Name: 与预先定义的T细胞受体特异性Transnuclear小鼠对弓形虫获得通过体细胞核移植 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: 了解体细胞核移植技术在小鼠模型构建中的应用，通过FACS分离Toxoplasma gondii特异性T细胞，建立表达内源性T细胞受体的转基因小鼠，用于研究自身免疫、感染性疾病和癌症中的T细胞应答机制。

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作者感谢 H. Eisen、M. Gubbels、K. van Grinsven、E. Guillen、A. Drake、V. Mahajan、Q. Gao 和 G. Yap 在富有成效的讨论和试剂方面提供的帮助。我们感谢 J. Dausman、R. Flannery 和 J. Jackson 在小鼠品系管理方面的协助。我们感谢 P. Wisniewski 进行 FACSorting 实验。EMF 获得人类前沿科学计划的支持。R.J. 获得美国国立卫生研究院基金 RO1-HD045022 和 R37-CA084198 的资助。HLP 获得美国国立卫生研究院基金的资助。

本方法已用于所报道的研究中 <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/328/5975/243">基拉克 等，科学 328 (5975)，243-248 (2010)</a>.
1. 供体细胞的分离
在使用特异性的 T 细胞或 B 细胞作为供体细胞构建转基因小鼠模型之前，需要先用感兴趣的病原体感染小鼠，或用感兴趣的抗原进行免疫。由于我们使用了针对Toxoplasma gondii的 CD8+ T 细胞，以下方案将描述这些细胞的制备与分离过程，并需根据研究者的具体需求进行相应调整。
<ol>
 <li>将来源于小鼠脑匀浆（约40个）的包囊经腹腔注射至BL/6 × Balb/c F1（B6CF1）小鼠体内，以分离出受H-2b和H-2d限制的CD8+ T细胞。</li>
 <li>在免疫反应高峰期，处死感染小鼠，取出脾脏并置于含有6 mL红细胞（RBC）裂解缓冲液的培养皿中。</li>
 <li>使用两张载玻片的磨砂面轻轻研磨脾脏，并在RBC裂解缓冲液中于室温孵育5分钟。</li>
 <li>加入14 mL PBS，将细胞悬液通过细胞滤器（40或70 μm）过滤至50 mL离心管中，以300g离心5分钟。</li>
 <li>吸除上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL PBS中，转移至1.5 mL离心管，以300g离心5分钟，随后吸除上清液。</li>
 <li>将细胞沉淀重悬于50 μL PBS中，加入荧光标记的抗体以鉴定目标细胞类型（如CD3、B220、CD8和CD4），以及负载目标肽段的荧光标记MHC-I四聚体（CD4 T细胞使用MHC-II四聚体），混匀后于4°C孵育30分钟。</li>
 <li>加入1 mL PBS，以300 g离心5分钟，将沉淀重悬于3 mL PBS中，并通过细胞滤器（40或70 μm）过滤至新管中。</li>
 <li>严格设定分选门进行FACS分选（见图1B）。</li>
</ol>
2. 体细胞核移植
体细胞核移植有几种实验方案。此处描述的方法利用停滞在减数第二次分裂中期（Metaphase-II）的卵母细胞，并使用细胞松弛素B抑制第二次减数分裂，因此需要处于G0/G1期的供体细胞。
<ol>
 <li>卵母细胞的制备
 <ol>
 <li>BDF1 背景的雌性小鼠在下午5点至7点期间通过腹腔注射每只5 IU PMS。</li>
