Name: 异源表达在哺乳动物细胞离子通道的突变和功能分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 28 s
Description: 学习利用定点突变和全细胞膜片钳技术在哺乳动物细胞中研究GRK离子通道突变效应的方法。该方案为神经科学和电生理学研究者提供了研究离子通道功能与疾病相关突变的实用框架。

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本研究得到了神经科学麦金尼基金会（PAS）、国家药物滥用研究所（R01 DA019022；PAS）以及美国国家酒精滥用与酒精中毒研究所为P.A.提供的博士前NIH NRSA基金（F31AA017042）的资助。GIRK2-L257W突变体由Prafulla Aryal博士提供。 荧光显微镜及赞助由Leica Instruments善意提供。

1. 定点突变
我们使用编码GIRK2 cDNA的哺乳动物表达质粒pcDNA3.1，并根据制造商说明书，利用Stratagene（Agilent Technologies）的Quikchange XL II定点突变试剂盒引入点突变。
引物序列可使用以下网站提供的在线引物设计程序轻松生成： <a href="https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&amp;SubPageType=ToolQCPD&amp;PageID=15">https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&amp;SubPageType=ToolQCPD&amp;PageID=15</a> 注意：我们使用标准的 Eppendorf 1.5 mL 离心管替代方案中所述的 BD 14 mL 管。然而，使用经 β-巯基乙醇预处理的 XL10-Gold 超感受态 E. coli、30 秒热激时间以及 NZY+（或 NZYM+）培养基，对于成功进行定点突变至关重要。如有可能，在引入突变的同时设计一个额外的同义突变以产生新的限制性酶切位点，将有助于后续对突变菌落的筛选。
2. 质粒小提、DNA 测序与质粒大提
2.1 使用Qiagen质粒小提试剂盒进行质粒提取及测序。
挑取单个细菌菌落，在含有氨苄青霉素（AMP）的LB肉汤中培养。按照试剂盒说明书纯化cDNA。若在上述第1步中引入了限制性酶切位点，则可通过简单的限制性酶切鉴定来确认突变是否成功引入。DNA自动测序在体外完成，对于确认cDNA中突变的存在以及评估是否存在任何非预期突变至关重要。此步骤非常重要。我们使用位于pcDNA3.1质粒多克隆位点两侧的T7启动子正向引物和BGH反向测序引物，对整个GIRK编码序列进行测序。 注意：必须仔细检查测序色谱图，以确保测序数据质量足够高。高质量的色谱图表现为尖锐、不重叠的峰，且背景噪音较低。
2.2 Qiagen 大提纯。
我们遵循制造商的说明。 注意：我们在实验中包含此步骤，以提高cDNA的纯度，我们发现这对高效的转染至关重要。
3. HEK293T 细胞的培养与转染
所有这些步骤都应在无菌的组织培养罩内进行。
3.1 细胞培养
HEK293T细胞易于培养（37°C、5% CO2的湿化培养箱），具有快速增殖、高转染效率以及适用于全细胞膜片钳电生理记录等优点，因此使用起来十分方便。HEK293T细胞表达SV40大T抗原，可确保pcDNA3.1质粒的附加体复制。
HEK293T 细胞在含 L-谷氨酰胺和 10% 胎牛血清（FBS）的低糖 DMEM 培养基中培养。传代细胞时，向汇合度为 90–95% 的 HEK293T 细胞加入 0.25% 胰蛋白酶/EDTA，待细胞从培养皿上脱落后再加入含 FBS 的新鲜培养基以终止酶活性。将约 1 × 105 个细胞/孔接种至 12 孔细胞培养板中，每孔加入 1 mL 无抗生素的培养基。（1 × 105 个细胞约为从长满的 T25 培养瓶中加入 10 mL 培养基重悬后所得细胞悬液的 350 μL）。
3.2 转染
转染前，HEK细胞需在培养皿中贴壁培养8–24小时。使用Invitrogen Lipofectamine 2000试剂，将0.2 μg通道cDNA、0.4 μg M2R受体cDNA和0.04 μg YFP cDNA共转染至细胞中。注意：我们使用少量YFP cDNA以标记成功转染的细胞（呈现绿色荧光的细胞通常同时表达GIRK通道和M2受体）。不同克隆所需cDNA的浓度需根据实际情况进行优化调整。
3.3 转染细胞的荧光观察
将12孔板放置在倒置荧光显微镜的载物台上，观察细胞的YFP表达情况。与明场差分干涉（DIC）图像进行比较，记录绿色荧光细胞的大致数量。由此可估算转染效率。
3.4 24 孔板和多聚赖氨酸包被盖玻片的准备
将12 mm的玻璃盖玻片（Warner，CS-12R）用Radiacwash振荡清洗过夜，随后用去离子水冲洗，并在95%乙醇中振荡过夜。将清洗后的盖玻片保存在70%乙醇中，直至使用。
将盖玻片放入盛有乙醇的培养皿中，用镊子夹起盖玻片并在火焰上烧去乙醇，然后放入无菌24孔板的一个孔中。
每孔加入 250 μL 多聚-D-赖氨酸（PDL）溶液 [0.2 mg/mL]，将盖玻片置于 PDL 溶液中，在超净台内浸泡过夜。用 Parafilm 封膜包裹 24 孔板以防止蒸发。
