哺乳动物中枢神经系统视神经横断后的实验操作方法

视网膜神经节细胞（RGCs）是中枢神经系统中的神经元，负责通过视神经将视觉信息从视网膜传递至大脑。在配套视频中，已展示了一种用于在体外切断全部RGC群体轴突的方法，作为成年中枢神经系统中凋亡性神经细胞死亡的模型。此处，该方法与直接靶向神经营养因子、短干扰RNA、质粒或编码抗凋亡蛋白的病毒载体的技术相结合，以靶向损伤的视网膜神经节细胞或整体视网膜。

组装一种眼内注射装置，并将其用于向眼球玻璃体腔内注射物质，以特异性靶向视网膜神经节细胞。可通过放置明胶海绵或使用Hamilton注射器向视神经注射物质。残端成像结果表明，递送抗凋亡因子可提高视网膜神经节细胞的存活率。

利用这些技术，该方法可用于鉴定参与中枢神经系统成年神经元凋亡的蛋白质。该技术的应用前景包括中枢神经系统疾病的治疗或诊断，因为视神经横断是成年中枢神经系统神经元凋亡的一个可重复模型。通常，初学者在操作该技术时会遇到困难，原因是在将玻璃移液管插入眼球玻璃体腔时容易损伤晶状体。为准备用于眼内注射的注射器系统，首先应移除针头或RN螺母。

将10微升无菌耐压1701型汉密尔顿注射器准备好。将PFA毛细管插入压缩接头的峰杯毛细管中。然后将整个接头插入注射器末端，并将RN螺母松松地拧在顶部。

将一段1/16英寸峰管的一端穿过RN螺母的开口，插入压紧接头中。确保峰管完全就位。拧紧RN螺母以压紧密封套环，从而密封峰管。

在双联RN玻璃耦合器的两端重复此操作。通过拧紧RN螺母，将峰管的游离端连接到双联RN玻璃耦合器的一端。玻璃微量移液管将构成注射系统的针头和管体。

将玻璃移液管插入双通道RN玻璃连接器的自由端。拧紧RN螺帽以固定移液管。在解剖显微镜下，通过将拉制好的微移液管以一定角度持握，并将其尖端在载玻片的磨砂玻璃面上轻轻摩擦以产生断裂，从而制备出合适直径的尖端。

理想情况下，最终的针尖应略微呈斜面。接下来，使用来自Hamilton Syringe公司的引液套件，其中包含已填充矿物油的注射器、峰管连接器、双RN玻璃耦合器以及玻璃微量移液管，以备使用。使用液压注射系统时，将针头更换为Hamilton 9 0 0 3 0针头。

接下来，将橡胶隔垫盖在Hamilton 9 0 0 3 0针头上，以便在注入矿物油时提供密封。将装填用注射器的Hamilton 9 0 0 3 0针头插入注射系统10微升Hamilton注射器筒体的后端。将隔垫紧压在注射器末端，以形成密封。

缓慢下压柱塞，使矿物油流经注射系统的玻璃部件，从而填充玻璃微量移液管。将所有油液推过注射系统，以清除管道中可能存在的任何气泡。

如果填充注射器中的石蜡油即将用完，请在持续排出油液的同时缓慢撤出针头。为防止气泡形成，需重新填充引液注射器并再次注入。当整个系统充满石蜡油后，插入10微升注射器的原始推杆。

使用 Hamilton 注射器完全压下柱塞，以去除系统中多余的矿物油。擦拭玻璃微量移液管和注射器末端，保持清洁。用 70% 乙醇将柱塞回抽至针筒上 2 微升刻度处。

玻璃微量移液器的末端会充满空气，从而在矿物油与待注射液体之间形成一个缓冲区。将微量移液器末端插入所需溶液中，并回抽哈密尔顿注射器的推杆，以填充移液器管体。进行眼内注射时，注入成年大鼠眼内的溶液体积不得超过四到五微升。

首先将气体流量切换至立体定位仪的气体面罩接口。然后将一只经异氟烷麻醉的大鼠置于立体定位装置中。将异氟烷浓度调至2%，并监测麻醉状态。

用手术毯覆盖动物。为在整个手术过程中维持体温，打开眼睑并滴加一滴局部麻醉剂溶液。在角膜表面进行注射时需要两人配合，一人将玻璃移液管插入玻璃体腔，并保持移液管的位置。