 <li>约47小时后，每只小鼠腹腔注射5 IU HCG。</li>
 <li>在hCG注射当天，准备用于卵母细胞的培养皿（KSOM-AA液滴覆以矿物油），并将其放入培养箱中 37°C，5% CO2。同时，准备好用于体细胞核移植（SCNT）所需的针具（7μm 用于去核及4或 5μm 通过汞处理来加载淋巴细胞核以进行核移植。</li>
 <li>安乐死小鼠，并在hCG注射后约13小时（大约上午8点）分离输卵管。将输卵管收集至1-2滴HCZB液滴中。</li>
 <li>逐一将输卵管移入含有M2培养基与透明质酸酶的液滴中。用镊子小心地在输卵管上剪开切口，并将卵母细胞-卵丘细胞复合体移入液滴中。待所有卵母细胞-卵丘细胞复合体分离完成后，将培养皿置于 37°C.</li>
 <li>孵育2-5分钟（具体时间取决于透明质酸酶的批次）后收集卵母细胞，用HCZB洗涤，并移入KSOM-AA液滴中培养。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>卵母细胞去核
 <ol>
 <li>使用培养皿的皿盖制备SCNT板。安装显微镜和显微操作仪。</li>
 <li>清洗去核针（7 μm在开始去核之前，将样品置于PVP中。</li>
 <li>去核时，将一组卵母细胞（10–30个）放入含有细胞松弛素B的HZCB液滴中5 μg/mL）。孵育期间（至少5分钟），将卵母细胞水平排列。</li>
 <li>取一枚卵母细胞并将其置于持卵针前方。通过施加负压将卵母细胞固定在持卵针上。使用去核针将卵母细胞旋转，直至染色体-纺锤体复合物（CSC，常称为“细胞核”）位于3点钟位置。</li>
 <li>使用压电脉冲小心穿透透明带，避免损伤卵母细胞。将针头开口置于第二次减数分裂中期纺锤体旁并施加负压。细胞核应缓慢吸入针内，完全移出后膜结构应自行闭合。</li>
 <li>将去核的卵母细胞转移回 KSOM-AA 液滴中，并多次洗涤。使用新的一组卵母细胞重复去核步骤。持续操作直至所有卵母细胞完成去核，或直至约上午11点。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>核移植
 <ol>
 <li>对于核移植，更换去核针（7 μm）和核移植针（4 或 5 μm）并用PVP洗涤。</li>
 <li>将目标细胞（例如 CD8+ T 细胞）放入含聚乙烯吡咯烷酮（PVP）的液滴中，充分混匀，孵育至少 10 分钟。</li>
 <li>将一组去核卵母细胞（10–30个）放入含有细胞松弛素B的HCZB液滴中2.5 μg/mL）。在孵育期间（至少5分钟），使用核移植针将卵母细胞水平排列。</li>
 <li>从PVP-细胞悬液中吸取一个供体细胞，并反复吸入-推出，直至细胞外膜破裂（应可见膜碎片和细胞质）。如有必要，可施加压电脉冲。一旦细胞核被分离出来，将其在针头内稍向上移动，继续吸取细胞核，直至获得10-30个。</li>
 <li>移动至含有排列好的去核卵母细胞的液滴中。用持卵针通过施加负压固定一个卵母细胞。将核移植针（细胞核应远离针尖开口）置于透明带旁，施加压电脉冲，直至针尖穿过透明带。小心地将一个细胞核移至针尖处，推动针进入卵母细胞，使针尖约有三分之二进入细胞内。施加轻微的负压，使少量卵母细胞膜进入针内。</li>
 <li>下一步非常关键，因为这是卵母细胞实际处于“开放”状态的唯一时刻。施加一次压电脉冲，通过施加正压将细胞核从针尖推出，小心回拉针尖，使其末端约三分之一仍位于卵母细胞内，随后施加负压并继续回拉针管以使卵母细胞闭合。每个卵母细胞均需重复此步骤。</li>
 <li>待所有卵母细胞完成注核后，将其洗涤并置于KSOM-AA培养基中培养。对全部卵母细胞重复此操作步骤。</li>
