Name: 在分离的小鼠使用红桃心功能和能量学的评估 31 P核磁共振 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-31T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: 学习使用Langendorff灌流结合31P核磁共振波谱技术评估小鼠离体心脏功能与能量代谢。该方法可同时监测高能磷酸化合物含量及左心室压力变化，为心脏生理学和生物化学研究提供可靠的实验方案。

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作者谨此感谢 Lynne Spencer 在实验的核磁共振波谱部分提供的支持。本研究得到了美国国立卫生研究院基金 R01 HL059246、R01 HL067970、R01 HL088634（资助田博士）和 F32 HL096284（资助 Kolwicz 博士）的资助。

<ol>
	<li>本实验同时使用两个独立的系统。用于采集31P谱的系统由Bruker 14T磁体、Avance III控制台以及配备TopSpin V2.1软件的计算机组成。用于评估心脏功能的系统则由自行搭建的心脏灌流装置与PowerLab 4/30数据采集系统连接，并配备LabChartPro 6软件用于数据分析。</li>
	<li>实验当天，配制1升Krebs-Henseleit缓冲液，配方如下：0.5 mM EDTA、5.3 mM KCl、1.2 mM MgSO4、118 mM NaCl和25 mM NaHCO3。混合液先用5% CO2/95% O2气体鼓泡10–15分钟，随后加入2 mM CaCl2。最后加入底物，即10 mM葡萄糖和0.5 mM丙酮酸。</li>
	<li>实验过程中温度调控至关重要。当心脏置于磁体内部时，使用加热循环器将温度维持在37.0–37.5°C之间，并通过光纤温度探针全程监测温度。</li>
	<li>灌注压和左心室压通过连接至数据采集系统的压力传感器进行监测，并由配套软件实时显示。实验前使用标准血压计对传感器进行校准。此外，需充分冲洗压力导管，以彻底排除所有气泡。</li>
	<li>在心脏插入探针前，使用150 mM磷酸钠标准样品（其离子强度与KH缓冲液相当）对探针进行“校准”。这有助于增强信号，并缩短心脏定位至探针后开始采集所需的时间。</li>
	<li>为防止凝血，小鼠腹腔注射200单位肝素。5分钟后，再腹腔注射戊巴比妥钠（175 mg/kg）。</li>
	<li>迅速取出心脏（保留肺和胸腺），并立即浸入冰冻KH缓冲液中使其停搏。</li>
	<li>将心脏保持在冰上，快速去除肺组织。辨认胸腺叶并轻轻剥离以暴露主动脉，随后完全切除胸腺。通过仔细清除周围组织，分离出主动脉。</li>
	<li>使用显微缝合镊子轻轻夹住主动脉两侧壁以暴露管腔。将主动脉小心套入外径为0.965 mm的聚乙烯管（PE50）制成的插管上。用微血管夹固定主动脉位置，迅速用缝线结扎固定。移除夹子后，用镊子仔细检查插管是否位于主动脉根部上方。根据需要添加额外结扎线以确保心脏位置稳固。</li>
	<li>使用镊子和显微剪刀去除多余组织。在左心耳处做一小切口。将外径为0.61 mm的聚乙烯管（PE10）小心经左心房、左心室腔并从心尖穿出，操作时轻持心脏。剪去多余导管部分。</li>
	<li>将一个未充气的注水球囊经心房插入左心室，并用胶带或缝线固定。逐渐提高蠕动泵转速，为心脏提供足够灌注流量。在心脏置入核磁共振（NMR）探针前，持续以约2 ml/min的恒定流速进行灌注。使用千分尺注射器向左心室球囊注入少量液体使其充盈，以确认左心室压力传感器正常工作。</li>
	<li>小心将心脏插入10 mm NMR样品管中。使用宽孔“旋转器”辅助引导样品管准确进入探针内的正确位置。整个装置随后用胶带牢固固定于“脐带”连接线上。</li>
	<li>将“脐带”缓慢送入磁体上部孔道，直至心脏/NMR样品管进入10 mm NMR探针的线圈内部。</li>
	<li>当心脏在探针内达到正确位置后，调节蠕动泵流量，使灌注压达到80 mmHg（需注意，此前心脏一直以约2 ml/min的恒定流速灌注）。通过启用泵控制器上的“保持”功能维持恒定灌注压。随后让心脏平衡15–20分钟。在此期间，调节左心室球囊体积，使左心室舒张末期压力达到8–10 mmHg。</li>
	<li>在平衡期间，需优化波谱仪参数，以获得最佳的磷信号。具体操作包括将射频脉冲频率设定在磷原子核共振频率处（“调谐”），并使磁场均匀化（“匀场”）。</li>
	<li>平衡期结束后，可连续采集多个31P核磁共振（NMR）谱。每张谱图的采集时间取决于磁体场强、样品大小以及特定实验所需的信噪比。使用14特斯拉磁体时，通过累加256次射频脉冲信号获得谱图，每次脉冲持续20 μs，翻转角为60度，脉冲间隔2.0秒。该实验约需10分钟完成。</li>
