在哺乳动物细胞中异源表达离子通道的诱变与功能分析

G蛋白门控内向整流钾通道（G-protein gated inwardly rectifying potassium channels，简称grk）在调节神经元兴奋性方面具有重要作用。grk可通过G蛋白偶联受体（GPCRs）（如毒蕈碱受体M2R）以及酒精来激活，以研究gerk酒精结合位点突变的影响。在激活时，通过定点诱变技术将单个点突变引入grk cDNA，将纯化的gerk表达质粒与YFP表达质粒共转染至哺乳动物细胞中，并通过荧光成像评估转染效率。

随后进行全细胞膜片钳分析，以比较酒精和G蛋白依赖性激活作用。本实验的可视化演示将为您提供研究LY通道功能的关键信息。今天我们将探讨酒精如何激活离子通道这一问题。

此处展示的位点定向新生技术可为离子通道功能的研究提供重要见解。该技术也可应用于其他已知基因突变导致人类疾病的系统。热细胞膜片钳技术的演示至关重要，因其涉及多个需要精确操作、适当的电子补偿以及反复练习才能获得可用数据的步骤。

本方案中用于转染的DNA按如下步骤制备：首先，将PCR获得的GRK亚基DNA直接克隆至哺乳动物表达质粒pcDNA3.1中，并利用特异性设计的引物，结合Quick Change XL双位点定向突变试剂盒引入点突变。

利用该系统进行PCR，使整个质粒被复制，同时由引物编码的点突变被引入。PCR完成后，复制的质粒用DpnI限制性内切酶消化，然后通过热激法转化至XL10-Gold超感受态大肠杆菌中。转化后的细菌在含氨苄青霉素的LB琼脂平板上培养；含有质粒的细菌具有氨苄青霉素抗性，能够形成菌落。

挑取分离的菌落并接种于微型培养物中进行培养。通过质粒小提操作分离质粒DNA，随后对DNA进行测序，以鉴定成功转化的突变株。

将大肠杆菌扩大培养，并进行大量提取以制备较大量质粒DNA，将约1×10⁵个HEK293T细胞接种至12孔板中的两个孔内，每孔分别用于突变组和对照组。野生型通道在37摄氏度下孵育。

8至24小时后，细胞将贴附于基质上，可进行转染。根据制造商说明书，使用Lipo 2000将0.2微克通道cDNA、0.4微克M2R受体cDNA和0.04微克YFP-cDNA共转染入细胞。为鉴定成功转染的细胞，将细胞继续培养24小时。

在完成所需的孵育时间后，将细胞置于倒置荧光显微镜的载物台上，以评估转染效率。通过比较荧光图像与微分干涉相差（DIC）图像，确定被转染细胞的百分比。随后将培养皿放回培养箱中继续培养。

将12毫米的玻璃盖玻片清洗干净，并在使用前保存于乙醇中。在无菌操作台中通过火焰灼烧去除残留乙醇。将盖玻片放入24孔板中，并用0.2毫克/毫升的溶液进行包被。

转染后24小时，用胰蛋白酶消化细胞，以每孔4×10³个细胞的密度接种于多聚赖氨酸包被的玻璃盖玻片上，置于24孔板中，每板4至8孔。继续培养24至48小时，然后进行全细胞膜片钳记录。使用两步式垂直拉制仪和硼硅酸盐玻璃毛细管制备膜片电极。

理想情况下，制备完成的电极电阻应在三到七兆欧姆之间，且无需进行热抛光等额外处理。进行膜片钳实验时，将转染细胞的盖玻片放入含有20毫摩尔钾或20 K外部溶液的35毫米培养皿中。然后将培养皿置于倒置荧光显微镜的载物台上。

此处使用的膜片钳装置采用灌流系统。该系统包含将施加于细胞的细胞外溶液，溶液通过连接至多通管路的管道，依靠重力流入。每种溶液均由电磁阀远程控制。

使用微分干涉相差（DIC）显微镜调焦并寻找细胞。切换至YFP滤光片以定位YFP阳性细胞。一旦确定YFP阳性细胞，将灌流系统的尖端置于距离该荧光细胞20至30微米或两到三个细胞长度的位置。

用细胞内电极液填充电极。使用注射器和柔性针头，轻轻敲击已填充的电极，以去除尖端的气泡。将电极连接至 AXO patch 200 B 放大器的前置放大头阶段。

再次检查放大器上的设置是否与一种配置相等。全细胞开关为 beta 等于 1，低通滤波器设置为 10 千赫兹。使用注射器施加正压并用夹子固定，以保持电极尖端清洁。

然后使用显微操作器将电极尖端放入浴液中，并移动至细胞上方。将放大器切换至电压跟踪（V track）模式，并将表头旋钮调至电压跟踪（V track）档位。接着使用放大器上的移液电极偏移电位表，调节使放大器电压表显示为0.00，以将移液电极电位调零。

或者，将放大器切换至电压钳模式，并选择测试脉冲按钮以施加测试电压阶跃。矩形电压阶跃将出现在钳制系统的封接测试窗口中。调节放大器上的移液管偏移，使基线电流回到零纳安。