另一个用于按压注射器的推杆，以注入所需的溶液。在手术显微镜下，用手指夹住玻璃微量移液管和双通道RN玻璃耦合器，将眼睑在注射部位对侧撑开成V形，眼球将随之从眼眶中轻柔抬起。将玻璃微量移液管的尖端轻轻插入无血管区域，以向下倾斜的角度穿入巩膜。

当移液器刺入巩膜时，会感觉到轻微的弹阻力。此时，持注射器者应推动活塞至注射器上的2微升刻度处，注入4微升溶液。注射过程应持续约1至2秒。

成功注射的溶液将流经玻璃体腔，保持微移液管稳定约五秒钟，然后沿与进针相同的方向撤出。结膜会翻转回盖住小切口，有助于封闭巩膜穿刺口。手术完成后，关闭异氟烷气体，让动物呼吸几分钟纯氧。为防止角膜在恢复期间干燥，需在角膜表面涂抹眼科眼膏，然后将动物从立体定位仪上取下，并放回恢复笼中。

通过外切术后的逆行运输来操控视网膜神经节细胞。首先根据配套视频“视神经横断实验方案”中的说明进行视神经横断，2, 2, 4, 1 示踪剂药物。可将质粒、siRNA 或病毒载体施加于视神经残端。

有两种主要方法可完成此操作：使用明胶海绵法或直接向视神经注射。若采用明胶海绵法，需确保在进行手术前一周，已通过向上丘注射逆行示踪剂对视网膜神经节细胞进行预先标记。视神经切断后，立即将一小块浸有实验溶液的明胶海绵覆盖在横断的视神经残端上，随后将眼眶内容物复位至原有位置。

当眼球恢复至中立位置时，使用镊子将明胶海绵推入眼眶内，确保其始终覆盖在视神经断端上方。该注射技术对于需要进入轴突胞质才能通过胞质流动发生有效逆行运输的物质递送更为有效。使用气密性10微升Hamilton注射器将所需溶液注入横断的视神经。建议使用短斜面针头。

用注射器吸取10 µL待注射溶液。通常为用于注射的irna质粒或病毒载体。用尖头杜蒙特镊子夹住视神经边缘。将针头末端平行于神经插入视神经内。

当针尖斜面完全不可见时，说明针头已从各个侧面被神经完全包裹。针头插入后，用精细尖头镊子轻轻夹住神经两侧，同时边旋转注射器边注入四分之一的溶液。旋转方向为顺时针或逆时针四分之一圈。

重复上述步骤，直至完成针头的完整旋转，并将注射器内的全部内容物注入。将注射器针尖从神经上移开。任何从神经回流的注入液体应保留在眼眶内，因为这将形成额外的液体池，供轴突末端摄取。

将眶内组织复位，缝合切口，并让动物恢复。动物在手术后应单独饲养。术后镇痛药物应根据动物护理指南给予。

术后应对动物和相关机构进行严密监测。如本视频所示，可通过将多肽、药物、载体、质粒或siRNA递送至横断的视神经残端，直接靶向视网膜神经节细胞（RGC）。在此代表性示例中，先进行氟金逆行标记，随后立即将SI三种标记多肽注射至视神经内。

随后对视网膜进行活体成像，以防止肽在固定过程中从组织中渗出。如图所示，将三种SI标记的肽注射到视神经后，这些肽被逆行运输回视网膜中的RGC胞体。在此示例中，将三种SI标记的siRNA注射至视神经残端。在横断术立即完成后再次进行视网膜活体成像，结果显示注射至视神经的三种SI标记siRNA通过RGCs逆行运输，其共定位结果可证明这一点。

通过氟金逆行标记，一旦掌握，若操作得当，该技术可在数秒内完成。在进行此操作时，务必注意避免损伤晶状体。切勿忘记，操作病毒颗粒可能具有极高危险性，在进行该操作时应始终遵守机构关于生物危害物操作的指导方针。