</ol>
代表性结果
通过数据采集硬件和LabChart软件，可在整个实验过程中测量心脏功能的多个参数。心脏功能的常用指标是左心室发展压（LVDevP），通过从收缩压中减去舒张末期压力（EDP）获得（图1）。该指标可能因小鼠品系和心脏状态（例如压力超负荷）而异。然而，在舒张末期压力固定为8-10 mmHg时，正常C57BL6小鼠心脏的LVDevP通常在100-110 mmHg之间。此外，LabChart程序可根据左心室压力波形的周期性变化来测量心率。这一参数也可能存在变异，当心脏以固有节律跳动时，典型值为350-400 bpm。然而，也可使用起搏系统将心率标准化为420 bpm。此外，可通过左心室压力波形的一阶导数估算心肌收缩性（+dP/dt）和舒张功能（-dP/dt）。在实验过程中，通过建立压力-容积关系，可方便地评估Starling机制。该方法通过逐步增加左心室球囊容积，并记录相应的LVDevP和EDP来实现。随后可将这些数值绘制成图，如图2所示。尽管Starling曲线最为理想，但记录达到8-10 mmHg EDP所需的容积，可间接反映左心室腔的大小。该方法可用于主动脉缩窄模型：与对照组相比，肥厚心脏通常需要较小的球囊容积，而扩张心脏则需要较大的容积。表1展示了灌注实验过程中获得的代表性心脏功能数据。
如图2所示，31P核磁共振波谱仪将提供磷酸肌酸（PCr）和来自ATP的三个磷酸基团（γ-ATP、α-ATP和β-ATP）以及无机磷酸盐（Pi）的信号。分析这些峰中的每一个均可得到其峰下面积的数值。ATP的含量通过取γ-ATP和β-ATP峰面积的平均值来估算（不使用α-ATP，因为NAD分子对总信号的未知部分有贡献）。心脏的能量状态由PCr与ATP峰面积的比值（PCr:ATP比值）决定。当小鼠心脏以葡萄糖为主要底物时，该值通常为1.5–1.7。尽管31P核磁共振不能直接测量ATP或PCr的绝对浓度，但峰面积与样品中含磷化合物的含量成正比。这些信号的数值可通过其他方法进行估算。例如，通过高效液相色谱法（HPLC）对一组心脏样本进行ATP的直接测定，可获得平均浓度，该值随后可用于校准在波谱中观察到的平均ATP峰面积。磷酸肌酸（PCr）的浓度可根据其峰面积相对于ATP峰面积的比例计算得出。此外，还可通过分析无机磷酸盐（Pi）信号相对于PCr信号的化学位移来估算pH值1。使用不同的射频脉冲序列，还可测量肌酸激酶反应速率或ATP合成反应速率2。
<img src="/files/ftp_upload/2069/2069tab1.jpg" alt="基础心脏功能表；比较A组和B组的LV Dev P、HR、RPP、PP、CF。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="表 1"> 表 1. 离体灌注心脏的基础心脏功能。LVDevP：左心室发展压；LVEDP：左心室舒张末期压；HR：心率；RPP：率压积；+dP/dt：左心室压力上升速率（正向dp/dt）；-dP/dt：左心室压力下降速率（负向dp/dt）；PP：灌注压；CF：冠状动脉血流。
<img src="/files/ftp_upload/2069/2069fig1.jpg" alt="心动周期波形图，左心室压力随时间变化，血流动力学分析，生理学研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 来自 LabChart Pro 软件的典型左心室压力波形。
<img src="/files/ftp_upload/2069/2069fig2.jpg" alt="收缩功能和舒张功能曲线图；LV DevP、EDP 与球囊容积的关系；主动脉缩窄组与对照组。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2. 来自对照组（实线）和主动脉缩窄组（虚线）小鼠的代表性Starling曲线。A) 通过左心室球囊容积增加所测定的左心室容积变化，反映左心室发展压（LVDevP）表示的收缩功能。B) 通过左心室球囊容积增加所测定的左心室容积变化，反映舒张末期压（EDP）表示的舒张功能。LVDevP：左心室发展压（收缩压减去舒张压）；EDP：舒张末期压。
<img src="/files/ftp_upload/2069/2069fig3.jpg" alt="磷-31核磁共振谱图；显示PCr、β-、α-、γ-ATP的峰；代谢研究；ppm标度。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3. 离体灌注小鼠心脏的代表性31P NMR谱图。注意无机磷酸盐（Pi）峰相对较小。在有氧灌注条件下，若心脏除葡萄糖外还供给丙酮酸或脂肪酸，则该峰应极小。在缺血期间，此峰增大，而磷酸肌酸（PCr）峰减小。注意α-ATP峰右侧的肩峰，此为NAD分子的贡献。Pi：无机磷酸盐；PCr：磷酸肌酸；ATP：三磷酸腺苷。

