Name: 可视化的细胞与细胞转移的艾滋病毒，艾滋病毒和现场共聚焦显微镜的荧光克隆 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: 了解利用活细胞共聚焦显微镜可视化HIV在T细胞间通过病毒学突触转移的方法。本实验使用荧光标记的HIV分子克隆和原代CD4阳性T细胞，为研究HIV发病机制提供可靠的实时成像技术。

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本综述得到了美国国立卫生研究院基金（AI074420-02）、Burroughs Wellcome 研究员奖、B.K.C. 获得的 Hirschl 职业科学家奖、美国国家科学基金会生物光子学科学与技术中心（合作协议编号 PHY012099）以及 T.H. 获得的加州大学戴维斯分校健康系统研究奖（UCD CTSC NCRR UL1 RR024146）的资助。

该方法已用于Hübner等人在《科学》杂志323卷1743-1747页（2009年）发表的研究中，详见<a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/323/5922/1743">Hübner et al. Science 323: 1743-1747 (2009)</a>。
1. 概述
HIV 的细胞间传播最初是利用感染 HIV 的 Jurkat 细胞作为供体细胞，以及初级 CD4+ T 淋巴细胞作为受体细胞来描述的1,2,3。在这些研究中，通过抗体染色在固定细胞中检测病毒。为了在活细胞中追踪病毒的细胞间转移，我们采用了一种名为 HIV Gag-iGFP 的重组型感染性分子克隆4。该克隆在 Gag 蛋白的 MA 和 CA 结构域之间内部插入了绿色荧光蛋白（GFP）。这种 HIV 分子克隆无需辅助病毒即可保持感染性。由该克隆产生的病毒颗粒在化学计量上负载有绿色荧光蛋白，从而提供强烈的荧光信号，用于监测病毒的组装及细胞间的转移。当与惰性的细胞追踪荧光染料联合使用时，可区分受体细胞与输入的供体细胞，从而实现从感染的 T 细胞向未感染的 T 细胞转移 HIV 的可视化5。随后可在活细胞培养于密封的、透气成像腔室中时，实时观察病毒突触的形成以及病毒从一个细胞向另一个细胞的转移过程。
（第1天）
2. HIV Gag-iGFP 转染的 Jurkat T 细胞的制备
<ol>
	<li>通过将人 CD4+ T 细胞系 Jurkat（ATCC，Manassas，VA）维持在 Jurkat 培养基（RPMI 1640、10% 胎牛血清、100 单位/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素）中，细胞浓度控制在 2 × 105 至 8 × 105 个细胞/mL，以妥善培养细胞。成功关键：若 Jurkat 细胞培养浓度超过 8 × 105 个细胞/mL，将导致转染效率下降。 
注意：如下所述，将 HIV Gag-iGFP 前病毒 DNA 转染至 T 细胞后，将产生具有复制能力的人类免疫缺陷病毒。因此，所有操作必须仅由经过培训的实验室人员在经认证的生物安全二级增强级或生物安全三级（BL2+/BL3）细胞培养室中进行。在成像设施中操作具有感染性的 HIV 必须获得当地机构生物安全办公室的批准。</li>
	<li>使用 Amaxa 核转染法（Lonza，Walkersville，MD）将病毒质粒 HIV Gag-iGFP 转染至 Jurkat 细胞中。取 5 × 106 个细胞，在 150 × g 条件下离心 10 分钟形成沉淀。吸除上清液，并用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。再次离心后，将细胞沉淀重悬于 97 μL 预热的、含制造商补充剂的核转染溶液 V 中。向细胞悬液中加入 3 μL 无内毒素的 HIV Gag-iGFP 质粒（1 μg/μL），轻轻混匀。将细胞悬液转移至电转杯中，使用程序 S-18 进行核转染。立即把细胞转移至 3 mL 预热的不含抗生素的 Jurkat 培养基中。</li>
