Name: 高分辨率光纤内窥镜为原位细胞成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T22:01:00.000+00:00
Duration: 13 min 49 s
Description: 学习组装高分辨率光纤微内窥镜系统，用于实时荧光成像观察细胞动态。该方法成本低、易于定制，可在体外、体内及人体中实现细胞水平成像，为神经科学和细胞生物学研究提供便捷工具。

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本研究部分由美国国立卫生研究院（R01 EB007594）、美国国防部乳腺癌研究项目（提案编号BCO74699P7）以及苏珊·G·科门基金会（资助编号26152/98188972）资助。

1. 微型内窥镜组装
此处描述的高分辨率显微内窥镜（图1a）应被视为一种基础配置，其组装和应用方式可有多种变体。本文详细描述了该平台的一种实施方案，该方案设计用于以普鲁黄（proflavine）作为荧光对比剂。普鲁黄是一种明亮的细胞核染料，其最大吸收波长和发射波长分别为445 nm和515 nm。若使用其他对比剂，用户需相应地选择合适的激发滤光片、发射滤光片和二向色镜。高分辨率显微内窥镜的多个组件具有通用性，可从多家供应商获取。例如，光学机械定位组件可从Thorlabs、Newport、Linos等公司获得。紧凑型CCD相机可从Point Grey Research、Prosilica和Retiga等公司采购；相机灵敏度的选择应考虑所用荧光染料的亮度以及所需的帧率。高功率发光二极管（LED）可从Luxeon、Cree和Nichia等公司获得。光纤束可从住友（Sumitomo）、藤仓（Fujikura）和肖特（Schott）等公司采购。在为特定应用选择组件时，用户应考虑荧光显微镜中涉及的内在关系，包括荧光染料浓度、光漂白、照明强度、相机灵敏度、增益和曝光时间之间的相互影响。
<ol>
<li>将6英寸笼杆与1.5英寸笼杆连接，形成一对7.5英寸长的杆。将这些杆拧入折叠反射镜单元的一个侧面。将0.5英寸杆拧入相对的侧面。通过笼式立方体下方的两个通孔将笼式立方体滑入笼杆上。将2英寸杆拧入笼式立方体的侧面（图1b）。</li>
<li>使用C接口转SM1适配器将相机连接至笼板。将笼板固定在0.5英寸笼杆上，使其与折叠反射镜单元的端面齐平。</li>
<li>将“管”镜片插入一个3英寸长的镜筒中，并用卡环固定镜片。应选择镜片的焦距，使得光纤束的纤芯投射到相机上时至少被两个像素采样。将发射滤光片放入镜筒中，置于第一个卡环之上，并添加另一个卡环以固定滤光片。注意遵循滤光片制造商标明的滤光片方向规范。将镜筒拧入靠近CCD相机一侧的笼式立方体侧面。注意在图1c中，为了清晰起见，该镜片和滤光片未显示3英寸镜筒。</li>
<li>将相机连接至计算机并在屏幕上查看图像。将笼式组件对准远处物体，并沿导轨滑动笼式立方体，直到图像清晰聚焦。在此位置锁紧笼式立方体。（这是一种简单的方法，用于确保管镜片与无限远校正物镜结合时能够形成清晰的图像。）</li>
<li>将二向色镜插入支架中，并以45°角放置于笼式立方体内。</li>
<li>通过RMS转SM1螺纹适配器和可调镜筒，将物镜拧入笼式立方体上与管镜片支架相对的端面。可使用z轴位移器替代可调镜筒以方便调焦。将SMA接头拧入笼板，并将该笼板安装在杆上，位置大约位于物镜的工作距离处。</li>
<li>将LED安装在笼板上，并滑入2英寸杆的末端。在0.5英寸镜筒中加入一个透镜，使得当该镜筒拧入笼式立方体侧面时，LED的像能够充满物镜的后孔径。这种（科勒照明）配置可确保光纤束近端面被均匀照明。将激发滤光片加入0.5英寸镜筒中，并用卡环固定（图1c）。</li>
<li>将SMA接头连接至光纤束。将带SMA接头的光纤束拧入安装在笼杆上的SMA插座中。将光纤束的远端对准宽带光源（荧光灯即可满足要求），并在CCD相机上观察光纤束近端面的图像。通过旋进或旋出笼式立方体来调节物镜的位置，直到光纤束图像清晰聚焦。各个纤芯应清晰可见（图2）。</li>
</ol>
2. GRIN 透镜组装
通过在光纤束的远端尖端连接微透镜或透镜组件，可以提高微型内窥镜的空间分辨率。这些光学元件的配置方式使得光纤束尖端不再直接接触组织，而是将尖端图像以缩小倍率投射到组织表面，从而提高光纤束中光导纤芯所决定的空间采样频率。缩小倍率的程度对应于空间分辨率的提升，同时也会导致视场范围相应减小。梯度折射率（GRIN）透镜组件与光纤兼容，可从GrinTech、NSG、Schott等公司获得，并可直接键合至光纤束的远端尖端。
<ol>
<li>根据您的应用需求选择合适放大倍数和工作距离的GRIN透镜。确保透镜的直径大于您计划使用的光纤束的直径。我们建议在低倍显微镜或体视显微镜下，将光纤束和GRIN透镜分别安装在独立的三轴手动位移台上，以便在粘接前进行精确对准。</li>
<li>在透镜或光纤束端面滴加一滴光学胶（例如Norland紫外固化胶）。使用手动位移装置使两个部件接触，并按照制造商推荐的剂量对界面进行紫外光照射。</li>
<li>为保护GRIN透镜及粘接界面，可使用一段短铝质毛细管（Small Parts Inc.）包裹接头。将毛细管套在接头处，并用环氧树脂固定。最后可使用热缩管完成组件封装。</li>
</ol>
3. 微型内窥镜成像
<ol>
<li>将对比剂应用于待成像的细胞或组织。使用荧光素（0.01% w/v 溶于 PBS）时， 体外 培养细胞的成像可通过短时间孵育（&lt; 1 分钟）并彻底冲洗。成像 离体 组织样本或 体内 在局部应用染料后，组织即可进行成像。在这些条件下，吖啶黄的摄取几乎是瞬时的，可在数秒内开始成像，并持续数分钟。</li>
<li>将光纤束轻轻接触待成像样品。在对培养细胞成像时 离体 组织样本，我们建议将光纤束的远端固定在带有手动XYZ轴定位平台的稳固装置中，以确保成像过程中的稳定性。</li>
</ol>
4. 代表性结果：