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<li>Xing, Y., Musi, N., Fujii, N., Zou, L., Luptak, I., Hirshman, M. F., Goodyear, L. J., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+metabolism+and+energy+homeostasis+in+mouse+hearts+overexpressing+dominant+negative+alpha2+subunit+of+AMP-activated+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Glucose metabolism and energy homeostasis in mouse hearts overexpressing dominant negative alpha2 subunit of AMP-activated protein kinase.</a> J Biol Chem. 278, 28372-28377 (2003).</li>
<li>Luptak, I., Yan, J., Cui, L., Jain, M., Liao, R., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+effects+of+increased+glucose+entry+on+mouse+hearts+during+normal+aging+and+ischemic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Long-term effects of increased glucose entry on mouse hearts during normal aging and ischemic stress.</a> Circulation. 116, 901-909 (2007).</li>
<li>Tian, R., Abel, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+GLUT4-deficient+hearts+to+ischemia+underscore+the+importance+of+glycolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Responses of GLUT4-deficient hearts to ischemia underscore the importance of glycolysis.</a> Circulation. 103, 2961-2966 (2001).</li>
<li>Liao, R., Jain, M., Cui, L., D'Agostino, J., Aiello, F., Luptak, I., Ngoy, S., Mortensen, R. M., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac-specific+overexpression+of+GLUT1+prevents+the+development+of+heart+failure+attributable+to+pressure+overload+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cardiac-specific overexpression of GLUT1 prevents the development of heart failure attributable to pressure overload in mice.</a> Circulation. 106, 2125-2131 (2002).</li>
<li>Tian, R., Musi, N., D'Agostino, J., Hirshman, M. F., Goodyear, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+adenosine+monophosphate-activated+protein+kinase+activity+in+rat+hearts+with+pressure-overload+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Increased adenosine monophosphate-activated protein kinase activity in rat hearts with pressure-overload hypertrophy.</a> Circulation. 104, 1664-1669 (2001).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