次日早晨，吸除PDL溶液，并用无菌水洗涤2次。将培养板打开，在生物安全柜中晾干，然后盖上盖子。包被有盖玻片的24孔板可用无菌铝箔包裹，于室温下保存数周。
3.5 将转染的 HEK293T 细胞接种到盖玻片上
转染后24小时，将细胞接种至24孔板中（每孔约4 × 103 个细胞），孔内含多聚-D-赖氨酸包被的玻璃盖玻片。注意：转染后的细胞可在转染后24–72小时内使用。将细胞分种是为了为膜片钳电生理实验提供独立的盖玻片。	
4. 电生理学
4.1 配制溶液
细胞外（灌流）溶液：20 mM KCl，140 mM NaCl，0.5 mM CaCl2，2 mM MgCl2 和 10 mM HEPES（用 NaOH 调节 pH 至 7.4）。
分装 20K 浴液并加入适当的调节剂
<ul>
	<li>20K + Ba2+：含 1 mM BaCl2 的溶液，为内向整流电流的特异性抑制剂</li>
	<li>20K + 卡巴胆碱（Carbachol）：含 5 μM Carbachol 的溶液，为特异性 M2R 激动剂；M2R 可与 G 蛋白偶联，从而开放 GIRK 通道</li>
	<li>20K + 乙醇（Ethanol）：含 100 mM EtOH 的灌流液，用于直接激活 GIRK 通道</li>
</ul>
将浴液放入快速置换灌流系统的注射器（溶液容器）中。注意：我们使用 Warner 夹管阀系统来控制浴液。建议使用 PE 管。
内液/电极溶液：140 mM KCl，20 mM NaCl，5 mM EGTA，5.4 mM MgCl2，10 mM HEPES（pH 7.4），含 2.5 mM K2ATP 和 0.3 μM Li2GTP。
我们配制不含ATP和GTP的电极液。将ATP和GTP分别分装，于-80°C保存，并在实验当天加入电极液中。将装有最终电极液的注射器置于冰上，以保持ATP/GTP的活性。使用0.2 μm滤膜对内液/外液进行无菌过滤，以抑制微生物生长，并降低管路和电极堵塞的可能性。
4.2 拉制电极
我们使用 Narishige 两步垂直拉制仪和 Warner Instrument 的硼硅酸盐玻璃电极（外径 1.5 mm，内径 0.86 mm，长度 7.5 cm），在用细胞内溶液填充后，获得电阻为 3–7 MΩ 的电极。
注意：必须在实验室内针对电极拉制仪和电极玻璃的类型通过实验确定具体参数。对于我们的垂直拉制仪，第一次拉制的加热设定为 60.2，第二次拉制约为 43。
4.3 全细胞膜片钳
<ol>
	<li>使用少量凡士林将盖玻片固定在35 mm培养皿中，加入外部溶液覆盖，并将培养皿置于倒置荧光显微镜的载物台上。使用微分干涉差（DIC）聚焦并寻找细胞，切换至YFP荧光以定位YFP阳性细胞。</li>
	<li>将灌流多路管的尖端置于绿色细胞附近（距离目标细胞20–30 μm，相当于2–3个细胞长度）。</li>
	<li>用溶液填充电极，并将其连接至Axopatch 200B放大器（Axon Instruments）的前置放大器头级，初始设置如下：增益（Gain）为1，配置为全细胞模式（whole-cell β=1），工作模式为电压钳（V-clamp）。</li>
	<li>对电极施加正压以防止移液管堵塞，并使用操纵器将电极尖端置于细胞正上方。</li>
	<li>为将电极电位归零，选择“封接测试”（Seal Test）按钮以施加一个测试电压阶跃。在Clampex的封接测试窗口中将出现一个5 mV的矩形电压阶跃。调节放大器上的电极偏移电位器（Pipette Offset potentiometer），使基线电流归零至0 nA。或者，也可将放大器模式选择器切换至V-track模式，将仪表旋钮（meter knob）调至Vtrack，再使用放大器上的电极偏移电位器将放大器仪表显示的电压调至“0.00”。</li>
	<li>使用Clampex 8.2软件的封接测试命令检查电极电阻（应为3–7 MΩ）。</li>
	<li>打开已保存的实验协议文件或创建新协议。要打开协议文件，请从主菜单选择“Acquire”（采集），然后选择“Open Protocol”（打开协议），并选择一个已保存的电压协议文件。本实验所用协议设定为：将膜电位钳制在-40 mV，施加一次50 ms的单阶跃电压至-100 mV，随后在200 ms内斜升至+40 mV。该协议每2秒执行一次。此斜升协议可用于观察GIRK通道的反转电位和内向整流特性。对于电压门控离子通道，使用矩形电压阶跃可能更为合适。</li>
	<li>使用操纵器的微调功能接近细胞，释放正压，在接触细胞表面后施加负压，并在封接测试示波器窗口中监测电阻的上升。当电阻达到GΩ范围时，表明电极已与细胞膜形成紧密封接（即已形成Gigaseal）。</li>
	<li>施加短暂的负压脉冲以破裂细胞膜，从而进入细胞内部。一旦进入全细胞构型，将观察到电容性电流的增加。</li>
	<li>切换至Clampex中的“膜测试”（Membrane Test）模式，记录接入电阻（Ra）、膜电阻（Rm）、膜电容（Cm），并通过肉眼观察理论曲线与实际电容性电流的指数拟合情况。膜电容与细胞大小成正比，后续将用于计算电流密度。</li>
	<li>切换回封接测试模式，将V-Out（膜电位）设定为-40 mV，并将滤波器设置为10 kHz。</li>
	<li>通过以下步骤在放大器上对膜电容和串联电阻进行补偿：
	<ol class="lalpha">