	<li>为制备用于病毒突触研究的 CD4+ 靶细胞，我们采用标准 Ficoll-Paque（GE Healthcare，Uppsala，瑞典）方法从血沉棕黄层中分离人外周血单个核细胞。随后使用磁珠分离试剂盒（Miltenyi Biotec，Auburn，CA）对 CD4+ T 细胞进行阴性筛选。这些细胞可分装为每管 5 × 106 个细胞/500 μL 冻存液（90% 胎牛血清/10% DMSO），在液氮中进行深低温保存。解冻后的原代 CD4+ T 细胞在含 10 单位/mL IL-2 的 RPMI 10% FBS 培养基中培养。</li>
</ol>
（第2天）
3. 从转染了 HIV Gag-iGFP 的 Jurkat 细胞中回收活细胞及用荧光染料标记靶细胞
<ol>
	<li>转染后的Jurkat细胞在培养箱中过夜恢复。然后通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心去除细胞碎片。在15 mL锥形管底部加入1.5 mL Ficoll-Paque。轻柔地将5 mL RPMI培养基中的转染Jurkat细胞叠加于该密度梯度液上方。室温下以400 × g离心20分钟（关闭刹车）。使用移液器小心收集培养基与Ficoll界面处的细胞，转移至新的15 mL锥形管中。用RPMI培养基稀释细胞至总体积15 mL，以300 × g离心10分钟。将细胞沉淀重悬于3 mL Jurkat培养基中，接种于2 cm孔板（6孔板）中，并将细胞放回组织培养箱继续培养。</li>
	<li>为了在细胞间转移实验中区分靶细胞与供体细胞，我们预先用荧光染料标记CD4+靶细胞。原代CD4+ T细胞在使用前一晚进行标记。我们使用CellTracker和CellTrace系列染料（Invitrogen，Carlsbad，CA）对T细胞进行标记，效果良好。尽管染料浓度和孵育时间需根据具体染料和细胞类型优化，以下为一个代表性操作流程：将4 × 106个原代CD4+ T细胞在400 × g下离心10分钟收集细胞沉淀。用5 mL PBS洗涤一次，重悬于2 mL PBS中。加入CellTracker Orange（CMTMR，Invitrogen，Carlsbad，CA），终浓度为1.5 μM，在37°C孵育20分钟。加入8 mL完全Jurkat培养基，400 × g离心10分钟。将细胞沉淀重悬于3 mL含10单位/mL IL-2的完全培养基中，放入组织培养箱过夜培养。</li>
</ol>
（第3天）
4. 使用活细胞成像技术监测HIV Gag-iGFP的细胞间转移
我们常规使用转染后48小时的HIV Gag-iGFP转染Jurkat细胞。然而，我们也成功使用过转染后最早24小时以及最晚72小时的细胞。
<ol>
	<li>转染后约48小时，计数表达HIV Gag-iGFP的Jurkat细胞，用不含CO2的培养基（Invitrogen，Carlsbad，CA）洗涤，并重悬于活细胞成像培养基（不含CO2的培养基，10% 胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素，10 U/mL IL-2）中，细胞浓度为1-3 × 107 个细胞/mL。</li>
	<li>以类似方法，将标记的原代CD4+ T细胞用活细胞成像培养基洗涤并重悬，细胞浓度为1-3 × 107 个细胞/mL。</li>
	<li>按1:2或1:3的比例混合HIV Gag-iGFP转染的Jurkat细胞与原代CD4+ T细胞，并将混合液加入经组织培养处理、具有气体通透性的微腔室（Ibidi，Verona，WI）中。例如，将20 μL HIV Gag-iGFP转染的Jurkat细胞与40 μL标记的原代CD4+ T细胞混合。取50 μL该混合液加入Ibidi腔室中，并用封塞密封腔室。用封口膜包裹封塞与Ibidi腔室的接口处以固定封塞。</li>
</ol>
5. 显微镜平台的注意事项：转盘共聚焦成像
在将细胞接种到Ibidi成像腔后，我们立即将该装置安装到倒置光学显微镜（iX71 Olympus，美国宾夕法尼亚州森特瓦利）上。Ibidi成像腔仅可由经过BL2+培训并穿戴适当防护装备的实验室人员转移至显微镜。尽管活细胞成像通常使用昂贵的培养箱来维持稳定的37°C环境，但我们采用了一种简单且经济的恒温加热器（ASI 400，Nevtek，美国弗吉尼亚州威廉斯维尔），并结合安装在样品附近的T型热电偶探头，以实现准确的温度反馈控制。我们发现，使用不含CO2的培养基可在避免使用CO2培养箱的同时，维持细胞的高存活率。为了缓冲环境温度波动对平台的影响，并屏蔽背景环境光，整个显微镜与加热装置被覆盖上一个大型黑色遮光罩，从而在系统周围形成一个隔热的空气层。这种方法显著减少了温度波动以及由此引起的样品漂移，但在安装样品前需预先加热30分钟。