 <li>在最后一组完成于 KSOM-AA 中至少培养 30 分钟后，将 SCNT 胚胎转移至含有 SrCl2 的无钙激活培养液液滴中。</li>
 <li>激活6小时后，检测假原核（PPN）阳性体细胞核移植（SCNT）胚胎的数量。随后将胚胎洗涤，并在KSOM-AA液滴中继续培养3.5天，直至发育至囊胚阶段。</li>
 <li>可根据需要将特定药物或化学物质（如曲古抑菌素 A）加入激活和培养培养基中。</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
3. 胚胎干细胞的衍生
SCNT囊胚可用于移植到假孕雌性动物体内（也称为直接克隆或一步法克隆），或用于建立胚胎干细胞系（也称为间接克隆或两步法克隆）。由于生成胚胎干细胞的效率更高，我们选择两步法程序。如果研究人员希望进行直接克隆，可按照第5节所述，将囊胚直接移植到假孕雌性动物体内。
已有许多关于胚胎干细胞分离的实验方案。此处所述为一种标准技术，该技术利用饲养层细胞和胎牛血清。
<ol>
 <li>核移植后的第二天，准备一个96-U-孔板用于胚胎干细胞（ES细胞）的分离。</li>
 <li>向96-U-孔板的每个孔中加入100 μL明胶，孵育至少10分钟，之后吸除。</li>
 <li>解冻饲养细胞，并用适当体积的ESD培养基重悬，例如，相当于25 cm2面积的饲养细胞重悬于10 mL ESD培养基中，将200 μL细胞悬液加入每个经明胶处理的孔中。</li>
 <li>将培养板放入培养箱，在37°C、5% CO2条件下培养。</li>
 <li>3.5天后，胚胎应发育至囊胚阶段。</li>
 <li>通过在无菌细菌培养皿中加入数滴ES细胞培养基和酸性泰罗德液（acidic thyrode）来准备该培养皿。</li>
 <li>先将囊胚从KSOM-AA液滴转移至含常规ES细胞培养基的液滴中，并清洗两次。</li>
 <li>小心地将一组囊胚（5–10个囊胚）转移至一滴酸性泰罗德液中，并保持在此液滴中，直至透明带完全溶解。</li>
 <li>随后将囊胚转移至含有ES培养基的液滴中，清洗两次，然后放入已涂有饲养层的96-U-孔板中（每个孔放入一个囊胚）。</li>
 <li>将胚胎在培养箱中于37°C、5% CO2条件下继续培养5–7天，期间避免扰动。此过程使胚胎有足够时间附着于饲养层并形成外延生长。</li>
 <li>通过将饲养细胞以ESD培养基接种至24孔板的每个孔中来准备该板，例如，将相当于50 cm2面积的饲养细胞重悬于12 mL ESD培养基中，每孔加入500 μL细胞悬液。</li>
 <li>小心吸除含有胚胎的96-U-孔板中的ESD培养基，每孔用250 μL HEPES（或PBS）清洗两次，加入50 μL胰蛋白酶，在37°C孵育约5分钟。</li>
 <li>反复吹打数次，直至外延生长组织完全解离为单细胞悬液，转移至24孔板中，并在37°C、5% CO2条件下培养。</li>
 <li>若胚胎干细胞分离成功，则在7–10天后应可见胚胎干细胞克隆。</li>
</ol>
4.囊胚注射
囊胚注射是一种用于构建各种转基因小鼠模型的常规技术。需要强调的是，囊胚注射以及随后向假孕雌鼠的移植操作必须把握好时机。
<ol>
 <li>按照第2.1节所述，使用PMS和HCG对雌性小鼠进行超排处理。注射HCG后，将雌性小鼠与雄性小鼠合笼（每笼一只雌鼠和一只雄鼠）。</li>
 <li>次日检查雌鼠阴道栓情况。此日记为0.5 dpc（交配后天数）。</li>
 <li>随后按照第2.1节所述从输卵管中分离受精胚胎，并在KSOM-AA培养基中继续培养3天。</li>
 <li>在囊胚注射当天（3.5 dpc）准备ES细胞。</li>
