在哺乳动物的中枢神经系统视神经横断后的实验操作方法
May 12th, 2011
视神经横断是一个成人中枢神经系统损伤的广泛使用的模型。这种模式是执行的全球目标的视网膜或直接目标受伤的视网膜神经节细胞神经元群的实验操作的理想选择。
视网膜神经节细胞或 RG cs 是中枢神经系统神经元，通过视神经将视觉信息从视网膜传递到大脑。在配套视频中，展示了一种鸡奸或切割整个 RGC 群体的轴突的方法，作为成人中枢神经系统凋亡神经细胞死亡的模型。在这里，该方法与直接靶向神经营养因子、短干扰 RNA、质粒或病毒载体的程序相结合，这些程序编码抗 ATO 蛋白到受伤的视网膜神经节细胞或视网膜以全面靶向视网膜。
组装眼内注射装置，用于将物质注射到眼睛的玻璃体腔中，以专门针对视网膜神经节细胞。放置 Gelfoam 或使用 Hamilton 注射器将物质注射到视神经中。残端成像结果表明，通过递送抗凋亡因子可以提高视网膜神经节细胞的存活率。
使用这些技术，该方法可用于识别参与中枢神经系统成体神经元凋亡的蛋白质。这项技术的影响延伸到中枢神经系统疾病的治疗或诊断，因为视神经横断是成人中枢神经系统神经元凋亡的可重复模型 一般来说，那些刚接触这项技术的人会很挣扎，因为他们在将玻璃移液器插入眼睛的玻璃体腔时会损坏晶状体。要准备用于眼内注射的注射器系统，首先要卸下任何针头或 RN 螺母。
存在于 10 μL rn 气密 1701 Hamilton 注射器上。将 PFA feral 插入压缩接头的 peak cup feral 中。然后将整个接头插入注射器的末端，并将 RN 螺母松散地拧到顶部。
通过 RN 螺母中的开口将一根 16 英寸峰值管的一端插入压缩接头。确保 peak 管路完全就位。拧紧 RN 螺母以压缩 feral，这将密封峰管。
在双 RN 玻璃耦合器的两端重复此过程。通过拧紧 RN 螺母支架，将峰管的自由端连接到双 RN 玻璃耦合器的一端。玻璃微量移液器将形成注射系统的针头和针筒。
将玻璃移液器插入双 RN 玻璃耦合器的自由端。拧紧 RN 螺母以将移液器固定到位。在解剖显微镜下，以一定角度握住拉动的微量移液器，然后沿着载玻片的玻璃磨砂摩擦尖端以产生断裂，从而创建具有适当直径的尖端。
理想情况下，最后一个尖端应略微斜面。接下来，使用 Hamilton Syringe Company 的灌注套件，该套件填充了注射器、峰管接头、双 RN 玻璃耦合器和含矿物油的玻璃微量移液器。使用液压注射系统，用 Hamilton 9 0 0 3 0 针替换针头。
接下来，在 Hamilton 9 0 0 3 0 针头上放置橡胶隔膜，以便在注射矿物油时提供密封。将灌注注射器的 Hamilton 9 0 0 3 0 针头插入注射系统的 10 微升 Hamilton 注射器的针筒背面。将隔膜紧紧压在注射器的末端以形成密封。
慢慢按下柱塞矿物油将穿过注射系统的玻璃元件。填充玻璃移液器。将所有油推入注射系统，以去除沿道的任何气泡。
如果充填注射器的矿物油用完，请缓慢抽出针头，同时不断分配油。为防止气泡形成，请重新填充灌注注射器并再次注射。当整个系统充满矿物油时，插入 10 微升的原始柱塞。
Hamilton 注射器完全压下柱塞，从系统中去除额外的矿物油。将玻璃微量移液器和注射器末端擦拭干净。用 70% 乙醇，将柱塞抽出至桶上的 2 微升标记处。
玻璃微量移液器的末端将充满空气，在矿物油和待注射液体之间提供缓冲区。将微量移液器的末端放入所需的溶液中，然后抽出 Hamilton 注射器的柱塞，从而填充移液器桶。将不超过 4 到 5 微升的溶液注射到成年大鼠的眼睛中以进行眼内注射。
首先将气流切换到立体定位框架的防毒面具附件。然后将 isof 氟麻醉大鼠放入立体定位装置中。将 isof 氟浓度降至 2% 并监测麻醉。
用手术毯盖住动物。为了在整个手术过程中保持体温，请打开眼睑并滴入一滴 acan 麻醉液。在角膜表面注射需要两个人，一个人将玻璃移液器插入玻璃体腔并保持移液器位置。
另一个用于按下注射器上的柱塞，从而提供所需的解决方案。在手术显微镜下，握住玻璃微量移液器和双 RN 玻璃耦合器，将眼睑展开，形成 V 形，与注射部位相对，用手指，眼睛会抬出眼眶。轻轻地将玻璃微量移液器的尖端插入没有血管的区域，并以向下的角度穿过巩膜。
当移液管穿透巩膜时，会感觉到一声小的爆裂声。拿着注射器的人现在应该通过将柱塞压到注射器上的 2 微升标记来注入 4 微升溶液。注射大约需要 1 到 2 秒。
成功注射的溶液将冲洗玻璃体腔，保持微量移液器稳定约 5 秒钟，然后沿插入针头的相同方向抽出。当针头插入时，结膜将在小开口上拍打，帮助密封巩膜穿刺。手术完成后，关闭 isof 氟并让动物呼吸氧气几分钟。用眼药膏覆盖角膜表面 为了防止恢复过程中角膜干燥，然后将动物从立体定位装置中取出，并将其放回恢复笼中。
通过耳廓术后逆行运输纵视网膜神经节细胞。首先根据随行视频视神经横断方案、2、2、4、1 示踪剂药物中的说明进行视神经横断术。质粒、siRNA 或病毒载体可应用于视神经残端。
有两种主要方法可以完成此过程：使用凝胶泡沫或直接注射到视神经中。如果使用凝胶泡沫法，请确保在分类前一周通过将逆行示踪剂注射到上丘中来预先标记视网膜神经节细胞。切开视神经后，立即将一小块浸泡在实验溶液中的凝胶泡沫放在横断的视神经残端上，然后将眼眶内容物放回先前的位置。
当眼睛恢复到中立位置时，用镊子将凝胶泡沫片向下推入眼眶，确保它保持在视神经末端。注射技术对于必须进入轴突细胞质才能通过 op plasmic 流逆向运输的物质更有效，使用气密 10 微升 Hamilton 注射器将所需的溶液注射到横断的视神经中。需要带有短斜面的针。