6. 数据采集、传输与图像处理
使用60倍、数值孔径（NA）为1.42的油浸物镜（UPlanApo N，Olympus）进行成像，因为高数值孔径可显著提高分辨率。为了生成三维共聚焦图像，采用转盘式共聚焦单元（CSU-10，Yokagawa，日本）进行扫描，该系统同时使用&gt;800个共聚焦光点，从而显著提高扫描速度。为匹配其高速性能，CSU-10配备了一台高灵敏度的电子倍增电荷耦合器件（EMCCD，iXon+ 897，Andor Technologies，爱尔兰）相机，实现快速、低光照成像，从而减少光漂白和光毒性。荧光光源为多波长氩氪离子气体激光器（Innova 70C，Coherent，Santa Clara），通过声光可调滤波器（AOTF，Andor Technologies）选择所需波长（488 nm）以及在显微镜物镜前测量的激光功率（&lt;1 mW）。为进一步减少光漂白并延长总成像时间，AOTF可在相机不工作时（10–20 ms）快速（微秒级）关闭激光束，此时新采集的图像正从CCD（曝光时间15–30 ms）传输至计算机。激光光束通过一个405/488/568/647四频带二向色镜（Semrock，Rochester，NY）耦合进入转盘共聚焦系统。荧光发射光通过安装在EMCCD相机与共聚焦转盘单元之间的滤光轮（Ludl Electronic Products，Hawthorne，NY）中的525/50带通滤光片（Semrock）进行过滤。所有硬件及图像采集过程，包括Z轴载物台（Mad City Labs，Madison，WI），均由Andor iQ v1.8软件控制。为在约1.2–1.9秒内最大化三维图像堆栈的采集速度，我们将EMCCD相机的记录区域裁剪至细胞对的局部区域。此外，为换取一定的Z轴信息，可采用较大的Z步进（0.45–0.75 μm）以加快采集速度。在此条件下成像可持续长达6小时，采用连续20–60分钟的片段采集，光漂白程度极低。总体而言，由于采集了数万张图像，每个数据片段通常占用5–20 GB的存储空间。为便于大文件的传输与分析，需使用Andor iQ v1.8软件将每次采集的数据集分割并导出为1 GB大小的TIFF图像文件片段。此后，可利用多种优秀的图像分析软件进行后续处理，例如Metamorph、Volocity和ImageJ（我们推荐其衍生版本Fiji）。
当需要同时追踪两种荧光标记时，我们通过使用“分屏模式”在不降低采集速度的情况下同步记录两种信号。两种标记同时由两条不同的ArKr激光谱线激发（通常为488 nm和568 nm）。在EMCCD相机前直接安装一个图像分光器（OptoSplit II，Cairn，Kent，UK），用于分离两个不同的图像。每个图像随后通过荧光滤光片（Semrock）独立过滤，并同时并排投射到相机上，从而形成“分屏”效果。在后续图像处理中，需要手动对图像进行裁剪和对齐。
7. 图像处理与数据分析的注意事项
我们通常在 Macintosh 计算机（Apple, Inc）上使用 Volocity（PerkinElmer, Waltham, MA）进行图像分析。首先调整转盘激光共聚焦显微镜图像的强度以校正光漂白，然后使用 Volocity 进行去卷积处理。Gag 斑点的强度测量和追踪通过 Volocity 定量模块完成。对于需要计算相对于已形成突触的运动的图像序列，采用一种自动追踪算法，该算法在整个序列中持续追踪突触按钮。必须对自动追踪软件定义的兴趣区域进行人工检查，以确认软件已正确追踪目标对象。对于与周围结构对比度过弱的对象，可逐帧进行手动追踪。Volocity 软件包支持导出目标对象的 XYZ 坐标位置、体积以及积分信号强度。通过将运动归一化至突触按钮中心，计算被追踪对象距突触的距离及其运动速度。
8. 代表性结果
混合后10至15分钟内，应能观察到表达HIV Gag-iGFP的Jurkat细胞黏附于原代CD4+ T细胞。通过成像这些细胞结合体，可评估感染细胞中Gag斑点的运动情况，以及免疫突触形成后靶细胞内的Gag斑点动态。在免疫突触形成后不久，可观察到Gag-iGFP斑点向靶细胞内移动的现象。