 <li>吸除ES细胞培养基，用Hepes（或PBS）洗涤两次，加入胰蛋白酶，于37°C孵育5分钟。</li>
 <li>用ES细胞培养基重悬消化后的细胞，接种至培养皿中，于37°C、5% CO2条件下孵育45–60分钟，以减少饲养层细胞数量（饲养层细胞贴壁速度比ES细胞快）。</li>
 <li>将细胞悬液通过细胞滤网（40或70 μm）转移至离心管中，以1000 rpm离心5分钟。</li>
 <li>弃上清，将细胞沉淀重悬于500 μL ES培养基中，冰上保存备用。</li>
 <li>在无菌细菌培养皿盖上制备液滴，加入含PVP和HCZB的液滴作为操作区。</li>
 <li>通过加载汞并将其固定在适当位置，然后用PVP清洗，制备一支15 μm的显微注射针。</li>
 <li>将一组囊胚（10–30个囊胚）放入含HCZB的液滴中，并将5–50 μL ES细胞悬液（根据浓度而定）加入另一含HCZB的液滴中。</li>
 <li>用注射针吸取50–100个ES细胞。</li>
 <li>移至含有囊胚的液滴中，将囊胚水平排列，并用持卵针通过施加负压固定其中一个囊胚。</li>
 <li>使用注射针旋转囊胚，使内细胞团（ICM）位于9点钟位置。</li>
 <li>将注射针置于3点钟位置，确保针尖无ES细胞残留，施加压电脉冲，直至注射针穿透透明带和滋养层进入囊胚腔。</li>
 <li>释放少量ES细胞（5–15个），使其黏附于内细胞团。重复操作，直至该组所有囊胚均完成ES细胞注射。</li>
 <li>完成一组囊胚注射后，用KSOM-AA培养基洗涤两次，并将其保留在含KSOM-AA的液滴中，直至所有囊胚均完成注射。</li>
</ol>
5. 胚胎移植
将胚胎移植到假孕雌性动物体内是一项外科手术，必须非常谨慎地进行，并严格遵守研究人员所在机构的指导方针。
<ol>
 <li>麻醉雌性受体小鼠，剃除右下腹区域毛发，并进行消毒。</li>
 <li>使用剪刀切开皮肤，并将腹膜与皮肤分离。</li>
 <li>透过腹膜定位卵巢（红色斑点），并在靠近卵巢处切开腹膜。</li>
 <li>用镊子小心夹住输卵管，并将子宫轻轻拉出。</li>
 <li>用连接口吸管的毛细管吸取约10个囊胚。</li>
 <li>用一把镊子固定子宫，用细针在子宫壁上刺一个小孔，将含有囊胚的毛细管插入子宫腔内。</li>
 <li>小心地将胚胎释放到子宫内，然后撤出毛细管。</li>
 <li>将子宫推回腹腔内。</li>
 <li>找到腹膜边缘，用数针缝合关闭。</li>
 <li>用数个皮肤钉闭合小鼠皮肤。</li>
 <li>术后镇痛：按每毫克体重给予5 μg卡洛芬（Carprofen）。</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/2168/2168fig1.jpg" alt="克隆效率图；柱状图比较SCNT、PPN和ESC在TSA处理下的克隆率。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 在B6CF1背景下预定义T细胞的体细胞核移植。由CD8+ T细胞生成的胚胎绝对数量与相对数量，以及来自SCNT囊胚的胚胎干细胞数量。
<img src="/files/ftp_upload/2168/2168fig2.jpg" alt="流式细胞仪散点图分析 CD8 和 MHC-I 四聚体相互作用；图表显示嵌合体结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2. 接受体细胞核移植胚胎干细胞注射的嵌合小鼠的代表性流式细胞分析。门控区域及数值（占总 CD8+ T 细胞的百分比）表示嵌合小鼠中特异性 CD8+ T 细胞的存在情况。