31P 核磁共振波谱法在离体小鼠心脏Langendorff灌流系统中的应用可提供可靠且可重复的数据3, 4。然而，主动脉插管和左心室气囊插入必须操作得当，以确保心脏在核磁共振管内维持稳定的心功能。此外，温度调控至关重要，以实现正常的基础心功能。获得良好且可分析的核磁共振谱图的一个重要因素是提高信噪比。这可通过确保样品的“调谐”（tuning）和“匀场”（shimming）处于最佳状态来实现。如实验方案正文所述，在插入心脏前使用标准样品有助于完成此步骤。同时，拥有足够大小的“样品”也十分有益。重量低于100 mg的心脏通常会产生较低的磷酸肌酸（PCr）和三磷酸腺苷（ATP）信号，因此需要延长采集时间以获得良好的磷谱图。
有多种方法可以修改现有方案，以获取更多关于心脏功能和能量代谢的信息。在我们的实验室中，我们使用含有混合底物的灌注液对心脏进行灌注，这些底物可包括不同组合的脂肪酸（低浓度和高浓度）、乳酸、酮体以及胰岛素。通过在灌注液中使用稳定同位素（例如，13C标记的底物），我们能够根据标记的乙酰辅酶A对三羧酸（TCA）循环的相对贡献，估算底物的利用情况5-7。为此应用，我们采用13C核磁共振波谱法对13C3-和13C4-谷氨酸进行同位素异构体分析。该方法要求在灌注方案结束时迅速夹取心脏组织并冷冻，随后对冷冻组织进行提取。这将作为一项额外实验，因为分析过程需要使用不同的探头及独立的设置参数。其他应用还包括在灌注液中用脱氧葡萄糖替代葡萄糖，同时利用31P核磁共振波谱法监测2-脱氧葡萄糖磷酸在心脏中随时间积累的情况，该方法可用于测定心肌葡萄糖摄取量7, 8。此外，我们的实验室还研究了在缺血/再灌注及高负荷应激条件下灌注方案中的心脏功能与能量代谢6, 8-10。
总之，在离体小鼠心脏中进行31P核磁共振波谱分析是一项技术上具有挑战性的操作，需要使用精密设备。然而，该方法所提供的数据对于希望分析生物工程小鼠模型心脏功能与能量代谢的研究人员而言极为宝贵。在我们的实验室中，这些技术对于理解多种应激因素对心脏功能、能量代谢及整体代谢影响的机制起到了关键作用。1, 11, 12

<table><tbody><tr><td>硫酸镁</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1644</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4505</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Ultrashield 600WB Plus</td><td>设备</td><td>Bruker Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML866/" target="_blank"&gt;PowerLab 4/30&lt;/a&gt;</td><td>设备</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML866/" target="_blank"&gt;ML866/P&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/software/research/LabChart-Software/" target="_blank"&gt;LabChart 6 Pro&lt;/a&gt;</td><td>设备</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/software/research/LabChart-Software/" target="_blank"&gt;MLS260/6&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/FE224/" target="_blank"&gt;Quad Bridge Amp&lt;/a&gt;</td><td>设备</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/FE224/" target="_blank"&gt;ML224&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/research/product/ML175/" target="_blank"&gt;STH Pump Controller&lt;/a&gt;</td><td>设备</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/research/product/ML175/" target="_blank"&gt;ML175&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML172/" target="_blank"&gt;Minipuls 3 Peristaltic Pump&lt;/a&gt;</td><td>设备</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML172/" target="_blank"&gt;ML172&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT0699/" target="_blank"&gt;Disposable BP Transducer&lt;/a&gt;</td><td>设备</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT0699/" target="_blank"&gt;MLT0699&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>10 mm NMR 样品管</td><td>设备</td><td>Wilmad LabGlass</td><td>513-7PP-7</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯导管 PE10</td><td>设备</td><td>BD Biosciences</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT844/" target="_blank"&gt;生理压力传感器&lt;/a&gt;</td><td>设备</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT844/" target="_blank"&gt;MLT844&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯导管 PE50</td><td>设备</td><td>BD Biosciences</td><td>427411</td><td></td></tr><tr><td>微量注射器</td><td>设备</td><td>Gilmont Instruments</td><td>GS-1101</td><td></td></tr><tr><td>McPherson 镊子</td><td>设备</td><td>Miltex Inc.</td><td>18-949</td><td></td></tr><tr><td>Castraviejo 显微剪刀</td><td>设备</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5650</td><td></td></tr><tr><td>Neoptix 信号调节器</td><td>设备</td><td>Neoptix, Inc.</td><td>Reflex - 1</td><td></td></tr></tbody></table>

使用31p 核磁共振波谱法评估离体小鼠心脏功能与能量代谢

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

生物工程小鼠模型已成为确定分子改变与心血管疾病模型之间因果关系的有力研究工具。尽管分子生物学对于识别信号通路中的关键变化至关重要，但它不能替代对功能意义的评估。生理学虽可回答功能相关问题，但将生理学与完整跳动心脏中代谢物的生化检测相结合，才能全面揭示心脏功能与能量代谢状况。多年来，本实验室一直采用离体心脏灌流联合核磁共振（NMR）波谱技术来实现这一目标。左心室功能通过Langendorff模式离体心脏灌流进行评估，而心脏能量代谢则通过执行31P 磁共振波谱分析灌注心脏。利用这些技术，可以在跳动的心脏中同时测量心脏功能指标以及磷酸肌酸和 ATP 的水平。此外，还可以在施加生理或病理应激因素的同时监测这些参数。例如，可采用缺血/再灌注或高负荷挑战方案。主动脉结扎或其他心脏病理模型也同样适用。无论实验方案如何变化，均可充分描述转基因小鼠模型中分子修饰对心脏功能和能量代谢的影响，从而为相关酶学及代谢通路提供新的见解。因此，31P 核磁共振波谱法在心血管疾病动物模型的离体灌注心脏研究中是一种重要的研究技术。

