达HIV细胞的样本时，务必严格遵守生物安全二级加强级或生物安全三级的全部防护措施。同时，请记得使用状态良好的JCA细胞和无内毒素的DNA，以优化转染效果。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。