<ol><li>Blanco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+level+of+coreceptor-independent+HIV+transfer+induced+by+contacts+between+primary+CD4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">High level of coreceptor-independent HIV transfer induced by contacts between primary CD4 T cells.</a> J Biol Chem. 279, 51305-51314 (2004).</li>
<li>Sourisseau, M., Sol-Foulon, N., Porrot, F., Blanchet, F., Schwartz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inefficient+human+immunodeficiency+virus+replication+in+mobile+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Inefficient human immunodeficiency virus replication in mobile lymphocytes.</a> J Virol. 81, 1000-1012 (2007).</li>
<li>Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+cell+to+cell+transfer+across+an+Env-induced%2C+actin-dependent+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse.</a> J Exp Med. 199, 283-293 (2004).</li>
<li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV-1%29+Gag+localization+and+oligomerization+monitored+with+live+confocal+imaging+of+a+replication-competent%2C+fluorescently+tagged+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1.</a> J Virol. 81, 12596-12607 (2007).</li>
<li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3D+video+microscopy+of+HIV+transfer+across+T+cell+virological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3D video microscopy of HIV transfer across T cell virological synapses.</a> Science. 323, 1743-1747 (2009).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本文介绍一种用于可视化HIV在细胞间转移的简单方法。我们实验室及其他实验室的最新研究表明，这可能是HIV在T细胞间传播的主要方式。本文所述方法采用一种重组形式的HIV，称为HIV Gag-iGFP，其在核心结构蛋白Gag中携带一个基因编码的绿色荧光蛋白标签。由于每个病毒颗粒中均产生高水平的GFP，这种具有复制能力的HIV克隆可使研究人员实时追踪单个病毒颗粒。该病毒在研究HIV的组装及细胞间转移过程中应具有特别重要的应用价值。
细胞间转移HIV的效率非常高。在三小时的共培养过程中，通过流式细胞术评估，我们常规观察到有20–30%的原代T细胞被病毒感染。活细胞成像实验中也定性地观察到类似的转移效率。病毒感染的T细胞在共培养开始后几乎立即与未感染的原代T细胞形成突触结构。有趣的是，尽管使用激光镊子强制接触，仍并非所有原代T细胞都能与HIV感染的Jurkat细胞发生相互作用（未发表观察结果，GM）。HIV Gag-iGFP无疑将有助于确定最易受细胞间病毒转移影响的T细胞亚群， 体外 和 体内.