		<li>打开“全细胞电容”（WHOLE CELL CAP）开关。反复调节“全细胞电容”（WHOLE CELL CAP）和“串联电阻”（SERIES RESISTANCE）旋钮，直至测试脉冲呈平坦状。必要时还需调节移液管电容快速补偿（FAST CAP）旋钮。</li>
		<li>将“预测百分比”（% PREDICTION）旋钮调至约60–80%，再次调节“全细胞电容”和“串联电阻”旋钮（可能还需同时调节移液管电容补偿FAST CAP旋钮）。</li>
		<li>将“补偿百分比”（% COMP-）调至100%，同时避免细胞振荡，并通过重新调节“全细胞电容”和“串联电阻”旋钮尽量保持脉冲平坦（可能还需调节移液管电容补偿FAST CAP旋钮）。通过减小时间常数来调节滞后时间。</li>
		<li>在实验记录本中记录放大器上设置的膜电容（Cm）、串联电阻（Rs）、%COMP、%PRED和滞后时间。Cm和Rs的值应与前述“膜测试”中测得的Cm和Rm大致相同。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>打开外部溶液阀门以控制浴槽溶液。将放大器的8极贝塞尔滤波器设为2 kHz，打开电压钳协议并开始记录电流。</li>
	<li>我们采用斜升协议记录GIRK电流：先施加50 ms的-100 mV阶跃，随后在200 ms内从-100 mV斜升至+40 mV，每2秒重复一次。该斜升协议可用于观察GIRK通道的反转电位及其内向整流特性。在室温（22–25°C）下，当浴液中含有20 mM KCl时，GIRK电流的反转电位应接近-50 mV（与计算的钾离子平衡电位EK = -50 mV相近），在高于EK的电位下电流保持相对平坦。</li>
	<li>实验方案：在记录稳定基线后，切换至20K + 氯乙酰胆碱（Carbachol）溶液，等待反应达到峰值；再切换回20K浴液；接着施加20K + 乙醇溶液，等待其峰值反应；然后切换回20K浴液，最后施加20K + Ba2+溶液。在施加这些药物期间，将观察到GIRK电流幅度的变化（在-100 mV时最为显著）。在实验记录本中注明不同细胞外溶液施加对应的扫描序号。单个Clampfit文件将包含整个实验的所有扫描记录。</li>
</ol>
5. 数据分析
我们使用 Clampfit 9.2 软件在 -100 mV 条件下分析 GIRK 电流数据。
<ol>
	<li>打开记录文件，将光标设置在 -100 mV。默认情况下，屏幕上将显示所有叠加的曲线。点击“Write cursors”图标后，可生成类似 Excel 的电子表格，包含数值数据。</li>
	<li>将 X 轴指定为曲线编号列，Y 轴指定为光标列，然后点击“Create Graph”图标，即可快速绘制实验的时间进程图。</li>
	<li>通过从仅含外部灌流液记录的电流（“20K 电流”）中减去含 Ba2+ 时的电流，计算基础电流（“20K 电流”减去“20K + Ba2+ 电流”）。通过从 20K 条件下的基础电流中减去激活状态下的电流，计算诱导电流（“20K + 卡巴胆碱电流”减去“20K 电流”；“20K + 乙醇电流”减去“20K 电流”）。通过将电流除以膜电容（直接从放大器读取）计算电流密度（pA/pF）。通过将诱导电流除以基础电流再乘以 100，计算激活百分比。</li>
</ol>
6. 代表性结果
应能够记录转染了野生型通道的细胞中的电流。在含有 20 mM K+ 的细胞外溶液（以及 145 mM K+ 的细胞内溶液）中测量 GIRK 通道时，应观察到明显的内向整流特性以及约 -50 mV 的反转电位，这是钾通道的基本特性。施加卡巴胆碱后，野生型电流将显著增加（较基础电流增加 3-5 倍），并对 100 mM 乙醇产生类似反应。注意：电生理学中的符号约定为，内向电流为负，外向电流为正。对于 GIRK2 酒精结合口袋中的 L257W 突变，将观察到对卡巴胆碱和乙醇的反应均减弱。这表明 L257 参与了酒精和 G 蛋白对 GIRK2 通道的激活过程。有关 GIRK2 突变实验结果的更多示例，请参见 Aryal et al.1 的近期发表文章。
<img src="/files/ftp_upload/2189/2189fig1.jpg" alt="膜片钳数据的分析，显示GIRK2通道活性的图示，用于膜片钳研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. Clampfit 8.0 窗口显示野生型GIRK2记录的数据文件。 左上方图显示在不同外部bah溶液存在下，对斜坡电压方案响应所记录的叠加扫描曲线。光标1位于-100 mV处。光标数值被写入电子表格（右侧面板）。左下方图显示扫描次数与电流的关系图。注意乙醇（EtOH）和卡巴胆碱（Carb）引起电流增加（向下偏转），而Ba2+引起电流抑制。
<img src="/files/ftp_upload/2189/2189fig2.jpg" alt="使用膜片钳数据进行电生理学分析，GIRK2 L257W；离子电流图，Clampfit 软件。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2. Clampfit 8.0 窗口显示突变型 GIRK2-L257W 记录的数据文件。 说明同图 1。请注意突变通道中卡巴胆碱（Carb）激活作用的丧失以及乙醇诱导电流的减弱。