<ol><li>Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V%28D%29J+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">V(D)J recombination.</a> Immunol. Rev. 200, 5-5 (2004).</li>
<li>Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R., R, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+TCR+expression+in+transgenic+mice+constructed+using+cDNA-based+alpha-+and+beta-chain+genes+under+the+control+of+heterologous+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements.</a> Immunol. Cell Biol. 76, 34-34 (1998).</li>
<li>Eggan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+vigor%2C+fetal+overgrowth%2C+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 6209-6209 (2001).</li>
<li>Kishigami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significant+improvement+of+mouse+cloning+technique+by+treatment+with+trichostatin+A+after+somatic+nuclear+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Significant improvement of mouse cloning technique by treatment with trichostatin A after somatic nuclear transfer.</a> Biochem Biophys Res Commun. 340, 183-183 (2006).</li>
<li>Wakayama, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+cloning+with+nucleus+donor+cells+of+different+age+and+type%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Mouse cloning with nucleus donor cells of different age and type.</a> Mol Reprod Dev. 58, 376-376 (2001).</li>
</ol>

已提交专利申请。

我们已证明，体细胞核移植技术（SCNT）可用于从具有预定义特异性的T细胞产生转基因小鼠。尽管此处未展示，该技术也应可用于从具有预定义特异性的B细胞生成转基因小鼠。
需要考虑的一个重要因素是小鼠的品系和性别，这些小鼠将被感染或免疫，并用于分离感兴趣的T细胞或B细胞。由于T细胞和B细胞的重编程效率通常很低，我们建议使用具有目标单倍型的F1杂交小鼠。由于供体细胞也决定后代的性别，因此我们推荐使用雄性小鼠的T细胞或B细胞。这意味着只有雄性嵌合小鼠才能通过生殖系传递TCR或BCR，而雄性小鼠在繁殖上更简便且速度更快。 综上所述，我们认为通过体细胞核移植（SCNT）进行的表观遗传重编程是一种强大的工具，可用于生成一种新型的小鼠模型，这将对免疫学领域带来显著优势。

<table><tbody><tr><td>红细胞裂解缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>细胞滤筛</td><td>BD 生物科学</td><td>参考编号 352340</td><td></td></tr><tr><td>孕马血清（PMS）</td><td>Calbiochem</td><td>367222</td><td></td></tr><tr><td>人绒毛膜促性腺激素（HCG）</td><td>Calbiochem</td><td>230734</td><td></td></tr><tr><td>透明质酸酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4272</td><td>IV-S型</td></tr><tr><td>KSOM-AA</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-106-D</td><td></td></tr><tr><td>HCZB</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-173-D</td><td>定制培养基</td></tr><tr><td>用于激活的无钙培养基</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-174-D</td><td>定制培养基</td></tr><tr><td>SrCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255521</td><td>100 mM = 10倍</td></tr><tr><td>AlbuMAX I</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>11020-021</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯吡咯烷酮</td><td>MP Biomedicals</td><td>102787</td><td>使用HCZB配制10%溶液，并加入0.1% AlbuMAX I</td></tr><tr><td>细胞松弛素B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6762</td><td>500&amp;#x03BC;g/ml = 100倍</td></tr><tr><td>曲古抑菌素 A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8552</td><td>5 mM = 1000倍</td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>持针</td><td>Humagen</td><td>MPH-SM-30</td><td></td></tr><tr><td>注射针和转移针</td><td>Humagen</td><td>4-15, 7-15, 15-15</td><td></td></tr><tr><td>口吸移液管</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14088-10</td><td>或类似物</td></tr><tr><td>镊子</td><td>精细科学工具</td><td>11251-10</td><td>或类似物</td></tr><tr><td>伤口缝合夹施加器</td><td>BD 生物科学</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>伤口夹</td><td>BD 生物科学</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>缝合</td><td>Ethicon Inc.</td><td>K871H</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>15%</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-602E</td><td>100x</td></tr><tr><td>谷氨酰胺</td><td>MP Biomedicals</td><td>101806</td><td>200 mM = 100倍</td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>11140050</td><td>100x</td></tr><tr><td>&amp;#946;巯基&amp;#8211;乙醇</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>21985-023</td><td>5&amp;#x03BC;500毫升中的升</td></tr><tr><td>LIF</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1106</td><td>1000x</td></tr><tr><td>MEK抑制剂</td><td>细胞信号技术公司</td><td>9900L</td><td>仅用于 ES 细胞分离时，加入 ES 培养基中（终浓度 50&amp;#x03BC;M)</td></tr></tbody></table>

