Name: 在果蝇幼虫分部轴突在体内的突触小泡的可视化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-15T16:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: 学习利用荧光显微镜在果蝇幼虫体内实时成像GFP标记的突触小泡沿轴突微管轨道运输的技术。该方法可无损观察轴突运输动态，为研究阿尔茨海默病等神经疾病的运输缺陷提供重要工具。

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SG 获得了纽约州立大学布法罗分校和约翰·R·奥伊谢基金会的资金支持。
MK 获得了 UB 的 CURCA 颁发的学生研究奖。

1. 试剂的准备
<ol>
	<li>通过添加以下成分配制解剖缓冲液：128 mM NaCl、1 mM EGTA、4 mM MgCl2、2 mM KCl、5 mM HEPES 和 36 mM 蔗糖，定容至 1000 mL，调节 pH 至 7.2，并过滤除菌。</li>
</ol>
2. 解剖前的准备
<ol>
	<li>硅胶块：将凝胶切成约一英寸宽、一英寸长、约1厘米高的方块。解剖时将凝胶块置于载玻片上。同一凝胶块可多次使用。</li>
	<li>解剖针：解剖所用的针应特别短。微型解剖针的尖锐底部在解剖操作中效果最佳。</li>
	<li>需要一把锋利的显微解剖弹簧剪刀。</li>
	<li>需要两把尖头镊子。</li>
</ol>
3. 幼虫的收集
<ol>
	<li>收集表达GFP标记囊泡蛋白的游走期3rd 龄幼虫至培养皿中。</li>
	<li>用去离子水清洗幼虫，以去除所有食物残留。</li>
</ol>
4. 幼虫活体解剖
<ol>
	<li>将幼虫转移至载玻片上的解剖凝胶块中，用解剖缓冲液浸没幼虫。</li>
	<li>幼虫用两根细针在前端和后端固定，背侧朝上。</li>
	<li>使用显微解剖剪在靠近后端的中线处做一个小切口。从该切口处向前端方向剪开。使用两枚针将切开的角质层固定在两侧边缘。</li>
	<li>加入一滴解剖缓冲液。用镊子小心移除肠道、肠管和脂肪体。大多数情况下，这些组织在背侧切开时会自然流出。</li>
	<li>更换为新鲜的解剖缓冲液。幼虫切勿暴露在空气中，应始终浸没在解剖缓冲液中。</li>
	<li>使用以下孵育方法 在体 此时使用 MitoTracker 或 LysoTracker 标记，通过稀释 在体 在解剖缓冲液中加入标记物。孵育结束后 体内 用新鲜的解剖缓冲液对解剖后的幼虫进行多次清洗（快速清洗5次）。</li>
	<li>更换最后一次洗涤液后，立即将细针插入硅胶中，并加盖盖玻片。此时幼虫已准备好用于观察。</li>
</ol>
5. 解剖后幼虫的活体成像
<ol>
	<li>将盖玻片和凝胶置于倒置显微镜的载物台上进行成像。</li>
	<li>我们使用100倍镜对幼虫节段神经内标记的囊泡进行成像。首先评估腹神经节细胞体中的GFP表达，然后对节段神经进行成像。若在腹神经节细胞体中观察到强烈的GFP染色，则对该神经进行成像并用于后续分析。</li>
	<li>使用配备 CFP/YFP 或 RFP/YFP 滤光片的双视图系统及分光成像软件，可同时对两种标记蛋白进行成像 在体.</li>
</ol> 
6. 代表性结果
<img src="/files/ftp_upload/2151/2151fig1.jpg" alt="显示蛋白质沿细胞结构分布的荧光显微镜图像，比例尺为 10 µm。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 图 1：显示幼虫节段神经中多条轴突轨迹上存在大量轴突囊泡的代表性图像。 注意 GFP 的斑点状信号，代表轴突中的聚集物。
<img src="/files/ftp_upload/2151/2151fig2.jpg" alt="10 µm 比例尺下显示神经元轴突内荧光标记的显微镜图像，荧光显微技术。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2：显示幼虫节段神经中单根轴突轨迹及多个轴突囊泡的代表性图像。

<ol><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Hurd, D. D., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+mutations+cause+motor+neuron+disease+phenotypes+by+disrupting+fast+axonal+transport+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila.</a> Genetics. 144, 1075-1085 (1996).</li>
<li>Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+axonal+transport+by+loss+of+huntingtin+or+expression+of+pathogenic+polyQ+proteins+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila.</a> Neuron. 40, 25-40 (2003).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

体内成像技术可用于观察果蝇幼虫体节神经中突触小泡的运输过程，是研究轴突运输机制的有力工具。我们此前已利用该方案评估表达扩展多聚谷氨酰胺（polyQ）重复序列的幼虫神经中的运输动力学，以阐明重复序列的扩增如何影响小泡运输的动力学特征3。通过本方案，可将视频流转换为线描图（kymograph），从而测定小泡运动的速度。利用遗传学手段，可通过特异性的GAL4驱动子驱动GFP表达，从而在单个或多个轴突中可视化GFP标记的小泡运输。此外，还可观察携带特定基因突变的幼虫中运输动力学的变化。进一步地，可同时可视化两种分别标记了不同GFP变体（CFP或RFP）的小泡。

<table><tbody><tr><td>1 对显微解剖剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>弹簧剪刀 &amp;#8211; 6 mm 刀片，0.125 mm 尖端直径</td></tr><tr><td>2 对镊子</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Fisherbrand 显微解剖有齿尖镊</td></tr><tr><td>一盒解剖针</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>Minutien 针，直径 0.1 mm</td></tr></tbody></table>