<ol><li>Aryal, P., Dvir, H., Choe, S., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+discrete+alcohol+pocket+involved+in+GIRK+channel+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A discrete alcohol pocket involved in GIRK channel activation.</a> Nature Neurosci. 12, 988-995 (2009).</li>
<li>Panchenko, V. A., Glasser, C. R., Mayer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+similarities+between+glutamate+receptor+channels+and+K%2B+channels+examined+by+scanning+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Phys%22%5BJournal%5D)">Structural similarities between glutamate receptor channels and K+ channels examined by scanning mutagenesis.</a> J Gen Phys. 117, 345-360 (2001).</li>
<li>Doyle, D. A., Cabral, M. orais, Pfuetzner, J., Kuo, R. A., Gulbis, A., Cohen, J. M., Chait, S. L., &amp, B. T., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+potassium+channel%3A+molecular+basis+of+K%2B+conduction+and+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity.</a> Science. 280, 69-77 (1998).</li>
<li>Nishida, M., Cadene, M., Chait, B. T., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+Kir3.1-prokaryotic+Kir+channel+chimera%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a Kir3.1-prokaryotic Kir channel chimera.</a> EMBO J. 26, 4005-4015 (2007).</li>
<li>Tao, X., Avalos, J. L., Chen, J., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+eukaryotic+strong+inward-rectifier+K%2B+channel+Kir2.2+at+3.1+%26Aring%3B+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the eukaryotic strong inward-rectifier K+ channel Kir2.2 at 3.1 &Aring; resolution.</a> Science. 326, 1668-1674 (2009).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