<table><tbody><tr><td>Jurkat T 细胞</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>全血来源的白细胞富集层</td><td>纽约血液中心</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Hyclone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector 系统及溶液 V</td><td>Lonza 公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EndoFree 大量质粒提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HIV Gag-iGFP 质粒</td><td>Chen 实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD4+ T 细胞分离试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque 分离液</td><td>GE 医疗</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Celltracker/CellTrace 荧光染料</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-非依赖性培养基</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>活细胞成像培养皿</td><td>Ibidi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX-71 倒置显微镜</td><td>Olympus 公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PlanApo N 1.42NA 60X 油镜物镜</td><td>Olympus 公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Innova 70C ArKr 离子气体激光器</td><td>Coherent 公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CSU-10 Nipkow 型转盘共聚焦成像系统</td><td>Yokogawa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 多波长二向色镜分光器</td><td>Semrock</td><td></td><td></td></tr><tr><td>525/50 带通滤光片</td><td>Semrock</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iXon+ 897 电子倍增电荷耦合器件相机</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ASI 400 恒温加热装置</td><td>Nevtek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用荧光标记的hiv克隆与活细胞共聚焦显微镜观察hiv的细胞间传递

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

通过将绿色荧光蛋白与其感兴趣的蛋白质融合，生物学家现在能够利用荧光视频显微镜研究活细胞中复杂的细胞过程。为了追踪人类免疫缺陷病毒（HIV）在细胞间传播过程中核心蛋白的运动，我们在一种具有感染性的HIV分子克隆（称为HIV Gag-iGFP）中对Gag蛋白进行了GFP标记。我们使用共聚焦视频显微镜研究这一病毒克隆。在以下可视化实验中，我们将HIV Gag-iGFP转染至一种人类T细胞系，并使用荧光标记的未感染CD4+ T细胞作为病毒的靶细胞。通过不同的荧光标记，我们能够清晰地追踪病毒在称为病毒学突触的细胞间结构中的产生与转运过程。简单的气体可渗透成像腔室使我们能够利用活细胞共聚焦显微镜对突触进行数分钟至数天的连续观察。这些方法可用于追踪病毒蛋白从一个细胞转移到另一个细胞时的动态过程。