在体 突触小泡的可视化 果蝇 幼虫节段性轴突

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

阐明轴突运输机制对于确定长距离运输缺陷如何影响不同神经系统疾病具有重要意义。这一基本过程中的缺陷可能对神经元功能和发育产生有害影响。我们开发了一种解剖方案，旨在暴露Drosophila幼虫体节神经以实时观察轴突运输。我们对该活体成像方案进行了改进，原始方案由 Hurd 和 Saxton（1996）发表，用于幼虫体节神经的免疫定位。精细的解剖操作和合适的缓冲液条件对于最大限度延长离体幼虫的存活时间至关重要。若操作得当，在生理条件下，离体幼虫可维持强烈的小泡运输达 2–3 小时。我们采用 UAS-GAL4 方法1使用不同的神经元GAL4驱动子，可在幼虫节段神经的单个或多个轴突中表达GFP标记的APP或突触结合蛋白囊泡。在观察前，也可将其他荧光标记物（例如线粒体染料MitoTracker或溶酶体染料LysoTracker）应用于幼虫。利用不同波长可同时观察GFP囊泡的运动和颗粒的运动。

本实验方案介绍了对黑腹果蝇（Drosophila）幼虫进行活体解剖的操作，旨在对沿微管轨道运动的GFP标记轴突囊泡进行成像观察。

阐明轴突运输的机制对于确定长距离运输缺陷如何影响不同细胞功能已显示出极为重要……

为了研究阿尔茨海默病或亨廷顿病等神经系统疾病中是否存在长距离轴突运输缺陷。在活体食管幼虫中对运输囊泡的轴突运输进行成像。此处为疑问。表达GFP标记的Sical蛋白的三龄幼虫在凝胶立方体上解剖，随后转移至显微镜下进行活体成像。利用荧光显微镜追踪轴突内的Sical蛋白运输过程。该技术相较于现有方法的主要优势在于能够直观观察突触囊泡及幼虫轴突的活体、未受干扰的运动过程。准备解剖操作前，请确保以下耗材和试剂已备齐：解剖缓冲液，以及一个尺寸为1英寸宽、1英寸长、1厘米高的琼脂糖块，将其放置在载玻片上。超短解剖针。手动解剖针的尖锐底部在解剖操作中效果最佳。可通过将较长的针插入凝胶中，并剪去露出部分，以获得合适的长度。您还需要一把锋利的显微解剖弹簧剪，以及两把尖头镊子。使用小金属刮铲将表达GFP标记的SLE蛋白的三龄星形幼虫转移至培养皿中。接下来，向培养皿中的幼虫加入去离子水以去除所有食物。然后用镊子将它们转移至解剖凝胶块上进行活体解剖。使用镊子将一条幼虫转移至解剖凝胶块上。在载玻片上加入解剖缓冲液，使组织浸没其中。接着，将幼虫腹面朝下，用固定针在前后两端固定。使用显微解剖剪，在靠近后端的中线位置做一个小切口。从该切口开始，再向前方做另一个切口。利用两枚大头针使肠道和脂肪体流出。将切开的体壁固定在蜡盘的侧缘。使用移液枪加入一滴解剖缓冲液。然后用镊子小心去除肠道和脂肪体。将一张吸水纸巾接触幼虫的一侧以吸除缓冲液，同时用移液枪加入新鲜的解剖缓冲液。熔岩状物质应始终保持湿润。若需标记熔岩状物质中的线粒体或溶酶体结构，可将解剖缓冲液替换为含有线粒体示踪剂（mito tracker）或溶酶体示踪剂（lyo tracker）的解剖缓冲液。将解剖用组织块置于方形湿盒中，并用铝箔覆盖。室温孵育10分钟。体内标记孵育结束后，反复用移液器吸除幼虫周围的解剖缓冲液，并加入新的解剖缓冲液。重复此步骤五次，以洗去残留的标记物。更换最后一次洗涤液后，将针完全推入 S 型护罩中，并立即加盖盖玻片，以防止幼虫移动。此时幼虫已准备好进行观察，可对解剖后的幼虫进行活体成像。将样品置于倒置显微镜载物台上，以观察标记的囊泡。在幼虫的节段神经内。使用100倍物镜进行成像。如果绿色荧光蛋白（GFP）染色信号较强，则可在腹神经节图像的细胞体以及节段神经中观察到；利用双视图系统，配合C-F-P-Y-F-P或R-F-P-Y-F-P滤光片及分屏软件，可同时观察两种活体标记的蛋白质。在此延时系列中，可见幼虫节段神经内的多条轴突轨道上存在大量轴突囊泡。请注意，代表轴突聚集的绿色荧光蛋白（GFP）也显示出囊泡的双向运动。此处显示的是幼虫节段神经中单条轴突轨道上轴突囊泡的运动。需要注意的是，这些囊泡的双向运动平均速度为每秒一微米。观看本视频后，您应能够很好地掌握如何完成干净的解剖，以便在活体条件下观察标记了GFP的囊泡以及幼虫轴突中的gsof。

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科研

JoVE Journal

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神经科学

在果蝇幼虫分部轴突在体内的突触小泡的可视化

我们利用共聚焦显微镜结合荧光染料，在一种新型的活体果蝇幼虫“内向外”组织制备中，描述了胶质细胞-神经肌肉突触的结构特征。我们使用标记荧光的抗辣根过氧化物酶（HRP）一抗对活神经元末梢进行标记，同时利用荧光葡聚糖对突触周围间隙进行可视化观察。...

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