在体 突触小泡的可视化 果蝇 幼虫节段性轴突
2010年10月15日
本实验方案介绍了对黑腹果蝇（Drosophila）幼虫进行活体解剖的操作，旨在对沿微管轨道运动的GFP标记轴突囊泡进行成像观察。
为了研究阿尔茨海默病或亨廷顿病等神经系统疾病中是否存在长距离轴突运输缺陷。在活体食管幼虫中对运输囊泡的轴突运输进行成像。此处为疑问。
表达GFP标记的Sical蛋白的三龄幼虫在凝胶立方体上解剖，随后转移至显微镜下进行活体成像。利用荧光显微镜追踪轴突内的Sical蛋白运输过程。该技术相较于现有方法的主要优势在于能够直观观察突触囊泡及幼虫轴突的活体、未受干扰的运动过程。
准备解剖操作前，请确保以下耗材和试剂已备齐：解剖缓冲液，以及一个尺寸为1英寸宽、1英寸长、1厘米高的琼脂糖块，将其放置在载玻片上。
超短解剖针。手动解剖针的尖锐底部在解剖操作中效果最佳。可通过将较长的针插入凝胶中，并剪去露出部分，以获得合适的长度。
您还需要一把锋利的显微解剖弹簧剪，以及两把尖头镊子。使用小金属刮铲将表达GFP标记的SLE蛋白的三龄星形幼虫转移至培养皿中。
接下来，向培养皿中的幼虫加入去离子水以去除所有食物。然后用镊子将它们转移至解剖凝胶块上进行活体解剖。使用镊子将一条幼虫转移至解剖凝胶块上。
在载玻片上加入解剖缓冲液，使组织浸没其中。接着，将幼虫腹面朝下，用固定针在前后两端固定。使用显微解剖剪，在靠近后端的中线位置做一个小切口。
从该切口开始，再向前方做另一个切口。利用两枚大头针使肠道和脂肪体流出。将切开的体壁固定在蜡盘的侧缘。
使用移液枪加入一滴解剖缓冲液。然后用镊子小心去除肠道和脂肪体。将一张吸水纸巾接触幼虫的一侧以吸除缓冲液，同时用移液枪加入新鲜的解剖缓冲液。
熔岩状物质应始终保持湿润。若需标记熔岩状物质中的线粒体或溶酶体结构，可将解剖缓冲液替换为含有线粒体示踪剂（mito tracker）或溶酶体示踪剂（lyo tracker）的解剖缓冲液。将解剖用组织块置于方形湿盒中，并用铝箔覆盖。
室温孵育10分钟。体内标记孵育结束后，反复用移液器吸除幼虫周围的解剖缓冲液，并加入新的解剖缓冲液。重复此步骤五次，以洗去残留的标记物。
更换最后一次洗涤液后，将针完全推入 S 型护罩中，并立即加盖盖玻片，以防止幼虫移动。此时幼虫已准备好进行观察，可对解剖后的幼虫进行活体成像。将样品置于倒置显微镜载物台上，以观察标记的囊泡。
在幼虫的节段神经内。使用100倍物镜进行成像。如果绿色荧光蛋白（GFP）染色信号较强，则可在腹神经节图像的细胞体以及节段神经中观察到；利用双视图系统，配合C-F-P-Y-F-P或R-F-P-Y-F-P滤光片及分屏软件，可同时观察两种活体标记的蛋白质。
在此延时系列中，可见幼虫节段神经内的多条轴突轨道上存在大量轴突囊泡。请注意，代表轴突聚集的绿色荧光蛋白（GFP）也显示出囊泡的双向运动。此处显示的是幼虫节段神经中单条轴突轨道上轴突囊泡的运动。
需要注意的是，这些囊泡的双向运动平均速度为每秒一微米。观看本视频后，您应能够很好地掌握如何完成干净的解剖，以便在活体条件下观察标记了GFP的囊泡以及幼虫轴突中的gsof。
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概述
本方案介绍了用于成像微管轨道上GFP标记的轴突囊泡运动的果蝇幼虫活体解剖技术。该技术可实现对幼虫轴突内突触囊泡的活体、未受干扰运动的可视化观察。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 成像技术
背景
- 轴突运输对神经元功能至关重要。
- 轴突运输缺陷与神经系统疾病相关。
- 果蝇幼虫是研究这些过程的模式生物。
- 荧光显微镜可实现对囊泡运动的实时观察。
研究目的
- 研究长距离轴突运输中的缺陷。
- 理解这些缺陷在神经系统疾病中的意义。