正确组装后，微型内窥镜将作为落射荧光显微镜运行，并通过相干光纤束进行信号传导。为获得最佳成像效果，应注意确保满足以下三个关键条件：
<ol>
<li>为了实现系统的完全分辨率，应将光纤束的近端面无离焦地成像到CCD相机上。图2a、2b、2c分别展示了聚焦不良、轻微离焦和良好聚焦条件下成像的光纤束局部图像。通过调节物镜相对于光纤束端面的轴向位置，可找到最佳焦距。</li>
<li>光纤束的近端面应在整个直径范围内（视场）实现均匀照明。如实验方案文本（1.7）所述，这可通过配置科勒照明（Kohler illumination）的照明光学系统来实现。图2d显示了在该优选配置下对均匀荧光样品进行照明时所获取的图像，而图2e则展示了临界照明条件下的相应结果。在后一种情况下，LED的结构被成像到光纤束端面上，导致该不希望出现的图案叠加在真实样品结构之上。</li>
<li>光纤束的近端面和远端面均应保持清洁，无划痕和碎裂。图2f展示了附着在光纤束端面上的污染物，以及在光纤周缘5点钟方向存在小碎片造成的损伤。可通过与常规光纤连接器相同的方式清洁光纤束端面，例如使用镜头纸和异丙醇，或标准的光纤清洁工具去除污染物。若光纤束任一端面出现划痕或碎裂，或沿长度方向发生断裂，可采用标准的手动或机械抛光技术将端面抛光平整。我们建议先使用12–15 μm的研磨纸进行初步粗抛，最后用0.5–1.0 μm的抛光纸进行精抛。</li>
</ol>
图3a展示了1483个细胞的成像 体外，使用原黄素标记并在样本上直接放置裸露的光纤束后。图3b展示了将一个2.5倍GRIN透镜粘合至光纤束末端后，空间分辨率的提升以及视场范围的缩小。视频1展示了 体内 小鼠模型中乳腺脂肪垫的成像。此处，使用外径为0.5 mm的光纤束（330 μm 视野）通过21号针头插入组织。脂肪细胞清晰可见，以每秒15帧的速度采集图像时，可观察到由心动周期引起的运动。图3c展示了对一名健康志愿者口腔黏膜的成像，此次使用外径为1.5 mm（视野1.4 mm）的较大光纤束。所有示例中均使用普鲁黄作为细胞核标记的荧光对比剂。

