通过体细胞核移植技术获得的针对Toxoplasma gondii具有预定义T细胞受体特异性的转基因核小鼠

携带抗原特异性T细胞受体的转基因小鼠在T细胞发育和功能研究中不可或缺，可通过体细胞核移植（SCNT）技术建立具有预定T细胞受体特异性的小鼠模型。将目标病原体感染小鼠，从小鼠中分离T细胞，再通过荧光激活细胞分选法进行纯化。

纯化的T细胞随后用于体细胞核移植。当胚胎发育至囊胚阶段后，分离获得胚胎干细胞。然后将这些细胞注射到囊胚中，再将囊胚移植至假孕小鼠体内。

获得的幼鼠中，目标T细胞群体数量显著增加，可通过PAX分析进行验证。大家好，我是Okta AK，就职于怀特生物医学研究所，担任博士后研究员。今天我将向大家演示如何进行体细胞CLE转移囊胚辅助注射以及胚胎移植操作。

体细胞转移的主要优势在于可以生成T细胞受体由内源性基因座表达的小鼠模型，因此其表达受内源性启动子调控，并且这类小鼠模型能够被快速构建。体细胞液相转移可作为一种工具，用于构建具有预定义T细胞受体或B细胞受体特异性的小鼠模型。这对于从事自身免疫、感染性疾病和癌症等领域研究的科研人员具有特别重要的意义。

为了分离针对弓形虫（Toxoplasma）等病原体的特异性T细胞，需在免疫反应高峰期通过腹腔注射感染小鼠。安乐死后从小鼠体内分离脾脏，将脾组织匀浆并分离供体细胞，然后与荧光标记的抗体及相应四聚体（tetramer）共同孵育。最后通过流式分选获得病原体特异性的T细胞。该操作需在卵母细胞去核实验的前一晚进行。

使用注射器将汞逆向注入，制备直径为4、5和7微米的Piso注射针。次日，通过收集卵母细胞开始体细胞核移植实验流程，然后用口吸管将卵母细胞转移至培养皿中的K-S-O-M-A-A培养基液滴中。培养皿的盖子内。

通过放置约10滴PVP来准备用于进行体细胞核移植（SCNT）的aate。另准备约10滴含有5微克/毫升细胞松弛素B的HCZB，以及约10滴含有2.5微克/毫升细胞松弛素B的HCCB。此培养板将被称为S-C-N-T-A板。将S-C-N-T-A板置于倒置复合显微镜的载物台上。

接下来，将一根7微米的去核针插入显微操作仪中，并通过吸取并弃去PVP溶液5到10次进行清洗。然后，将10至30个处于第二次减数分裂中期停滞的卵母细胞从培养皿转移到S-C-N-T-A板上的一个含有5微克/毫升细胞松弛素B的HCCB液滴中，在室温下孵育5分钟。孵育期间，将卵母细胞水平排列整齐。

五分钟后，使用去核针将一枚卵母细胞置于持卵针前方。利用显微注射仪施加负压，使卵母细胞固定在显微毛细管持卵针上。

接下来，使用去核针，将卵母细胞旋转，直至染色体纺锤体复合物（与卵浆相比呈现高度透明）位于3点钟位置，然后踩下踏板启动压电脉冲，以穿透透明带。压电脉冲是一种沿纵向传播的机械脉冲，可使去核针尖端产生振动，该振动有助于钻穿透明带。

穿过透明带后，将成核针的开口置于靠近第二次减数分裂中期纺锤体的位置，并施加负压。染色体纺锤体复合物将缓慢进入针内。一旦移出针头，细胞膜应自行闭合。

最后，使用口吸管将去核的胞质体转移回 K-S-O-M-A-A 液滴中。然后使用同一根吸管，通过将胞质体在各 KSOM AA 液滴间依次转移进行洗涤。为进行核移植，将显微操作仪上的七微米去核针更换为四至五微米的核移植针。用 PVP 如前所述清洗该针头。

将之前分离的CD8阳性T细胞放入S-C-N-D-A板上的一滴PVP中。充分混匀，并在室温下孵育至少10分钟。随后，将10至30个去核细胞转移至含有2.5微克/毫升HCZB的一滴溶液中。