通过体细胞核移植技术获得的针对toxoplasma gondii具有预定义t细胞受体特异性的转基因核小鼠

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

淋巴细胞（如T细胞）通过基因V(D)J重排产生具有特定特异性的受体1。携带重排抗原特异性T细胞受体（TCR）的转基因小鼠已成为研究T细胞发育与功能不可或缺的工具。然而，这类TCR通常是在长期培养后、往往经过多次抗原刺激后从相应T细胞中分离得到的，这一过程不可避免地会筛选出具有高亲和力的T细胞。TCR α链和β链的随机基因组整合以及在非内源性启动子驱动下的表达，可能导致表达水平和表达动力学的差异。
通过体细胞核移植实现的表观遗传重编程，为从任何感兴趣的细胞生成胚胎干细胞和小鼠提供了工具。因此，当体细胞核移植技术应用于已知特异性的T细胞时，这些遗传性的V(D)J重排会被转移至核移植胚胎干细胞（ESCs）以及由其衍生的小鼠中，同时表观遗传标记被重置。我们已证明，可利用对Toxoplasma gondii具有预定义特异性的T细胞，构建出能够在内源性基因座表达特异性TCR的小鼠模型，而无需通过实验手段引入遗传修饰。此类转基因核模型的构建相对简便且快速，为其他疾病模型的建立提供了广阔前景。

本文展示了通过体细胞核移植（SCNT）进行表观遗传重编程可作为一种工具，用于构建具有预设T细胞受体（TCR）特异性的转基因小鼠模型。这些转基因小鼠在其内源性启动子的调控下，于内源性基因座表达相应的TCR。