- 利用活体成像技术实现更佳的观察效果。
使用的方法
- 解剖表达GFP标记蛋白的黑腹果蝇幼虫。
- 将解剖后的幼虫转移至凝胶立方体中以保持稳定。
- 利用荧光显微镜进行活体成像。
- 追踪轴突内囊泡的运输过程。
主要结果
- 在活体幼虫中成功实现轴突运输的可视化。
- 展示GFP标记囊泡的运动过程。
- 揭示突触囊泡运输的动力学特征。
- 与现有方法的比较突显了该方法的优势。
结论
- 该方案为研究轴突运输提供了有价值的工具。
- 活体成像可揭示神经元功能的关键信息。
- 该方法可用于研究多种神经系统疾病。
常见问题
行业重要性概述
理解轴突运输动态对于降低神经退行性疾病靶点的风险至关重要，因为囊泡运输缺陷在机制上与阿尔茨海默病、亨廷顿病和肌萎缩侧索硬化症（ALS）相关。该果蝇幼虫轴突模型可实现突触囊泡运动的实时可视化，为早期靶点验证和机制研究提供了一种具有预测性和疾病相关性的系统。通过量化囊泡的双向流动及运输速率，该方法可支持以轴突完整性为重点的临床前研究项目的决策。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过在活体轴突中可视化GFP标记的APP或突触结合蛋白囊泡运输，验证治疗假设。
- 操作价值：在基因可操控系统中直接观察囊泡动态，实现功能靶点的验证。
- 预测价值：通过将运输缺陷与疾病模型中的神经元功能障碍关联，支持机制层面的风险评估。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：通过在生理条件下建立囊泡运动的基线，制备经过验证的轴突系统，用于化合物筛选。
- 操作价值：提供囊泡运动的定量、可重复的读数（例如，1 µm/s 的双向流动），以实现检测标准化。
- 战略价值：支持可扩展且与平台兼容的成像工作流程，用于评估化合物对轴突运输的影响。
转化与临床前研究
- 科学价值：通过模拟在人类神经退行性疾病中观察到的运输缺陷，与疾病相关系统保持一致。
- 操作价值：通过对完整幼虫神经中囊泡运输进行活体成像，实现从发现到临床前验证的连续性。
- 风险缓解：通过量化候选调节剂对运输功能的挽救或加剧效应，为推进决策提供依据。
流程与工作流整合
该方法适用于从发现到临床前研究的连续过程，支持在早期发现阶段进行假设验证、在筛选阶段进行检测准备，以及在临床前阶段进行机制验证。
- 发现生物学：通过可视化遗传或药物干扰下囊泡运输的情况，支持通路阐明和生物学脱靶风险的降低。
- 筛选：通过标准化的解剖、染色和成像方案，实现检测就绪，获得一致的囊泡运动性指标。
- 分析：生成定量的因变量测量结果（如速度、方向性、流量），支持不同实验条件间的比较。
- 转化研究：通过模拟与人类神经系统疾病相关的轴突运输缺陷，连接临床前研究的连续性。
- 企业级复用：建立可重复使用的成像平台，用于跨多个靶点类别的轴突完整性长期研究。
运营与企业影响
- 科学价值：通过直接可视化突触囊泡动态，实现对靶点验证的预测性信心。
- 操作价值：通过明确定义的解剖缓冲液条件和成像参数，实现标准化与可重复性。
- 战略价值：通过降低轴突运输假说中的机制模糊性，改善“推进/中止”决策。
- 项目组合影响：基于在疾病相关模型中运输功能恢复的有效性，对靶点进行风险调整后的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备果蝇操作、显微解剖和荧光显微镜技术方面的专业知识。
- 依赖于配备100倍物镜、双视系统以及适用于GFP和其他荧光染料的滤光片组的倒置显微镜。
- 需要对解剖缓冲液、幼虫发育阶段以及环境控制（如加湿培养室、温度）进行标准化处理。
- 适应性考虑包括通过神经元GAL4驱动子表达不同GFP标记的货物（如线粒体、溶酶体）。
- 实际限制因素包括幼虫制备时间以及解剖后2–3小时内稳定的囊泡运输观察窗口。