采用Langendorff模式的离体心脏灌流结合31P核磁共振波谱法，将生物化学与生理学整合于同一实验中。该方案可在连续监测心脏生理功能的同时，动态测定心肌高能磷酸化合物的含量及其转换速率。若操作正确，此技术是评估心脏能量代谢的有力手段。

使用31P 核磁共振波谱法评估离体小鼠心脏功能与能量代谢

生物工程小鼠模型已成为确定分子改变与疾病模型之间因果关系的有力研究工具。

以下实验的总体目标是观察离体灌注小鼠心脏的心脏功能与能量代谢。通过以LOR模式灌注小鼠心脏实现该目标。第二步使用富含葡萄糖和丙酮酸的Krebs-Henseleit缓冲液，将一个注满水的球囊插入左心室（LV），从而在实验过程中持续监测心脏功能。接下来，将心脏放入一支10毫米的核磁共振（NMR）管中，并插入磁体，以通过观察磷酸肌酸、三磷酸腺苷（ATP）和无机磷酸盐的共振信号来评估心肌能量代谢。所获得的结果可反映基于左心室（LV）压力波形以及³¹P核磁共振（P-31 NMR）和质谱分析的心脏功能与能量状态。大家好，我是来自华盛顿大学麻醉科MIT代谢研究中心的Steve Kitz。今天我将向您展示一种结合³¹P核磁共振（PNMR）光谱技术的离体心脏灌注实验操作流程。我们在实验室中使用此方法来评估生物工程小鼠模型的心脏功能和能量代谢。现在我们开始吧。首先，准备一升KRES溶液，即Krebs-Henseleit液或KH缓冲液。向混合物中通入5%二氧化碳和95%氧气的气泡，持续10至15分钟。然后加入2毫摩尔的氯化钙，随后加入底物，即10毫摩尔葡萄糖和0.5毫摩尔丙酮酸。在这些实验中，每次获取³¹P谱时同时使用两套独立的系统。一台布鲁克14 T磁体与先进的三控制台相连，并配备装有Top Spin V 2.1软件的计算机，用于评估心脏功能。一个定制的心脏灌注系统与PowerLab连接。四通道30数据采集。配备用于数据分析的 Lab Chart PRO Six 软件。心脏灌注装置包括一个由 STH 泵控制器控制的 Mini Pulse Three 蠕动泵，用于将 KH 缓冲液灌注到心脏中。在核磁共振（NMR）实验过程中，心脏温度的调控至关重要。使用加热循环器将温度维持在 37.0 至 37.5 摄氏度之间，当心脏位于磁体内部时，通过光纤温度探头在整个实验过程中持续监测温度。在整个实验过程中，通过连接到数据采集系统的压力传感器监测左心室压力和灌注压力，并使用配套软件进行显示。采用生理学传感器监测左心室压力，使用一次性血压传感器监测灌注压力。最后，通过脐带向心脏供应加热的含氧缓冲液。进入磁体后，在实验开始之前，首先使用标准水银柱压力计对压力传感器进行校准。将传感器置于无压力状态，进行零点校准。然后将该水银柱压力计充气至较高压力，将此数值输入计算机程序中。然后，通过将此 fig moment 压力计充气至已知压力，并在计算机屏幕上验证其读数，确认压力传感器已得到充分校准。压力传感器校准完成后，使用含有 150 毫摩尔磷酸钠标准样品的 10 毫米核磁共振（NMR）管对 NMR 探头进行校准。使用 TopSpin 软件程序执行校准。首先，调节样品以设定磷共振的频率。然后对样品进行匀场，以产生均匀的磁场。此初始校准有助于增强信号，并缩短开始采集信号所需的时间。将小鼠置于探针内以开始小鼠心脏提取后，向小鼠腹腔注射200单位肝素，以减少凝血。五分钟后，腹腔注射175毫克/千克戊巴比妥钠。待小鼠麻醉后，将其仰卧放置，并用胶带固定四肢，以暴露胸部区域。通过夹捏脚趾确认小鼠已完全麻醉。用剪刀切开腹腔和胸腔，用镊子掀开肋骨，暴露胸腔。