 <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig1.jpg" alt="通过光纤束进行组织成像的光学装置示意图；包括LED、二向色镜和CCD。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 高分辨率显微内窥镜（HRME）的组装。（a）HRME系统的示意图。（b）主要光机械支撑结构的组装。（c）光学元件、照明LED和CCD相机的安装。（d）HRME系统的实物照片，整体封装于一个10英寸×8英寸×2.5英寸的外壳中。
 <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig2.jpg" alt="显示纳米结构排列的显微图像；可能的衍射图样分析结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. HRME 的设置。使用光纤束成像的示例：(a) 焦点不佳，(b) 接近良好焦点，(c) 理想焦点。在 (d) 中，在科勒（均匀）照明下对光纤束远端尖端的均匀荧光目标进行成像。(e) 在临界照明下对均匀荧光目标进行成像，光源结构在样品上可见。(f) 松散的组织和细胞可能附着在光纤束端面，且其周边也容易受到轻微损伤。
 <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig3.jpg" alt="细胞培养物在不同放大倍数下的显微镜图像：比例尺分别为100 µm、40 µm和250 µm。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 使用HRME成像。（a）1483个细胞 体外，使用0.01%（w/v）普鲁瓦明标记后，以裸光纤束（IGN-08/30）成像。（b）与（a）相同的1483细胞培养物，使用附有2.5倍GRIN透镜的光纤束成像。（c）正常人口腔黏膜图像 体内，局部应用0.01%（w/v）普罗黄后。
视频 1. 通过将外径为 450 μm 的光纤束插入已穿入组织的 21 号针头腔内，对小鼠乳腺脂肪垫进行成像。在插入成像光纤之前，通过同一针头向成像部位输送 0.01% (w/v) 的普鲁黄溶液。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2306/5-11-1%202306_Pierce_movie1.avi">点击此处观看视频</a>

<ol><li>Pierce, M. C., Javier, D. J., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+contrast+agents+and+imaging+systems+for+detection+and+diagnosis+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Optical contrast agents and imaging systems for detection and diagnosis of cancer.</a> Int. J. Cancer. 123, 1979-1990 (2008).</li>
<li>Muldoon, T. J., Pierce, M. C., Nida, D. L., Williams, M. D., Gillenwater, A., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular-resolution+molecular+imaging+within+living+tissue+by+fiber+microendoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Subcellular-resolution molecular imaging within living tissue by fiber microendoscopy.</a> Opt. Express. 15, 16413-16423 (2007).</li>
<li>Muldoon, T. J., Anandasabapathy, S., Maru, D., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+in+Barrett%27s+esophagus%3A+a+novel%2C+low-cost+endoscopic+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointest.+Endosc%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging in Barrett's esophagus: a novel, low-cost endoscopic microscope.</a> Gastrointest. Endosc. 68, 737-744 (2008).</li>
<li>Muldoon, T. J., Thekkek, N., Roblyer, D., Maru, D., Harpaz, N., Potack, J., Anandasabapathy, S., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+quantitative+image+analysis+criteria+for+the+high-resolution+microendoscopic+detection+of+neoplasia+in+Barrett%27s+esophagus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Evaluation of quantitative image analysis criteria for the high-resolution microendoscopic detection of neoplasia in Barrett's esophagus.</a> J. Biomed. Opt. 15, 026027-026027 (2010).</li>
<li>Zhong, W., Celli, J. P., Rizvi, I., Mai, Z., Spring, B. Q., Yun, S. H., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+high-resolution+fluorescence+microendoscopy+for+ovarian+cancer+detection+and+treatment+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">In vivo high-resolution fluorescence microendoscopy for ovarian cancer detection and treatment monitoring.</a> Br. J. Cancer. 101, 2015-2022 (2009).</li>
<li>Dubaj, V., Mazzolini, A., Wood, A., Harris, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+fibre+bundle+contact+imaging+probe+employing+a+laser+scanning+confocal+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Optic fibre bundle contact imaging probe employing a laser scanning confocal microscope.</a> J. Microsc. 207, 108-117 (2002).</li>
<li>Dromard, T., Ravaine, V., Ravaine, S., Lévêque, J. -L., Sojic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+in+vivo+imaging+of+human+skin+corneocytes+by+means+of+an+optical+fiber+bundle%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Inst%22%5BJournal%5D)">Remote in vivo imaging of human skin corneocytes by means of an optical fiber bundle.</a> Rev. Sci. Inst. 78, 053709-05 (2007).</li>
<li>Udovich, J. A., Kirkpatrick, N. D., Kano, A., Tanbakuchi, A., Utzinger, U., Gmitro, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+background+and+transmission+characteristics+of+fiber+optic+imaging+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Spectral background and transmission characteristics of fiber optic imaging bundles.</a> Appl. Opt. 47, 4560-4568 (2008).</li>
<li>Barretto, R. P. J., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fluorescence+imaging+with+high-resolution+microlenses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses.</a> Nat. Methods. 6, 511-512 (2009).</li>
<li>Rouse, A. R., Kano, A., Udovich, J. A., Kroto, S. M., Gmitro, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+demonstration+of+a+miniature+catheter+for+a+confocal+microendoscope%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Design and demonstration of a miniature catheter for a confocal microendoscope.</a> Appl. Opt. 43, 5763-5771 (2004).</li>
<li>Kester, R. T., Christenson, T., Richards-Kortum, R., Tkaczyk, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+cost%2C+high+performance%2C+self-aligning+miniature+optical+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Low cost, high performance, self-aligning miniature optical systems.</a> Appl. Opt. 48, 3375-3384 (2009).</li>
</ol>