定点突变是研究离子通道结构与功能关系的经典方法。该方法基于以下假设：通过改变离子通道中的关键残基，应能观察到通道功能的显著变化。相反，若在非关键位置引入突变，则通常不会对通道功能造成重大影响。通常，首先将目标残基突变为丙氨酸（一种小的非极性氨基酸），随后再突变为色氨酸（氨基酸中体积最大的一种）2。如果该残基对通道功能至关重要，则这两种突变均会改变通道活性；而若突变发生在较不重要的残基上，其效应（尤其是突变为丙氨酸）往往不明显。由于色氨酸体积较大，更容易因空间位阻效应而导致功能改变。当缺乏结构信息时，常可在通道的某一片段内系统性地进行丙氨酸或色氨酸突变（称为丙氨酸扫描或色氨酸扫描），以定位关键残基。值得注意的是，可同时平行构建多个含有不同点突变的克隆，从而在相对较短时间内检测多个残基的功能。近年来，多种离子通道的晶体结构已被解析3,4,5，这些结构信息可用于预测潜在的关键残基，并通过本实验方案所述的方法加以验证。
对野生型通道的测量应始终与突变通道的测量同时进行，以作为阳性对照，确保转染和电生理实验操作正确。点突变可能导致无功能性电流产生、电流与野生型相似，或通道活性的调控发生改变。无法检测到电流可能是由于蛋白质折叠异常或转运改变所致。在此情况下，可通过生物素化实验或针对细胞外标签的免疫荧光染色（不进行细胞通透化处理），检测通道是否正确转运至细胞表面，从而区分位于细胞膜上的非功能性通道与滞留在细胞内的通道。最后，建议不仅研究通道的基础活性，还应探究突变对通道调控的影响。可根据所研究的离子通道类型，探讨不同的功能调节机制，包括G蛋白、PIP2、离子、ATP浓度、磷酸化（利用酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸突变）、泛素化或类泛素化修饰（利用赖氨酸突变）以及直接通道激动剂或阻断剂对通道功能的调节作用。

