分析的预微RNA和小分子RNA采用实时定量PCR（定量PCR）阵列

该程序的总体目标是允许快速可靠地自动设置基于 QPCR 的阵列。这是通过首先为阵列准备引物组并设置要筛选的样品预混液来实现的。接下来，使用自动机器人 PCR 设置或基质电子移液器系统将 Eloqua 样品预混液和引物组准确 Eloqua 样品到 384 孔板的每个孔中。

制备完成后，使用 light cycler 4 80 cyber 基于 PCR 程序运行 384 孔 PCR 反应。该程序的最后一步是分析 QPCR 数据并确定每个测试引物对的相对表达水平，每个引物对都靶向特定的 mRNA。最终，可以获得显示大量 mRNA 表达变化的结果。

因此，专门开发的芯片可以通过基于 QPCR 的分析靶向整个前微 RNA 谱、特定通路或对病毒感染至关重要的分子。您好，我是来自北卡罗来纳大学教堂山分校微生物学和免疫学系的 Dirk DMA。今天我们将向您展示如何设置实时 QQPC rra，我们将向您展示两种方法。

一种使用不规则的移液器，另一种使用机器人。我们使用这项技术来测量人类肿瘤中的前 microRNA 和成熟 microRNA。今天的演示将由 Pauline Chu 和 Kristen bu 完成。

那么让我们开始吧。要开始此过程，请在 96 中检索包含 186 对引物的引物板。孔格式为 0.5 皮卡摩尔，储存在零下 20 摄氏度。

在室温下解冻板后，涡旋并短暂离心。此外，在室温下解冻 Cyber Green 两次 PCR 混合物，用于设置每个 96 孔引物板，需要四个预混管。将 4 μL Cyber Green、3 μL PCR 级水和 10 至 20 ng 样品 DNA 或 CDNA 混合在 4 个 2 mL 规格管中，每个反应中混合制备预混液。

每管应包含足够进行大约 100 次反应的预混液，允许过量用于移液废液。涡旋 einor 管混合。使用 freedom Tecan EVO 机器人开始设置前体 micro RNA 检测，初始化机器人并加载 EVO 佩戴程序。

然后用 30 mL 系统液体冲洗机器人 3 次，以清除系统中会干扰移液准确性的气泡。接下来，设置机器人平台以包括 384 孔板和 96 孔引物板。母料混合一个含有 2% 漂白剂的槽、一个装满的系统、液体容器和一个空的废物容器。

通过在程序结束时选择 run twice 来开始自动化机器人运行。取下 384 孔板，用 light cycler 密封四个 80 天花板箔。然后离心板。

将密封的 384 孔板短暂地放在酒店的位置 1 上。然后对引物板 2 重复此过程，使用新的预混液和新的 384 孔板。将生成的密封 384 世界板放在旅馆的第二个位置。

打开一个新的 EVO 磨损程序，从酒店加载 light cycler 并设置骑行参数。然后选择 run twice。Freedom Evo 会自动将每个板加载到 light cycler 中，并运行 cyber green one HRM 循环程序。

一旦完成。按照书面协议中的描述查看和分析结果，作为使用机器人的替代方案。可以使用矩阵电动多通道移液器开始将预混管 1 的内容物放入储液器中。

将电动移液器设置为吸出 16 μL 预混液，分两个 8 微升分液步骤，然后是吹扫步骤。设置移液器后，吸出 16 微升预混液并开始分配到 384 转盘中。使用第 A 行到 O 行将前 8 微升分装到第 1 列的每隔一行中，将下一列留空。

将后 8 微升分装到第 3 列的同一行中。然后清除废液容器并按照这种保留交替行和交替列的模式处理吸头。在板上再分液 5 个循环，以移液预混液 2。

使用与预混液 1 相同的行，但从第 2 列开始。对预混液 3 和 4 重复此过程，分别从第 1 列和第 2 列开始，但这次使用玫瑰 B 到 P.Her 引荐引物板。将电动移液器设置为吸出 2 μL，并分配 2 μL，并执行清除步骤。

将两微升引物从 96 孔引物板的第 A 行到 H 列转移到 384 孔板的每隔一列划船柱上，吹扫废液容器并丢弃吸头。对第 1 列和第 2 列的其余三种预混液的 quatt 引物重复此模式。然后对 96 孔引物板的第 2 至 12 列继续此过程，对于每个引物柱，在 384 孔板中的每两根柱上移动。

接下来，用 light cycler 天花板、箔和离心机密封板。离心后短暂。将板放入 light cycler four 80 中，并使用 Cyber green one HRM 检测格式循环板。

使用与之前相同的循环条件，使用新鲜制备的预混液将两个 Eloqua 引物板放入新的 384 孔板中，重复此过程。前体 micro RNA 特征通过使用基于 QPCR 的新型阵列进行分析而出现。计算归一化为 U 6 的平均 delta CT，并将标准化值加载到数组中。

次要软件生成三个不同的集群，显示为热图。每个前体微 RNA 的相对表达显示为红色和蓝色，分别代表相对表达的增加和减少。颜色强度表示表情变化的程度。

正如预期的那样，大多数前体 microRNA 发生了微小的微小变化。然而，在整个时间过程实验中，一小部分前体 microRNA 显著增加。此外，一些前体 microRNAs 的相对水平急剧下降。

在某些情况下。它们在热图分析中也聚集在一起。根据实验的不同，可能会出现依赖于病毒感染的簇，前体 microRNA 的细胞类型特异性表达或受共同分子或信号通路调节的前体 microRNA 的表达。

显示了来自 Posey 肉瘤相关疱疹病毒阴性样本的平均周期阈值或 cts，运行四重副本。重要的是，高灵敏度 QPCR 芯片在该样本中未检测到卡波西肉瘤相关疱疹病毒潜伏期相关核抗原或 KSHV Lana。然而，内部对照 U six 和 let 7 a a 高度表达的人前体 micro RNA 均以可检测水平表达。

最后，正如预期的那样，PCR 级水的阴性对照没有产生 A-Q-P-C-R 产物。两种不同引物的熔解曲线分析。将显示使用相同的采样副本。

很明显，两个引物对的熔解温度不同，但每个重复样品的熔解温度完全相同。样品质量不良或可能受到污染的迹象可能包括多个熔解峰，表明存在两种不同的起始量来源。我们刚刚向您展示了如何使用机器人设置实时 QPCR 实验。

包括所有对照和尽可能多的管家基因。因此，感谢您的观看，祝您的实验好运。