通过体细胞核移植技术获得的针对Toxoplasma gondii具有预定义T细胞受体特异性的转基因核小鼠

淋巴细胞（如T细胞）会经历基因V(D)J重排，以产生具有特定特异性的受体1。携带已重排……的转基因小鼠

携带抗原特异性T细胞受体的转基因小鼠在T细胞发育和功能研究中不可或缺，可通过体细胞核移植（SCNT）技术建立具有预定义T细胞受体特异性的小鼠模型。将小鼠感染感兴趣的病原体后，从小鼠中分离T细胞，并通过荧光激活细胞分选法进行纯化。纯化的T细胞随后用于体细胞核移植。当胚胎发育至囊胚阶段后，分离获得胚胎干细胞。然后将这些细胞注射到囊胚中，再将囊胚移植至假孕小鼠体内。获得的幼鼠中，目标T细胞群体数量显著增加，可通过PAX分析进行验证。大家好，我是Okta AK，目前在怀特生物医学研究所担任博士后。今天我将向大家演示如何进行体细胞CLE转移囊胚辅助注射以及胚胎移植操作。体细胞转移的主要优势在于可以生成T细胞受体由内源性基因座表达的小鼠模型，因此其表达受内源性启动子调控，并且这类小鼠模型的构建速度非常快。体细胞液相转移可作为一种工具，用于快速构建具有预定义T细胞受体或B细胞受体特异性的小鼠模型。这对于从事自身免疫、感染性疾病和癌症等领域研究的科研人员具有特别重要的意义。为了分离针对病原体（如弓形虫）的特异性T细胞，在免疫反应高峰期通过腹腔注射感染小鼠，安乐死后取出脾脏，将脾组织匀浆并分离供体细胞，然后与荧光标记的抗体及相应的四聚体分子共同孵育。最后通过流式分选获得病原体特异性的T细胞。在卵母细胞去核操作的前一天晚上。使用注射器将汞逆行注入，制备直径为4、5和7微米的Piso注射针。次日，通过收集卵母细胞开始体细胞核移植实验方案，然后用口吸管将卵母细胞转移至培养皿中盛有K-S-O-M-A-A培养基的液滴内。培养皿的盖子中。通过放置约10滴PVP来准备用于进行体细胞核移植（SCNT）的aate。另准备约10滴含有5微克/毫升细胞松弛素B的HCZB，以及约10滴含有2.5微克/毫升细胞松弛素B的HCCB。此培养皿将被称为S-C-N-T-A培养皿。将S-C-N-T-A培养皿置于倒置复合显微镜的载物台上。接下来，将一根7微米的去核针放入显微操作器中，并通过吸取并弃去PVP溶液5到10次进行清洗。然后，将10至30个处于第二次减数分裂中期停滞的卵母细胞从培养皿转移到S-C-N-T-A板上的一个含有5微克/毫升细胞松弛素B的HCCB液滴中，在室温下孵育5分钟。孵育期间，将卵母细胞水平排列整齐。五分钟后，使用去核针将一枚卵母细胞置于固定针前方。利用显微注射仪施加负压，使卵母细胞固定在显微毛细管固定针上。接下来，使用去核针将卵母细胞旋转，直至染色体纺锤体复合物（与不透明的胞质相比呈现高度透明）位于3点钟位置，然后踩下脚踏板启动压电脉冲以穿透透明带。压电脉冲是一种沿纵向传播并使去核针尖端产生振动的机械脉冲。针尖的振动有助于钻透透明带。穿过透明带后，将核针的开口置于靠近第二次减数分裂中期纺锤体的位置，并施加负压。染色体-纺锤体复合物将缓慢进入核针内。一旦移出核针，细胞膜应自行闭合。最后，使用口吸管将去核的胞质体转移回 K-S-O-M-A-A 液滴中。然后用同一根吸管，通过在各 KSOM AA 液滴之间转移的方式清洗胞质体。为进行核移植，将显微操作仪上的七微米去核针更换为四至五微米的核移植针，并像之前一样用 PVP 清洗该针。将之前分离的CD8阳性T细胞放入S-C-N-D-A平板上的一滴PVP中。充分混匀，并在室温下孵育至少10分钟。随后，将10至30个去核细胞转移至含有2.5微克/毫升HCZB的一滴溶液中。在 S ct. A 培养板上加入细胞松弛素 B，在室温下孵育 5 分钟。孵育期间，使用核移植针配合注射针将细胞水平排列。从PVP培养基中挑取一个供体CD8阳性细胞，反复吸入和推出，直至其外膜破裂。如有必要，施加压电脉冲，此时应可见膜碎片和胞质成分。将细胞核吸入针尖内。然后继续吸取细胞核，直至达到10到30个。接着转移到含有排列好的去核胞质的液滴中。施加负压，使一个卵母细胞固定在持卵针上。然后将核移植针置于透明带旁，针尖朝向远离开口的方向，并使细胞核位于远离开口的一侧。施加压电脉冲，直至针尖穿过透明带。推动显微操作器，小心地将一个细胞核移至针尖处。将针头推入卵母细胞，直至针尖进入约三分之二深度。施加轻微的负压，使少量卵母细胞膜进入针内。下一步非常关键。由于这是卵母细胞真正处于开放状态的唯一时刻。