<table><tbody><tr><td>化学品</td><td>Sigma</td><td>不同</td><td></td></tr><tr><td>小型质粒提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>放射性去污清洗剂</td><td>Biodex</td><td>005-100</td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸氢溴化物</td><td>BD 生物科学</td><td>CB40210</td><td>聚-L-赖氨酸也可使用</td></tr><tr><td>Maxi Prep 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>12263</td><td></td></tr><tr><td>QuickChange XL II 定点突变试剂盒</td><td>Stratagene</td><td>200512-5</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 &amp;#710;&amp;#8230; 12 毫米</td><td>Warner Instruments</td><td>CS-12R</td><td></td></tr><tr><td>毛细玻璃管 硼硅酸盐-标准壁厚</td><td>Warner Instruments</td><td>G150-3</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/clinical/inverted-microscopes/details/product/leica-dmi3000-b/" target="blank"&gt;倒置荧光显微镜&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/clinical/inverted-microscopes/details/product/leica-dmi3000-b/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Leica</a></td><td>DMI3000 B</td><td></td></tr><tr><td>电生理学</td><td>尼康&lt;br/&gt;Leica&lt;br/&gt;蔡司</td><td>任何倒置的微分干涉相差（DIC）&lt;br/&gt;（霍夫曼）&lt;br/&gt;荧光显微镜</td><td></td></tr><tr><td>放大器</td><td>Molecular Devices</td><td>Axon Axopatch 200B 放大器</td><td></td></tr><tr><td>灌注系统</td><td>Warner Instruments</td><td>VC-6 灌注 MM-6</td><td></td></tr><tr><td>数字化仪</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1320 数字转换器</td><td></td></tr><tr><td>操纵器</td><td>Sutter Instruments</td><td>操纵器：MP-85</td><td></td></tr><tr><td>电极拉制仪</td><td>Narishige</td><td>PC10 垂直电极拉制仪</td><td></td></tr><tr><td>分离台</td><td>技术制造公司</td><td>气浮台</td><td></td></tr></tbody></table>

在哺乳动物细胞中异源表达离子通道的诱变与功能分析

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

我们将演示如何研究在离子通道中引入点突变的功能效应。我们研究的是G蛋白门控内向整流钾通道（简称GIRK通道），这类通道在调节神经元兴奋性方面具有重要作用。哺乳动物体内存在四种不同的GIRK通道亚单位（GIRK1–GIRK4），本实验聚焦于GIRK2，因其可形成同源四聚体。激活不同类型的G蛋白偶联受体（GPCR），如毒蕈碱型受体（M2R），可导致GIRK通道的激活。此外，酒精也可直接激活GIRK通道。我们将展示如何通过特异性改变GIRK通道cDNA中的一个或多个核苷酸，实现单个氨基酸的突变。该突变后的cDNA序列将在细菌中扩增并纯化，随后通过DNA测序确认点突变的存在。将野生型与突变型GIRK通道的cDNA转染至培养的人胚肾HEK293T细胞中 体外最后，将采用全细胞膜片钳电生理技术研究异源表达的野生型或突变型GIRK通道中的宏观钾电流。在本实验中，我们将检测GIRK2通道中L257W突变对M2R依赖性和酒精依赖性激活的影响。