本可视化实验旨在指导如何利用荧光标记的HIV分子克隆进行活细胞共聚焦成像实验。

利用荧光标记的HIV克隆与活细胞共聚焦显微镜观察HIV的细胞间传递

通过将绿色荧光蛋白与其感兴趣的蛋白质融合，生物学家现在能够利用……研究活细胞中复杂的细胞过程。

该实验利用活细胞成像技术，可视化表达HIV的jerk CAT T细胞与未感染的原代T细胞之间通过病毒突触传递GFP标记的HIV的过程。细胞间传递实验首先用HIV gag IG FP转染jerk CAT T细胞，该质粒为一种具有感染性的HIV-1荧光克隆。转染后表达HIV gag IG FP的jerk CAT细胞与C-M-T-M-R标记的未感染原代T细胞混合，并接种至成像培养皿中，以便观察GFP标记的HIV通过病毒突触的传递过程。利用图像分析软件对获得的数据进行分析，以揭示HIV通过T细胞病毒学突触转移的详细过程。大家好，我叫Benjamin Dale，来自西奈山医学院医学系Ben Chen实验室。我是Greg McNerney，来自加州大学戴维斯医学中心美国国家科学基金会生物光子学中心Thomas Huser博士的实验室。我是Deanna Thompson，同样来自Thomas Huser博士的实验室。今天我们将向您展示一种利用活细胞共聚焦显微镜观察细胞间HIV-1转移过程的实验方法。在本实验中，Jurkat细胞被转染了一种具有感染性的HIV分子克隆，该操作仅限经培训的实验室人员在认证的生物安全实验室中进行。二级以上或生物安全三级组织培养室可执行此处所示方案。在成像设施中操作具有感染性的HIV必须获得当地机构生物安全办公室的批准。将用作供体细胞的jerk cat细胞维持在每毫升2×10⁵至8×10⁵个细胞的浓度范围内。在Jerk猫细胞培养中，当细胞浓度超过每毫升8×10⁵个细胞时，会导致转导效率下降。实验开始时，使用Amax核酸转染法（具体操作详见随附的书面实验方案），将5×10⁶个Jerk猫细胞与病毒质粒HIV gag IGFP共转染，并让细胞过夜恢复。外周血单个核细胞通过FICO密度梯度离心法从人全血的血沉棕黄层中分离纯化获得。通过使用CD4阳性T细胞分离试剂盒进行负向筛选，从外周血单个核细胞中纯化出原代CD4阳性T细胞。将负向筛选获得的CD4阳性T细胞从磁性柱中收集，并在含有10% FPS及每毫升10单位重组人IL-2的PMI培养基中进行培养。也可将分离得到的原代CD4阳性T细胞分装，并借助冻存容器进行冷冻保存。将冻存容器置于-70°C冰箱中，至少冷冻3至4小时。随后将细胞转移至液氮中进行长期保存。在完成震颤蛋白头域细胞的转染并分离出目标原代CD4阳性T细胞后，于转染后的次日进行细胞的清洗及标记。目前，这些震颤蛋白头域细胞已表达出具有感染性的荧光标记HIV构建体。处理传染性样本时，我们穿戴前开式实验服和两副手套。通过在菲亚尔高密度介质上离心，去除转染细胞中的细胞碎片。首先将1.5毫升菲亚尔介质置于15毫升锥形管底部。然后用五毫升的PMI培养基，将转染的jerk hat细胞轻柔地覆盖在梯度材料上。此时，转染的jerk hat细胞已能够产生具有感染性的HIV。因此，所有接触过表达HIV细胞的移液器吸头都必须用10%的次氯酸钠溶液进行消毒。在将离心管丢弃至生物安全柜内的容器之前，先盖上管盖，并用70%乙醇溶液喷洒管外壁，然后用干燥的无尘纸擦拭。在室温下以400 ×g离心20分钟，离心时关闭刹车。离心结束后，使用移液器小心地从细胞与培养基界面处吸取细胞，转移至一个新的15毫升锥形管中。用我们的PMI培养基将细胞稀释至总体积15毫升，并以300 ×g离心10分钟。在室温下，将沉淀重悬于 3 毫升 jerk hat 培养基中，并转移至六孔板中的一个 2 厘米孔内。将该培养板置于组织培养孵箱中，直至次日使用。在同一天晚上，对用作靶细胞的初始 CD4 阳性 T 细胞进行标记，以便将其与供体细胞区分开。首先，通过在 400 × g 条件下离心 10 分钟，沉淀 4 × 10⁶ 个初始 CD4 阳性 T 细胞。随后用 5 毫升 PBS 重悬细胞并洗涤。加入 2 毫升 PBS，再加入细胞示踪染料橙色（cell tracker orange），使其终浓度为 1.5 微摩尔/升，在 37 摄氏度孵育数分钟。细胞孵育完成后，加入 8 毫升完全 ChicA 培养基，于 400 ×g 离心 10 分钟。