施加一次ZO脉冲，然后施加正压，将细胞核从针尖推出。小心回拉针头，使针尖位于卵母细胞内的深度约为卵母细胞直径的三分之一，然后施加负压并继续向外抽拉针头，以封闭卵母细胞。每个卵母细胞均需重复此步骤。所有卵母细胞完成核移植后，将其转移至培养皿中，并通过在含有KS OM AA培养基的液滴间转移进行洗涤，随后在37摄氏度条件下孵育至少30分钟。孵育结束后，将SCN T胚胎转移至含有氯化锶的无钙激活培养基液滴中。氯化锶可通过诱导卵母细胞内发生类似于受精过程的钙振荡，从而激活卵母细胞。孵育六小时。如需要，可在激活培养基中添加TSA（曲古抑菌素A），这是一种组蛋白去乙酰化酶的非特异性抑制剂，以提高激活后的效率。激活后，将胚胎置于倒置显微镜下观察，以确定假原核（PPN）阳性体细胞核移植（SCNT）胚胎的数量。PPN可根据其形态特征进行识别。它们看起来像鸡蛋。将受精卵进行卵裂面朝上洗涤并培养，在37摄氏度下置于KSOM-AA培养液中培养3.5天，直至发育至囊胚阶段。最初，您应专注于正确执行我们刚刚向您展示的成核及核移植操作。一旦掌握了这些技术，后续的操作将更容易掌握。此处使用的胚胎干细胞（ES细胞）是采用标准技术获得的。这些操作应在合子后第3.5天进行囊胚辅助注射当天准备。通过在无菌细菌培养皿盖上滴加含有PVP和HCZP的液滴来准备皿盖。然后，像之前一样准备一支15微米的注射针用于皮秒脉冲。接下来，将注射针置于显微操作仪中，并用PVP转移液冲洗。向一滴HCZB中注入10至30次爆破辅助。然后将5至50微升的ESL悬浮液放入另一滴HCZB中。ES 细胞的数量应足够多，以便于轻松吸取，但不应过于密集。接下来，用注射针吸取 30 至 100 个 ES 细胞。然后移至含有囊胚的液滴中进行操作。将显微操作针水平对齐，并通过施加负压用持卵针固定一个胚胎。使用注射针转动胚胎，使内细胞团位于九点钟位置。将注射针置于三点钟位置。确保针尖处无胚胎干细胞，施加一次皮秒脉冲，直至注射针穿过透明带和三合体进入胚泡腔。释放5至15个胚胎干细胞，使其附着于内细胞团。注射完成后，继续操作直至所有胚泡均完成注射。用K-S-O-M-A-A溶液洗涤两次，然后将胚胎移植到假孕雌性小鼠体内。将麻醉后的假孕受体小鼠置于手术区域，使用电动剃须刀去除右下腹区域的毛发，再在解剖显微镜下用碘溶液和70%乙醇对该区域进行消毒。使用剪刀切开皮肤，然后将闭合的剪刀置于皮肤与腹膜之间，打开剪刀以分离腹膜与皮肤。透过腹膜定位卵巢，卵巢应呈现为红色斑点。随后用剪刀在该区域切开腹膜。使用镊子小心夹住子宫角（UCT）或其周围的脂肪组织，用连接口吸管的毛细管将子宫拉出。用镊子夹住输卵管和子宫，挑取约10个囊胚。用针在子宫上刺一个小孔。然后将带有吹气辅助的毛细管插入子宫腔并释放。将子宫推回腹腔内。找到腹膜边缘，用几针缝合关闭。用几枚皮肤钉合器闭合小鼠的皮肤切口。皮下注射给予镇痛药物。然后将小鼠转移回笼中，并置于加热灯下。在 enucleation 和体细胞核移植后，监测小鼠的呼吸，直到其苏醒。约 70% 的胚胎显示出假原核阳性。如图所示，使用 TSA 处理 6 小时或 10 小时均无影响。培养三天半后，有 5% 至 10% 的胚胎发育为囊胚。同样，添加TSA对囊胚辅助发育速率没有影响。随后利用SCNT囊胚辅助建立胚胎干细胞。TSA显著提高了从囊胚辅助中获得ESL的效率。S-C-N-T-E-S 细胞用于生成嵌合小鼠。采集这些小鼠的血液，并通过如图所示的流式细胞术分析检测其中是否存在特定的T细胞。当血液用抗CDA抗体和特异性四聚体染色时，可鉴定出双阳性细胞群。这表明用于体细胞核移植（SCNT）的供体细胞具有正确的特异性。我刚刚向您演示了如何进行体细胞核移植、辅助孵化注射以及胚胎移植。需要考虑的最重要因素是T细胞或B细胞的纯度。一旦您掌握了体细胞移植技术，并且您的胚胎已发育至囊胚阶段，您可以选择将胚胎直接移植到假孕雌鼠体内，或利用它们分离胚胎干细胞以制备嵌合小鼠。

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科研

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Immunology and Infection

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