在S ct. A板上加入细胞松弛素B（Cyto B），于室温孵育5分钟。孵育期间，使用核移植针配合注射针将细胞水平排列。

从PVP培养基中挑取一个供体CD8阳性细胞，反复吸入和推出，直至其外膜破裂。如有必要，施加压电脉冲，此时应可见膜碎片和细胞质碎片。将细胞核吸入针头中。

然后继续吸取细胞核，直至达到10到30个。接着移至含有排列好的去核卵母细胞的液滴中。施加负压，使一个卵母细胞固定在持卵针上。

然后将核移植针置于透明带旁，针尖朝向远离开口的方向，并使细胞核朝外。施加压电脉冲，直至针尖穿过透明带。推动显微操作仪，小心地将一个细胞核移至针尖处。

将针头推入卵母细胞，直至针尖进入约三分之二深度。施加轻微的负压，使少量卵母细胞膜进入针内。下一步非常关键。

由于这是卵母细胞真正处于开放状态的唯一时机，施加一次ZO脉冲，然后施加正压将细胞核从针尖推出。

小心回拉针头，使针尖位于卵母细胞内的深度约为卵母细胞直径的三分之一，然后施加负压并继续缓慢抽出针头，以封闭卵母细胞。每个卵母细胞均需重复此步骤。

待所有卵母细胞完成核移植后，将其转移至培养皿中，并通过在不同液滴的KS OM AA培养基之间转移进行洗涤，随后在37°C条件下孵育至少30分钟。孵育结束后，将SCN T胚胎转移至含有氯化锶的无钙激活培养基液滴中。氯化锶可通过诱导钙离子振荡来激活卵母细胞，该过程与受精过程中自然发生的钙振荡相似。

孵育六小时。如需要，可在激活培养基中添加TSA（曲古抑菌素A），这是一种组蛋白去乙酰化酶的非特异性抑制剂，以提高激活后的效率。激活后，将胚胎置于倒置显微镜下观察，以确定假原核（PPN）阳性体细胞核移植（SCNT）胚胎的数量。PPN可根据其形态特征进行识别。

它们看起来像鸡蛋。将受精卵进行卵裂期培养，置于KSOM-A液滴中，在37摄氏度下培养三天半，直至发育至囊胚阶段。

最初，您应专注于正确执行我们刚刚向您展示的成核及核移植操作。一旦掌握了这些技术，后续的操作将更容易掌握。此处使用的胚胎干细胞（ES细胞）是采用标准技术获得的。

这些操作应在合子后第3.5天进行囊胚辅助注射当天准备。通过在无菌细菌培养皿盖上滴加含有PVP和HCZP的液滴来准备皿盖。然后，像之前一样准备一支15微米的注射针用于皮秒脉冲。

接着，将注射针放入显微操作仪中，并用PVP转移液冲洗。向一滴HCZB中注入10至30次爆破辅助液。然后，将5至50微升的ESL悬浮液放入另一滴HCZB中。

ES 细胞的数量应足够多，以便于轻松吸取，但不应过于密集。接下来，用注射针吸取 30 至 100 个 ES 细胞。然后在囊胚辅助液滴中进行操作。

将囊胚辅助装置水平对齐，并用持针固定住，同时施加负压。使用注射针旋转囊胚辅助装置，使内细胞团位于九点钟位置。将注射针置于三点钟位置。

确保针尖处无胚胎干细胞，施加皮秒脉冲，直至注射针穿过透明带和三合体进入胚泡腔。释放5至15个胚胎干细胞，使其附着于内细胞团。注射完成后，继续操作直至所有胚泡均完成注射。

用 K-S-O-M-A-A 溶液洗涤两次，然后将胚胎转移至假孕雌性小鼠体内。将麻醉后的假孕受体雌鼠置于手术区域，使用电动剃毛器去除右下腹象限的毛发。在解剖显微镜下，用含碘溶液和 70% 乙醇对该区域进行消毒。

使用剪刀切开皮肤，然后将闭合的剪刀置于皮肤与腹膜之间，打开剪刀以分离腹膜与皮肤。透过腹膜定位卵巢，卵巢应呈现为红色斑点。随后用剪刀在该区域切开腹膜。

用镊子小心夹住子宫颈或其周围的脂肪组织，用连接口吸管的毛细管将子宫拉出。用镊子夹住输卵管和子宫，挑取约10个囊胚。用针在子宫上刺一个小孔。

然后将带有吹气辅助的毛细管插入子宫腔并释放。将子宫推回腹腔内。找到腹膜边缘，用几针缝合关闭。

用几枚皮钉闭合小鼠的皮肤。皮下注射镇痛药物。然后将小鼠放回其笼中，并置于加热灯下。

在 enucleation 和体细胞核移植后，监测小鼠的呼吸，直到其苏醒。约 70% 的胚胎显示出假原核阳性。

如图所示，使用 TSA 处理 6 小时或 10 小时均无影响。培养三天半后，有 5% 至 10% 的胚胎发育为囊胚。

同样，添加TSA对囊胚辅助发育速率没有影响。随后利用SCNT囊胚辅助建立胚胎干细胞。TSA显著提高了从囊胚辅助中获得ESL的效率。

S-C-N-T-E-S 细胞用于生成嵌合小鼠。采集这些小鼠的血液，并通过此处所示的流式细胞分析检测特定T细胞的存在。当血液用抗CDA抗体和特异性四聚体染色时，可鉴定出双阳性细胞群。

这表明用于体细胞核移植（SCNT）的供体细胞具有正确的特异性。我刚刚向您演示了如何进行体细胞核移植、辅助孵化注射以及胚胎移植。需要考虑的最重要因素是T细胞或B细胞的纯度。

一旦您掌握了体细胞移植技术，并且您的胚胎已发育至囊胚阶段，您可以选择将胚胎直接移植到假孕雌鼠体内，或者利用这些胚胎分离胚胎干细胞并产生嵌合小鼠。