用镊子夹住肺组织，用弯剪轻轻提起心脏。在心脏后方切断大血管，并缓慢向小鼠头部方向继续操作，直至心脏完全游离。立即用冰冻的KH缓冲液停止心脏活动。将器官保持在冰上，并迅速取出肺脏。辨认胸腺的叶，并轻轻将其掀开以暴露主动脉。随后去除胸腺。最后，仔细清除周围组织，分离出主动脉。使用显微缝合镊子，通常夹住主动脉的两壁以暴露管腔。然后小心地将主动脉套入导管上。导管由外径为0.965毫米的聚乙烯管制成。用微血管夹固定主动脉，并迅速在主动脉周围结扎缝线。缝线打结后，移除血管夹。使用镊子仔细检查确保套管位于主动脉根部上方。添加任何必要的缝线以固定心脏位置。使用镊子和显微剪刀去除多余的组织。然后在左心耳处做一个小切口。轻轻握住心脏，小心地将外径为0.61毫米的聚乙烯导管经左心房、左心室腔插入，并从心尖穿出。剪去多余的导管。接着，将一个未充气的注水球囊经心房插入左心室。使用胶带固定气球的位置。然后逐渐增加蠕动泵的转速，以向心脏提供足够的灌注流量。以相当于每分钟约两毫升的恒定流速持续用KH缓冲液灌注心脏，直至将心脏放入核磁共振探头中。使用微量注射器向左心室（LV）球囊注入少量液体，以验证用于核磁共振（NMR）波谱分析的左心室压力换能器是否正常工作。首先，小心地将心脏插入一支10毫米的NMR管中。在NMR管周围放置一个宽口旋转器，以帮助引导NMR管进入正确位置。在探头内，用胶带将整个装置牢固地固定在脐带上。接着，缓慢地将脐带放入磁体的上部孔径中，直至装有心脏的核磁共振（NMR）管进入10毫米NMR探头的线圈内。当心脏在探头内处于正确位置后，调节寄生泵的流量，以达到80毫米汞柱的灌注压力。通过启动泵控制器上的保持机制来维持灌注压力。让心脏经历15至20分钟的平衡期。在平衡期间，调整左心室球囊的容积，使舒张末期压力达到8至10毫米汞柱。然后优化光谱仪参数，以获得尽可能强的磷信号。通过设置射频脉冲来调节核磁共振仪器，使脉冲频率与磷原子核的共振频率一致。在平衡期结束后，对样品进行匀场，以使磁场均匀。开始采集多个磷-31核磁共振（P 31 NMR）谱图。每次谱图采集的时间取决于磁体场强、样品大小以及特定实验所需的信噪比。本实验中使用14特斯拉磁体，通过累加256次射频脉冲信号获得谱图，每次脉冲持续20微秒，翻转角为60度，脉冲间延迟时间为2.0秒。本实验大约需要10分钟。左心室发展压是评估心脏功能的常用指标，通过将收缩压减去舒张末期压力（EDP）得到。在舒张末期压力固定为8至10毫米汞柱的情况下，正常C57黑鼠的左心室发展压通常介于100至110毫米汞柱之间。图中显示了对照组和主动脉结扎小鼠的代表性压力-容积曲线。收缩功能通过左心室（LV）发育压随左心室容积增加的变化来表示，左心室容积由左心室球囊的容积确定；舒张功能通过左心室舒张末期压（EDP）随左心室容积增加的变化来表示。离体灌注小鼠心脏的磷-31核磁共振（P 31 NMR）谱图可提供磷酸肌酸（PHOSPHOCREATINE或PCR）、三磷酸腺苷（a TP）中的三个磷酸基团以及无机磷酸盐（pi）的信号。在此图谱中，无机磷酸盐（PI）峰相对较小，这是以丙酮酸或脂肪酸为底物供能的有氧灌注心脏的典型特征。除了缺血期间的葡萄糖外，该峰升高时，PCR峰则降低。我刚刚向您展示了如何准备小鼠心脏以进行灌注，从而在实验期间同时测量心脏功能和能量代谢。确保心脏得到充分灌注非常重要。否则，您的核磁共振数据将不可靠。以上就是全部内容。感谢您的关注，祝您的实验顺利成功。

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