我们将演示如何研究单个点突变对离子通道功能的影响。

我们将演示如何研究在离子通道中引入点突变的功能效应。我们研究G蛋白门控的内向整流钾离子通道……

G蛋白门控内向整流钾通道（G-protein gated inwardly rectifying potassium channels，简称grk）在调节神经元兴奋性方面具有重要作用。grk可通过G蛋白偶联受体（GPCRs）（如毒蕈碱受体M2R）以及酒精来激活，以研究gerk酒精结合位点突变的影响。在激活时，通过定点诱变技术将单个点突变引入grk cDNA，将纯化的gerk表达质粒与YFP表达质粒共转染至哺乳动物细胞中，并通过荧光成像评估转染效率。随后进行全细胞膜片钳分析，以比较酒精和G蛋白依赖性激活作用。本实验的可视化演示将为您提供研究LY通道功能的关键信息。今天我们将探讨酒精如何激活离子通道这一问题。此处展示的位点定向新生技术可为离子通道功能的研究提供重要见解。该技术也可应用于其他已知基因突变导致人类疾病的系统。热细胞膜片钳技术的演示至关重要，因其涉及多个需要精确操作、适当的电子补偿以及反复练习才能获得可用数据的步骤。本方案中用于转染的DNA按如下步骤制备：首先，将PCR获得的GRK亚基DNA直接克隆至哺乳动物表达质粒pcDNA3.1中，并利用特异性设计的引物，结合Quick Change XL双位点定向突变试剂盒引入点突变。利用该系统进行PCR，使整个质粒被复制，同时由引物编码的点突变被引入。PCR完成后，复制的质粒用DpnI限制性内切酶消化，然后通过热激法转化至XL10-Gold超感受态大肠杆菌中。转化后的细菌在含氨苄青霉素的LB琼脂平板上培养；含有质粒的细菌具有氨苄青霉素抗性，能够形成菌落。挑取分离的菌落并接种于微型培养物中进行培养。通过质粒小提操作分离质粒DNA，随后对DNA进行测序，以鉴定成功转化的突变株。将大肠杆菌扩大培养，并进行大量提取以制备较大量质粒DNA，将约1×10⁵个HEK293T细胞接种至12孔板中的两个孔内，每孔分别用于突变组和对照组。野生型通道在37摄氏度下孵育。8至24小时后，细胞将贴附于基质上，可进行转染。根据制造商说明书，使用Lipo 2000将0.2微克通道cDNA、0.4微克M2R受体cDNA和0.04微克YFP-cDNA共转染入细胞。为鉴定成功转染的细胞，将细胞继续培养24小时。在完成所需的孵育时间后，将细胞置于倒置荧光显微镜的载物台上，以评估转染效率。通过比较荧光图像与微分干涉相差（DIC）图像，确定被转染细胞的百分比。随后将培养皿放回培养箱中继续培养。将12毫米的玻璃盖玻片清洗干净，并在使用前保存于乙醇中。在无菌操作台中通过火焰灼烧去除残留乙醇。将盖玻片放入24孔板中，并用0.2毫克/毫升的溶液进行包被。转染后24小时，用胰蛋白酶消化细胞，以每孔4×10³个细胞的密度接种于多聚赖氨酸包被的玻璃盖玻片上，置于24孔板中，每板4至8孔。继续培养24至48小时，然后进行全细胞膜片钳记录。使用两步式垂直拉制仪和硼硅酸盐玻璃毛细管制备膜片电极。理想情况下，制备完成的电极电阻应在三到七兆欧姆之间，且无需进行热抛光等额外处理。进行膜片钳实验时，将转染细胞的盖玻片放入含有20毫摩尔钾或20 K外部溶液的35毫米培养皿中。然后将培养皿置于倒置荧光显微镜的载物台上。此处使用的膜片钳装置采用灌流系统。该系统包含将施加于细胞的细胞外溶液，溶液通过连接至多通管路的管道，依靠重力流入。每种溶液均由电磁阀远程控制。使用微分干涉相差（DIC）显微镜调焦并寻找细胞。切换至YFP滤光片以定位YFP阳性细胞。一旦确定YFP阳性细胞，将灌流系统的尖端置于距离该荧光细胞20至30微米或两到三个细胞长度的位置。用细胞内电极液填充电极。使用注射器和柔性针头，轻轻敲击已填充的电极，以去除尖端的气泡。将电极连接至 AXO patch 200 B 放大器的前置放大头阶段。再次检查放大器上的设置是否与一种配置相等。全细胞开关为 beta 等于 1，低通滤波器设置为 10 千赫兹。使用注射器施加正压并用夹子固定，以保持电极尖端清洁。然后使用显微操作器将电极尖端放入浴液中，并移动至细胞上方。将放大器切换至电压跟踪（V track）模式，并将表头旋钮调至电压跟踪（V track）档位。接着使用放大器上的移液电极偏移电位表，调节使放大器电压表显示为0.00，以将移液电极电位调零。或者，将放大器切换至电压钳模式，并选择测试脉冲按钮以施加测试电压阶跃。矩形电压阶跃将出现在钳制系统的封接测试窗口中。调节放大器上的移液管偏移，使基线电流回到零纳安。封接测试将显示电极电阻，其值应在三到七兆欧姆之间。接下来，关闭封接测试窗口。在下拉菜单中选择“获取开放协议”。然后选择一个已保存的电压程序。此处选择的程序已预先设定为每两秒施加一次从负100毫伏到正40毫伏的单步电压。该斜坡程序可用于观察GK通道的反转电位及其内向整流特性。对于电压门控离子通道，可采用矩形电压阶跃。使用显微操作器微调，接近细胞，释放正压；接触细胞表面后，施加轻微负压。在封接测试中监测电阻的相应升高。一旦电阻达到吉欧姆（giga ohm）范围，即表明电极已与细胞膜形成紧密封接。这被称为吉欧密封。使用注射器施加负压脉冲以破裂膜，从而进入细胞内部。一旦形成全细胞构型，封接测试将记录到较大的电容电流，这些电流在测试开始和结束时表现为尖峰或瞬时信号。进行封接脉冲测试。接着，点击膜测试按钮。在钳制模式X下，记录通路电阻和膜电阻。通过肉眼观察笔记本中的膜电容数据，验证其是否符合指数拟合。膜电容与细胞大小成正比，将用于计算电流密度。串联电阻和膜电阻用于评估记录结果是否满足后续实验的要求。良好的记录应具有较低的接入电阻。现在关闭膜测试窗口，再次点击封接测试窗口中的封接测试按钮，将输出电压（V out）设为负40毫伏，以补偿放大器上的膜电容和串联电阻。打开全细胞模式（whole cell cap），反复调节全细胞补偿和串联电阻，直到瞬变电流最小化且电流呈一条水平直线。如有需要，可使用放大器上的快速电容（fast cap）旋钮调节移液管电容。过度或不足的补偿都会导致残余容性瞬变。接下来，将预测百分比旋钮调至60%到80%，根据需要重新调整全细胞电容串联电阻和快速电容，以在封接测试中获得一条平坦的直线。最后，在不引起细胞振荡的前提下，将百分比补偿调至约100%，同时通过重新调节全细胞电容串联电阻和快速电容电位计，尽量使脉冲保持线性。完成电阻和电容补偿后，将放大器电容串联电阻百分比、补偿百分比预测值及滞后时间的设定值记录在实验记录本中，打开外部溶液阀门以引入对照的 20 K 浴液。将放大器上的低通滤波器设置为 2 千赫兹。然后点击软件中的“记录”按钮，开始记录电流。观察格列本脲（ger）电流的内向整流特性。该特性表现为：在钾离子反转电位（由Nernst方程EK确定）负侧出现较大的内向电流，而在EK正侧仅出现较小的外向电流。在记录到稳定的基线后，通过施加含20 mM K⁺和卡巴胆碱（carbachol）的细胞外溶液，检测受体介导的电流激活情况。当观察到峰值激活且电流达到稳态后，切换回K浴液，并等待电流恢复至基线水平。接下来研究酒精对gert电流的激活作用。切换至含20 mM K及100毫摩尔/升乙醇的胞外溶液，并等待峰值反应出现。然后切换回 20 K 浴液，并等待电流基线水平恢复。最后，为确定基础的 gert 电流，切换至含 20 K 和 20 K 氯化钡的溶液，并在此条件下等待电流反应稳定。在整个实验过程中，girk 电流的抑制效应应清晰可见，且在 -100 毫伏时最为显著。记录施加不同细胞外溶液时对应的扫描次数。单个钳制拟合文件将包含整个实验的所有扫描数据。分析GK数据时，请使用Clamp FIT 8.2软件。根据随附书面方案中的说明，从表达野生型或突变型GK通道的HEK 293T细胞中获得了两种不同的全细胞记录，并按照本视频中的说明进行分析，此处以野生型GK2为例展示。左侧图板包含一个窗口，其中显示了在不同溶液存在下通过电压斜坡方案产生的多个叠加电流。请注意其向内整流特性。在电流轨迹上约50毫秒处，负100毫伏时出现较大的内向电流。在电流轨迹上约200至260毫秒处，0至正40毫伏之间的小幅外向电流来源于内源性电压门控钾通道。它并非Gert电流光标。一个光标放置在最大内向电流处，光标数值将写入电子表格。在电子表格中，可查看迹线编号以及在负100毫伏时的电流值。数据包括基础电流、卡巴可诱导电流和酒精诱发电流，以及钡抑制电流。同样展示了在不同溶液存在下的电压斜升电流，即突变通道 L 2 57 w 在含有 20 k 加 100 毫摩尔乙醇、或 20 k 加 5 毫摩尔卡巴可、或 20 k 加钡溶液中的电流。注意酒精和碳水化合物诱导的电流显著减小。这些结果表明，该残基在酒精和G蛋白βγ亚基对GK通道的门控过程中起着重要作用。观看本视频后，您应能够很好地掌握如何构建一个突变体，并利用先进的电生理技术研究其对通道功能的影响。一旦掌握，该定点诱变技术可在两到三天内完成，并可扩展至五个或更多突变。这些技术的发展为离子通道生物物理学家探索离子通道功能及门控的基本特性铺平了道路。此外，它们还使研究人员能够研究由离子通道基因单个突变所引起的人类疾病。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