将细胞重悬于3 mL完全培养基中，培养基中添加10单位/毫升的IL-2，置于组织培养孵箱中过夜。过夜孵育后，供体细胞和靶细胞即可用于细胞间转移实验。在进行细胞间转移实验前，需准备好成像室，以缓冲室内温度波动对平台的影响。为了屏蔽背景环境光，将一个大型黑色罩布覆盖在整个显微镜加热装置上，在系统周围形成一个隔热的空气层。通过使用带有T型热电偶探头的恒温加热器，并将探头置于样品附近以反馈温度，使成像室始终保持在稳定的37摄氏度。在安装样品前，需预先加热30分钟。利用倒置光学显微镜进行转盘共聚焦成像，以获取HIV细胞间转移的三维共聚焦图像。所有硬件及图像采集过程（包括Z轴步进平台）均由Andor IQ 1.8版本软件控制。扫描由CSU-10转盘共聚焦单元完成，该单元同时使用超过800个共聚焦光点，显著提高扫描速度，以匹配其高速性能。CSU-10配备高灵敏度电子倍增电荷耦合器件相机，可实现快速低光照成像，从而显著降低光漂白和光毒性。荧光光源为多波长氩氪离子气体激光器。使用And/Or Oko光学可调滤光器（AOTF）来选择所需波长，此处为488纳米和568纳米，同时控制其功率以进一步减少光漂白并延长成像时间。当相机未采集图像时，AOTF在每次15至30毫秒曝光后快速关闭激光，避免在图像从EMCCD相机传输至计算机期间产生不必要的曝光。使用405、488、568和647四波段二向色镜，将激光光源整合到转盘系统中。荧光发射光通过560纳米长通二向色镜和图像分光器按波长分离。绿色通道采用525/50纳米带通滤光片过滤，红色通道采用609/54纳米带通滤光片过滤。两个通道并排投射到EMCCD相机上。在成像室预热的同时，准备细胞间转移实验所需的细胞。使用血细胞计数板对表达 HIV gag IGFP 的细胞进行计数。将血细胞计数板置于培养皿中，以避免其直接接触表达病毒的细胞。用不含二氧化碳的培养基洗涤细胞，并将细胞重悬于活细胞成像培养基中，浓度为每毫升1×10⁷至3×10⁷个细胞。使用不含二氧化碳的培养基可避免对二氧化碳培养环境的需求，适用于成像实验。细胞还需计数，并像之前处理Jurkat细胞一样，洗涤并重悬标记的原代CD4阳性T细胞。接下来，启动细胞间转移，将20 µL HIV gag-I-GFP转染的Jurkat细胞与40 µL标记的原代CD4阳性T细胞混合，取50 µL混合液加入经组织培养处理的透气型EBD微室中，用塞子密封小室，并用封口膜包裹塞子与EBD微室的接口处以固定塞子。使用浸有70%乙醇的化学清洁擦拭布擦拭成像室，并在生物安全柜中短暂晾干。将密封的成像室置于密闭容器中运输，以避免意外暴露。若在向IBD成像室加载细胞后运输过程中成像室意外掉落，请立即将装置安装到显微镜上。使用60倍、1.42数值孔径的油浸物镜对细胞对进行成像，高数值孔径可显著提高分辨率，从而最大限度提升三维图像堆栈的采集速度。将EM CD相机的记录区域裁剪至细胞对的邻近区域。此外，在此条件下，0.45至0.75微米之间的较大Z步长也可能有助于加快采集速度。图像以20至60分钟的时间间隔持续记录。对同一样本位点进行重复成像时，若采集得当，可连续进行长达六小时且光漂白程度极低。每个数据片段包含数万张图像，总数据量可能达到5至20吉字节。为便于大文件的传输和分析，每个文件将被分割并导出为多个一吉字节的 TIFF 图像文件片段。要分析所获取的图像，可使用多种图像分析软件程序之一。有关图像分析的详细步骤，包括荧光强度漂白校正以及gag puncta的自动与手动追踪，请参阅随附的书面实验方案。混合后10至15分钟内，可观察到表达HIV gag IGFP的jerk cat细胞黏附于原代CD4阳性T细胞的成像。通过这些共轭结构，可评估gag点状物在感染细胞及靶细胞中的运动情况。在突触形成后30分钟至3小时内，可观察到gag IGFP点状物向经细胞示踪剂标记的靶细胞内移动的现象。我们刚刚向您展示了如何可视化HIV在T细胞之间的细胞间转移。在进行这些操作时，处理暴露于表达HIV细胞的样本时，务必严格遵守生物安全二级加强（biosafety level two plus）或生物安全三级（biosafety level three）的所有防护措施。同时，请记得使用状态良好的JCA细胞和无内毒素的DNA，以优化转染效果。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