封接测试将显示电极电阻，其值应在三到七兆欧姆之间。接下来，关闭封接测试窗口。在下拉菜单中选择“获取开放协议”。

然后选择一个已保存的电压程序。此处选择的程序已预先设定为每两秒施加一次从负100毫伏到正40毫伏的单步电压。该斜坡程序可用于观察GK通道的反转电位及其内向整流特性。

对于电压门控离子通道，可采用矩形电压阶跃。使用显微操作器微调，接近细胞，释放正压；接触细胞表面后，施加轻微负压。在封接测试中监测电阻的相应升高。一旦电阻达到吉欧姆（giga ohm）范围，即表明电极已与细胞膜形成紧密封接。

这被称为吉欧密封。使用注射器施加负压脉冲以破裂膜，从而进入细胞内部。一旦形成全细胞构型，封接测试将记录到较大的电容电流，这些电流在测试开始和结束时表现为尖峰或瞬时信号。

进行封接脉冲测试。接着，点击膜测试按钮。在钳制模式X下，记录通路电阻和膜电阻。

通过肉眼观察笔记本中的膜电容数据，验证其是否符合指数拟合。膜电容与细胞大小成正比，将用于计算电流密度。串联电阻和膜电阻用于评估记录结果是否满足后续实验的要求。

良好的记录应具有较低的接入电阻。现在关闭膜测试窗口，再次点击封接测试窗口中的封接测试按钮，将输出电压（V out）设为负40毫伏，以补偿放大器上的膜电容和串联电阻。打开全细胞模式（whole cell cap），反复调节全细胞补偿和串联电阻，直到瞬变电流最小化且电流呈一条水平直线。如有需要，可使用放大器上的快速电容（fast cap）旋钮调节移液管电容。

过度或不足的补偿都会导致残余容性瞬变。接下来，将预测百分比旋钮调至60%到80%，根据需要重新调整全细胞电容串联电阻和快速电容，以在封接测试中获得一条平坦的直线。最后，在不引起细胞振荡的前提下，将百分比补偿调至约100%，同时通过重新调节全细胞电容串联电阻和快速电容电位计，尽量使脉冲保持线性。

完成电阻和电容补偿后，将放大器电容串联电阻百分比、补偿百分比预测值及滞后时间的设定值记录在实验记录本中，打开外部溶液阀门以引入对照的 20 K 浴液。将放大器上的低通滤波器设置为 2 千赫兹。然后点击软件中的“记录”按钮，开始记录电流。

观察格列本脲（ger）电流的内向整流特性。该特性表现为：在钾离子反转电位（由Nernst方程EK确定）负侧出现较大的内向电流，而在EK正侧仅出现较小的外向电流。在记录到稳定的基线后，通过施加含20 mM K⁺和卡巴胆碱（carbachol）的细胞外溶液，检测受体介导的电流激活情况。

当观察到峰值激活且电流达到稳态后，切换回K浴液，并等待电流恢复至基线水平。接下来研究酒精对gert电流的激活作用。切换至含20 mM K及100毫摩尔/升乙醇的胞外溶液，并等待峰值反应出现。

然后切换回 20 K 浴液，并等待电流基线水平恢复。最后，为确定基础的 gert 电流，切换至含 20 K 和 20 K 氯化钡的溶液，并在此条件下等待电流反应稳定。在整个实验过程中，girk 电流的抑制效应应清晰可见，且在 -100 毫伏时最为显著。

记录施加不同细胞外溶液时对应的扫描次数。单个钳制拟合文件将包含整个实验的所有扫描数据。分析GK数据时，请使用Clamp FIT 8.2软件。

根据随附书面方案中的说明，从表达野生型或突变型GK通道的HEK 293T细胞中获得了两种不同的全细胞记录，并按照本视频中的说明进行分析，此处以野生型GK2为例展示。左侧图板包含一个窗口，其中显示了在不同溶液存在下通过电压斜坡方案产生的多个叠加电流。请注意其向内整流特性。

在电流轨迹上约50毫秒处，负100毫伏时出现较大的内向电流。在电流轨迹上约200至260毫秒处，0至正40毫伏之间的小幅外向电流来源于内源性电压门控钾通道。它并非Gert电流光标。

一个光标放置在最大内向电流处，光标数值将写入电子表格。在电子表格中，可查看迹线编号以及在负100毫伏时的电流值。

数据包括基础电流、卡巴可诱导电流和酒精诱发电流，以及钡抑制电流。同样展示了在不同溶液存在下的电压斜升电流，即突变通道 L 2 57 w 在含有 20 k 加 100 毫摩尔乙醇、或 20 k 加 5 毫摩尔卡巴可、或 20 k 加钡溶液中的电流。

注意酒精和碳水化合物诱导的电流显著减小。这些结果表明，该残基在酒精和G蛋白βγ亚基对GK通道的门控过程中起着重要作用。观看本视频后，您应能够很好地掌握如何构建一个突变体，并利用先进的电生理技术研究其对通道功能的影响。

一旦掌握，该定点诱变技术可在两到三天内完成，并可扩展至五个或更多突变。这些技术的发展为离子通道生物物理学家探索离子通道功能及门控的基本特性铺平了道路。此外，它们还使研究人员能够研究由离子通道基因单个突变所引起的人类疾病。