异源表达在哺乳动物细胞离子通道的突变和功能分析

优化的转染策略用于在HEK-293T细胞中表达及记录重组电压门控离子通道的电生理特性

本文描述了将一种原型电压门控钾通道完全重建到脂质膜中的操作步骤。重建后的通道适用于生化分析、电生理记录、配体筛选以及电子晶体学研究。这些方法可能普遍适用于其他膜蛋白的结构与功能研究。...

将Kv通道重构至脂质膜中用于结构与功能研究

本文介绍了一种利用细胞贴附式膜片钳技术，从单个离子通道获得长时间电流记录的操作步骤。该方法能够实时观察离子通道开闭构象变化的模式，从而揭示生物信号产生的基础。这些数据可提供关于未受干扰的生物膜中离子通道特性的信息。...

单通道细胞贴附式膜片钳记录

本文介绍了一种快速且有效的功能重建方法，可用于重建纯化的野生型和突变型CFTR蛋白，该方法能够保持这种氯离子通道的活性，而CFTR在囊性纤维化中存在功能缺陷。通过CFTR介导的重建蛋白脂质体中的碘离子外流，可研究通道活性以及小分子化合物的作用。...

纯化野生型和突变型CFTR蛋白的功能性重构及通道活性测定

本文的第一部分介绍了如何筛选在细胞质膜上表达囊泡型 Na+/H+ 交换体的突变细胞系。第二部分提供了基于细胞内 pH...

利用质子杀伤筛选法在质膜上表达细胞内区室 Na+/H+ 交换体并进行功能表征

遗传性心律失常通常由突变引起，这些突变会改变一种或多种离子通道在细胞表面的递送。本文中，我们改进了流式细胞术检测方法，用于定量分析在tsA-201细胞中表达的重组离子通道的总蛋白和细胞表面蛋白的相对表达水平。...

利用流式细胞术测定重组离子通道的细胞表面相对表达量与总表达量

通过异源表达系统研究离子通道已成为生物医学研究中的一项核心技术。在本论文中，我们介绍一种高效的时间控制方法，通过在可诱导启动子调控下进行瞬时转染，实现对离子通道表达的精确调控。...

通过可诱导瞬时转染实现离子通道表达的可控调控

离子通道的纯化通常具有挑战性，但一旦成功，就有可能使其得以 体外 对通道功能与结构的研究。在此，我们描述了表达与纯化哺乳动物 bestrophin 蛋白（一类 Ca²⁺ 激活的氯离子通道）的逐步操作步骤。2+-激活的 Cl-...

哺乳动物Bestrophin离子通道的表达与纯化

本方案描述了利用冷冻电子显微镜测定离子通道结构的技术，包括用于在哺乳动物细胞中高效表达基因且操作简便、毒性最低的杆状病毒系统，蛋白质提取、纯化及质量检测，样品载网的制备与筛选，以及数据收集与处理。...

人源脂质敏感型阳离子通道TRPC3的表达与纯化及其通过单颗粒冷冻电镜进行结构解析

本方案描述了一种通过测量膜电位变化来研究生电性膜蛋白的方法。该检测方法为功能性读取上皮细胞系中内源性表达的多种离子通道提供了平台。...

一种基于荧光的膜电位检测方法，用于高通量功能研究两种上皮细胞系中的两种内源性离子通道

靶向离子通道的药物干预是治疗实体瘤的一种有前景的策略。本文提供了详细的操作方案，用于表征癌细胞中离子通道的功能，并检测离子通道调节剂对癌细胞存活力的影响。...

癌症细胞中离子通道的筛选

学习利用定点突变和全细胞膜片钳技术在哺乳动物细胞中研究GRK离子通道突变效应的方法。该方案为神经科学和电生理学研究者提供了研究离子通道功能与疾病相关突变的实用框架。

在哺乳动物细胞中异源表达离子通道的诱变与功能分析

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