在分离的小鼠使用红桃心功能和能量学的评估 ³¹ P核磁共振

以下实验的总体目标是观察离体灌注小鼠心脏的心脏功能和能量。这是通过在 LOR 模式下灌注小鼠心脏来实现的。第二步使用富含葡萄糖和丙酮酸的 Krebs 手动选择缓冲液，将充满水的球囊插入左心室或 lv，从而可以在实验期间持续监测心脏功能。

接下来，将心脏放入 10 毫米的 NMR 管中并插入磁体，以便通过观察 TP 磷酸磷酸肌酸的共振来评估心脏能量学，并获得无机磷酸盐结果，这些结果显示基于 LV 压力波和 P 31 和质谱的心脏功能和能量学。嗨， 我是来自华盛顿大学麻醉学系麻省理工学院干部代谢中心的 Steve Kitz。今天，我将向您展示一种分离心脏灌注结合 31 PNMR 波谱的程序。

我们在实验室中使用该程序来评估我们的生物工程小鼠模型中的心脏功能和能量学。那么让我们开始吧。要开始此协议，请准备一升 kres，因此准备 light 或 KH 缓冲液。

将 5% 二氧化碳和 95% 氧气气泡加入混合物中 10 到 15 分钟。然后加入 2 毫摩尔氯化钙，然后加入底物、10 毫摩尔葡萄糖和 0.5 毫摩尔丙酮酸。对于这些实验，每次采集 P 31 光谱时，会同时使用两个单独的系统。

BRUER 14 T 磁体与先进的三个控制台和配备 top spin V 2.1 软件的计算机连接，用于评估心脏功能。定制的心脏灌注系统与 Power Lab 连接。4 个 30 数据申请。

配备 lab chart PRO six 软件进行数据分析。心脏灌注仪包括一个由 STH 泵控制器控制的微型脉冲三蠕动泵，用于在 NMR 实验期间将 KH 缓冲液灌注到心脏温度调节中，这一点至关重要。当心脏位于磁体内部时，使用加热循环器将温度保持在 37.0 至 37.5 摄氏度之间，并使用光纤温度探头在实验期间监测温度。

在整个实验过程中，LV 压和灌注压通过连接到数据采集系统的压力传感器进行监测，并使用随附的软件进行显示。生理传感器用于监测 LV 压，一次性血压传感器用于监测灌注压。最后，使用脐带将加热的含氧缓冲液供应到心脏。

一旦进入磁体，在实验开始之前，首先用标准无花果矩压力计校准压力传感器，不要压力进入传感器，以将校准归零。然后将这个 fig 模式压力计充气到更高的压力。在计算机程序中输入此值。

然后通过将这个无花果矩压力计充气到已知压力并在计算机屏幕上验证它们来确认压力传感器已充分校准。校准压力传感器后，用含有 150 毫摩尔磷酸钠标准样品的 10 毫米 NMR 管校准 NMR 探头。使用 top spin 软件程序执行校准。

首先，调整样本以设置磷共振的频率。然后对样品进行垫片以产生均匀的磁场。这种初始校准有助于信号并缩短开始采集周期所需的时间。

一旦心脏位于探针内以开始小鼠心脏提取，就向小鼠腹膜内注射 200 单位的肝素以减少凝血。五分钟后，腹膜内注射每公斤 175 毫克 Penta 巴比妥钠。麻醉鼠标后，将其放在背上，用胶带粘住手臂和腿以露出胸部区域。

执行脚趾捏作以确保鼠标完全麻醉。切。用剪刀打开腹膜腔和胸部，用镊子剥开胸腔，用镊子露出胸腔。抓住肺组织，用弯曲的剪刀轻轻提起心脏。

切开心脏后面的大血管，然后慢慢地向老鼠的头部前进，直到心脏自由。立即将心脏停在冰冷的 KH 缓冲液中。将器官放在冰上并迅速取出肺部。

识别胸腺的叶并轻轻将它们向后剥离以露出主动脉。然后去除胸腺。最后，通过小心去除任何周围组织来隔离主动脉。

使用显微缝合钳，通常固定主动脉的两侧壁以暴露管腔。然后小心地将主动脉放在套管上。由外径为 0.965 毫米的聚乙烯管制成。

用微血管夹将主动脉固定到位，并在主动脉周围快速缝合。缝合线系好后，取下夹子。使用镊子仔细检查套管是否位于主动脉根部上方。

添加将心脏固定到位所需的任何其他系带。使用镊子和微型剪刀去除任何多余的组织。然后在左侧甲骨文上做一个小切口。

轻轻握住心脏，小心地将 0.61 毫米外径的聚乙烯管穿过左心房、左心室腔，然后通过心尖伸出。修剪多余的管路。接下来，将放气的充气球囊通过心房插入左心室。

使用胶带将球囊固定到位。然后逐渐增加蠕动泵速度，为心脏提供足够的流量。继续用 KH 缓冲液灌注心脏，使用相当于每分钟约 2 毫升的恒定流量，直到将心脏放入 NMR 探针中。

使用千分尺注射器对 LV 球囊进行小体积充气，以验证 LV 压力传感器是否可用于 NMR 波谱。首先，小心地将心脏插入 10 毫米 NMR 管中。在 NMR 管周围放置一个宽大的公猪旋转器，以帮助将管子引导到正确的位置。

在探头内，用胶带将整个设备牢固地连接到脐带上。接下来，慢慢地将脐带降低到磁体的上孔中，直到包含心脏的 NMR 管位于 10 毫米 NMR 探头的线圈内。一旦心脏在探头内处于正确位置，调整寄生泵流量以达到 80 毫米汞柱的灌注压力。

通过启用泵控制器上的保持机制来保持灌注压力。为心脏留出 15 到 20 分钟的 e 平衡期。在平衡期间，调整 LV 球囊的体积以达到 8 至 10 毫米汞柱的舒张末压。

然后优化光谱仪参数以获得最佳的磷信号。通过设置无线电脉冲来调整 NMR 仪器，即磷核共振的频率。然后对样品进行垫片，使平衡期后磁场均匀。

开始多次 P 31 NMR 波谱采集。每个光谱的采集周期取决于磁体的场强、样品的大小以及特定实验所需的信噪比。这里使用 14 特斯拉磁体通过对 256 个 20 微秒射频脉冲（60 度翻转角和 2.0 秒延迟）获得的信号进行平均，从而获得频谱。

此实验大约需要 10 分钟。LV 发展压是心脏功能的典型测量方法，是通过从收缩压中减去舒张末期压或 EDP 来获得的。在正常的 C 57 black six 小鼠中，心脏 LV 产生的压力通常在 100 至 110 毫米汞柱之间，而固定端舒张压为 8 至 10 毫米汞柱。

显示了对照和主动脉带状小鼠的代表性造型曲线。收缩功能表现为 LV 产生的压力与增加的 LV 容量的关系，由 LV 球囊的体积决定。舒张功能由 EDP 表示，随着 LV 容量的增加。

离体灌注小鼠心脏的 P 31 NMR 波谱提供磷酸肌酸或 PCR 信号，即来自 TP 的三种磷酸盐和无机磷酸盐或 pi。在这里，PI 峰相对较小。这是典型的有氧心脏，由丙酮酸或脂肪酸供应。

除了缺血期间的葡萄糖外，该峰值增加，而 PCR 峰减少。我刚刚向您展示了如何准备小鼠心脏进行灌注，以便在实验过程中可以同时测量心脏功能和能量学。确保心脏得到充分灌注很重要。

否则，您的 NMR 数据将不可靠。就是这样。谢谢你，祝你的实验好运。