可视化的细胞与细胞转移的艾滋病毒，艾滋病毒和现场共聚焦显微镜的荧光克隆

一种结合原位四聚体染色与原位杂交（ISTH）的技术，能够实现病毒特异性CD8+...

一种可同时原位可视化病毒特异性CD8+ T细胞与病毒感染细胞的技术 In situ

我们开发了一种慢病毒载体，该载体除了具有Tat响应性LTR外，还含有Rev响应元件（RRE），能够以HIV-1...

利用表达绿色荧光蛋白的Rev依赖型慢病毒载体特异性标记HIV-1阳性细胞

本文介绍了一种利用全内反射荧光（TIRF）显微镜在玻璃支撑的平面双层膜上可视化HIV-1包膜蛋白诱导的病毒学突触形成的方法。该方法还可与免疫荧光染色相结合，用于检测HIV-1包膜蛋白诱导病毒学突触形成过程中信号分子的活化与重新分布。...

在合成脂双层上成像HIV-1包膜诱导的病毒学突触及信号传导

荧光法检测病毒RNA 原位 杂交（FISH）

来源：Lê-Bury, G., 等. 在感染HIV-1的活体人原代巨噬细胞中测量吞噬体迁移与速度。J. Vis. Exp. (2016)本视频展示了对感染 HIV-1 的人巨噬细胞进行活细胞共聚焦成像，通过 GFP 荧光和明场追踪技术来观察和量化吞噬体的迁移，从而揭示 HIV 如何在 Fc...

活体成像观察HIV-1感染人巨噬细胞中吞噬体的迁移

我们介绍了一种关联显微技术，该技术结合了高速三维活细胞荧光光学显微镜与高分辨率冷冻电子断层扫描技术。通过成像动态的小型HIV-1颗粒与宿主HeLa细胞的相互作用，我们展示了该关联方法的能力。...

动态相互作用三维结构分析的关联显微技术

活细胞成像技术可对α疱疹病毒感染过程中的定向运输和细胞间扩散等动态事件进行分析。本文介绍了利用表达荧光融合蛋白的重组病毒株，在原代神经元感染过程中实现病毒组装体可视化的方法。...

活细胞成像观察α疱疹病毒的顺向运输与传播

本文介绍了一种荧光成像方法的实验方案，即多重免疫荧光细胞检测法检测DNA、RNA和蛋白质（MICDDRP），该方法能够同时在单细胞水平上以荧光方式可视化不同种类和链型的病毒蛋白及其核酸。该方法可广泛应用于多种研究体系。...

单细胞多重荧光成像技术用于可视化病毒核酸与蛋白质并监测HIV、HTLV、HBV、HCV、寨卡病毒和流感病毒感染

本文介绍了一种在纳米流体装置上对单个细胞进行监测以研究急性事件及有效的HIV-1感染的实验方案。成像数据可明确病毒与宿主受体之间的相互作用以及信号通路的动力学变化。这是首个用于高通量、纵向单细胞培养与成像的纳米流体技术方法，可用于研究信号动力学和分子相互作用。...

基于多参数光流控平台的单细胞钙离子内流与HIV-1感染表征

该方法提供了一种简便且灵活的电镜（EM）载网制备方案，适用于 原位...

样品制备 原位 哺乳动物细胞的冷冻断层扫描技术

了解利用活细胞共聚焦显微镜可视化HIV在T细胞间通过病毒学突触转移的方法。本实验使用荧光标记的HIV分子克隆和原代CD4阳性T细胞，为研究HIV发病机制提供可靠的实时成像技术。

利用荧光标记的HIV克隆与活细胞共聚焦显微镜观察HIV的细胞间传递

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