向注射器中加入 10 微升要注射的溶液。通常，用于注射的 irna 质粒或病毒载体用细尖 dumont 镊子夹住视神经的边缘。将针头的末端插入与神经平行的视神经。
在斜面不再可见之前，插入的针头将被神经四面八方包裹。插入针头后，用细尖镊子轻轻挤压神经两侧，并在旋转注射器的同时注入四分之一的溶液。顺时针或逆时针旋转四分之一圈。
继续重复这些步骤，直到针头完全旋转完成并且注射器的全部内容物都已注射。从神经中取出注射器的尖端。将任何从神经回流的注射液体留在眼眶内，因为这将形成一个额外的池，供轴突末端吸收。
将眼眶内容物恢复到原来的位置，缝合伤口，让动物恢复。手术后应独立饲养动物。术后镇痛药应根据您的动物护理指南进行给药。
手术后应仔细监测当局和动物。如本视频所示，可以通过将肽、药物、载体、质粒或 siRNA 递送到横断的视神经残端来直接靶向 RGC。在这个代表性的例子中，进行了氟金逆行标记，并立即将 SI 三个标记的肽注射到视神经中。
然后进行视网膜的实时成像，以防止肽在固定过程中从组织中浸出，如图所示，注射到视神经的 SI 三个标记肽是逆转录的，大大地运输回视网膜中的 RGC 体。在这个例子中，SI 三个标记的 siRNA 被注射到视神经残端中。在再次进行视网膜分类和实时成像后，立即将 SI 三个标记的 siRNA 注射到视神经中，由 RG CS 转运，如它们的共定位所示。
使用 fluorgold 逆行标记 一旦掌握，如果作得当，这项技术可以在几秒钟内完成。尝试此过程时，请务必注意避免损坏镜头。不要忘记，与病毒颗粒一起工作可能非常危险，在执行此程序时应始终遵循处理生物危害的机构指南。
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概述
本文讨论了视神经切断模型，该模型常用于研究成年中枢神经系统损伤。它专注于针对视网膜神经节细胞（RGCs）的实验操作，以了解凋亡性神经细胞死亡。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 神经生物学
背景
- 视网膜神经节细胞传递视觉信息从视网膜到大脑。
- 视神经切断作为研究中枢神经系统损伤的模型。
- 了解RGC存活对于开发治疗策略至关重要。
- 实验操作可以针对神经营养因子和其他药剂。
研究目的
- 展示一种切断RGC轴突的方法。
- 探索抗凋亡因子对RGC存活的影响。
- 提供有关中枢神经系统损伤潜在治疗的见解。
使用的方法
- 用于向眼睛注入物质的眼内注射装置。
- 使用Gelfoam或Hamilton注射器进行视神经注射。
- 应用神经营养因子、短干扰RNA和质粒。
- 残端成像以评估治疗后RGC存活。
主要结果
- 展示了RGC轴突切断的方法。
- 通过输送抗凋亡因子增加了RGC存活。
- 成功针对受伤细胞的神经营养因子。
- 了解神经细胞死亡和存活的机制。
结论
- 视神经切断模型有效用于研究RGC。
- 针对神经营养因子可以增强RGC存活。
- 这项研究有助于理解中枢神经系统损伤和潜在疗法。
常见问题
Executive Industry Relevance
The optic nerve transection model provides a reproducible system for studying apoptotic neuronal cell death in the adult CNS, enabling target validation of neuroprotective pathways. By allowing precise delivery of therapeutic agents to retinal ganglion cells via intraocular or retrograde routes, the model supports mechanistic de-risking in early discovery. This approach enhances predictive confidence for CNS injury interventions by isolating RGC-specific responses without confounding glial or bystander effects.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of apoptotic pathways in a defined neuronal population to validate therapeutic targets.
- Operational Value: Provides a standardized axotomy model for consistent target engagement assessment across studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of validated RGC systems for screening neurotrophic factors, siRNAs, plasmids, or viral vectors.
