直立成像果蝇胚胎

在这里，我们提出了一个彩绘的安装协议

以下实验的总体目标是使用共聚焦显微镜获得完整 oph 胚胎的冠状观察图像，该图像可用于精确测量胚胎大小并量化蛋白质和 RNA 表达水平。这是通过使用凝胶状稠度的封固剂将胚胎包裹在其中并将它们直立放置来实现的。作为第一步。

胚胎在一层薄薄的甘油果冻上对齐，然后用第二层这种培养基覆盖。接下来，将包含胚胎的封固剂切成块，可以垂直翻转以保持。获得用于成像结果位置的胚胎，这些胚胎显示使用任何类型的共聚焦显微镜可视化的横截面图像。

您好，我叫 Milu。我是凯斯西储大学生物系 Meso 实验室的研究生。今天，我们将演示使用共聚焦显微镜在国外位置对 PHI 胚胎进行成像的安装方案。

我们在 Case 的发育生物学课程实验室中与 Dr. 合作开发了这种方法，与现有方法（如 Mindin 实验室开发的 Endon 成像技术）相比，该技术的主要优势在于，它允许对固定胚胎或任何大小和形状的组织进行简单的制备和可视化。当我们需要可视化其他石膏物种的非常小的胚胎的横截面时，我们首先想到了这种方法，而手工切片是非常困难的。这种方法可以通过精确量化沿背腹轴的基因表达和蛋白质水平来帮助回答发育生物学领域的问题。

通常，胚胎是纵向安装的。虽然可以获得 Zack 横截面的重建，但经常存在荧光眼光散射的光漂白问题，而且非常耗时。我们的技术最大限度地减少了这些问题，因为胚胎的横截面图像是沿着单个共聚焦点可视化的。

通常，刚接触这种方法的人在切割靠近胚胎尖端的甘油 jolly 块时可能会遇到一些困难。这种方法的视觉演示至关重要，因为它需要小心处理。我们今天由我们的学生 Catherine Chen 和 catty 进行了演示，以准备用于直立成像的果蝇胚胎。

首先将甘油果冻在 55 摄氏度的水浴中熔化 20 到 30 分钟，直到它变成均匀的液体漩涡。但不要摇晃瓶子，以免形成气泡。使用切割的 P 1000 移液器吸头小心地将 1 毫升融化的甘油果冻移液到载玻片上。

要形成薄而均匀的第一层，没有气泡，让果冻在水平面上凝固 5 分钟。然后将玻片放入零下 20 摄氏度的冰箱中 5 分钟。或者，用保鲜膜盖住载玻片，并将其置于 4 摄氏度下长达 5 天。

一旦第一层果冻凝固，将载玻片带到内窥镜并继续胚胎对齐。在第一层果冻的一侧吸取少量染色的胚胎和 70% PBS 甘油。在内窥镜下，沿每张载玻片的三到四列并排对齐胚胎。

使用皮下注射针头通过针头的倾斜侧舀出它们。作为勺子。借助针头在果冻介质上水平滑动，小心地将所有胚胎的头部朝同一方向

对齐胚胎的最终配置将类似于 DNA 注射中描述的配置。使用一块扭曲的 Kim 抹布，从胚胎中去除多余的 PBS 甘油。根据胚胎的数量，小心地将 50 至 300 微升融化的甘油果冻移液到胚胎上，制成第二层果冻。

最后，将载玻片在零下 20 摄氏度下冷却 5 到 10 分钟，或在 4 摄氏度下存放过夜。要从载玻片中取出甘油包埋的胚胎以便在解剖镜下成像，请使用剃须刀片切开靠近对齐胚胎前后侧的果冻。将剃须刀片保持 90 度角。

要进行直线切割，请在切割旁边添加 100 至 200 微升的冷 PBT。小心地刮掉胚胎旁边的果冻。使用刮刀，PBT 有助于释放胚胎块。

将块转移到干燥的显微镜载玻片上进行进一步切割。首先切下较小的块，其中包含 5 到 7 个胚胎。第二次修剪过量的甘油果冻，这可能会干扰成像。

最后，借助剃须刀片和针头将嵌入的胚胎翻转到直立位置。要使用倒置共聚焦显微镜观察果蝇胚胎，请将含有胚胎的果冻块放在盖玻片上。确保果冻含量最少的胚胎部位与物镜接触更紧密。

如果使用正置显微镜成像，请制作四叠 supra 胶水。第一，盖玻片用作支撑物，并将胚胎块放在支撑物之间的甘油中。使用较长的盖玻片桥接堆栈以进行共聚焦分析。

将标本放在显微镜载物台上。检查要使用的物镜的工作距离，以确定您是否可以在整个胚胎中成像，或者仅在计算机中部分设置共聚焦配置以开始成像，如图所示。如果方案正确完成，则可以观察到具有完整形态的胚胎的横截面图像，因为胚胎保持完整。

该方法可用于精确测量胚胎大小和沿背腹轴的基因表达水平。一旦掌握，这项技术可以在 30 到 45 分钟内完成。在将第二层甘油果冻倒在胚胎上之前，去除多余的甘油很重要。

否则，两层可能会分裂并使切割步骤更加困难。此外，您需要检查所用物镜的工作距离，以确保您可以对整个胚胎或仅对其中的一部分进行成像，因为工作距离会限制您可以成像的量。确保将果冻切得紧贴胚胎的一侧，您将朝向目标。

否则，您将只对果冻进行成像，而不是胚胎。看完这个视频后，我们希望你能很好地理解如何拍摄 Joseph Embryos 的横截面图像。感谢您关注我们，祝您的实验好运。