- Operational Value: Supports assay standardization through reproducible drug delivery via vitreous chamber or optic nerve stump.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Offers disease-relevant RGC apoptosis kinetics (3-4 day delay) to time interventions against cell death pathways.
- Operational Value: Enables longitudinal assessment of target modulation through stump imaging and retrograde transport readouts.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling target validation and lead identification through direct manipulation of RGC survival pathways post-axotomy.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of apoptosis regulators by isolating RGC responses to injected agents.
- Screening: Delivers quantitative survival readouts via stump imaging to compare compound efficacy.
- Analytics: Generates measurable outcomes (e.g., RGC survival rates) to inform go/no-go decisions in target validation.
- Translational Research: Aligns with preclinical continuity by modeling human optic nerve injury mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for CNS target validation across neuroprotective modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity in RGC apoptosis studies.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized intraocular injection and optic nerve stump procedures.
- Strategic Value: Improves portfolio triage by enabling early identification of ineffective neuroprotective candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by providing preclinical evidence of target modulation in a relevant neuronal model.
Implementation Considerations
- Requires microsurgical expertise for optic nerve transection and vitreous chamber access.
- Depends on specialized instrumentation including Hamilton syringes, glass micropipettes, and stereotaxic frames.
- Necessitates cross-team standardization of injection volumes and survival assessment timing.
- Involves adaptation considerations for different agent types (e.g., viral vectors vs. siRNAs) based on delivery route efficiency.
- Includes practical limitations such as lens damage risk during vitreous injection and variability in retrograde transport efficiency.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:13
Introduction
1:44
Syringe Preparation for Intraocular Injections
4:48
Intraocular Injection Procedure: Targeting the Retina Globally
6:50
Selectively Targeting Retinal Ganglion Cells from the Optic Nerve Stump
9:28
RGC Targeting by Injection of the Transected Optic Nerve Stump
10:31
Conclusion