MP 和 DY 无任何披露内容。RRK 持有关于微内窥成像平台的专利。

高分辨率显微内镜技术为生物医学基础研究和临床研究领域的研究人员提供了一种灵活、可靠且经济高效的方法，用于观察细胞精细结构 原位我们已描述了一种成像系统的组装方案，并展示了其在细胞培养中的应用。 体外，以及动物和人体组织中 体内尽管本文展示的成像结果使用了吖啶黄作为荧光对比剂，但其他研究团队已展示了该系统的不同版本，其LED照明波长和滤光片经过选择，以匹配其他染料的激发/发射光谱。 5-7.
分辨率和视场最初由光纤束的纤芯间距和成像直径决定。我们使用的光纤束纤芯间距约为 4 μm，成像直径分别为 330 μm（视频 1）、720 μm（图 2、图 3a,b）和 1400 μm（图 3c）。较小的光纤束可通过更细规格的针头，且显著比大尺寸光纤更柔韧。我们及其他研究者8在某些情况下观察到光纤束本身会产生自发荧光信号。当使用紫外波长激发荧光探针，或在红光光谱范围内收集发射光时，应关注光纤束自发荧光对整体检测信号的贡献。
尽管迄今为止报道的大多数高分辨率显微内窥镜工作均采用裸光纤束，但在远端尖端键合梯度折射率（GRIN）透镜可提供额外的放大效果。GRIN透镜是一种提高空间分辨率的简单且经济的方法，但其易于产生光学像差且数值孔径（NA）有限的问题已广为人知。如果GRIN透镜的性能无法满足特定应用需求，可采用混合型GRIN/球面透镜物镜9或微型物镜组件10-11。
本文所述的高分辨率显微内窥镜本质上是一种宽场落射荧光显微镜，因此无法实现光学切片（如共聚焦或非线性显微镜中的效果）。根据我们的经验，使用455 nm激发光并以局部涂抹的普鲁黄作为对比剂时，所收集的光信号主要来自相当于数个细胞层深度的组织区域。
本方案旨在使读者能够在实验台上组装高分辨率显微内窥镜，设备占用空间紧凑，仅为10英寸×8英寸。如需要，可将系统置于箱体内，并通过电池组为电子元件（LED和相机）供电（图1d）。许多紧凑型相机可通过主机计算机的IEEE-1394（Firewire）和USB端口供电。

<table><tbody><tr><td>CCD 相机</td><td>Point Grey Research</td><td>GRAS-14S5M</td><td></td></tr><tr><td>LED</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>M455L2</td><td>选择用于与丙啡啶（proflavine）配合使用 &amp;#8211; 其他荧光染料可能需要不同部件</td></tr><tr><td>激发滤光片</td><td>Semrock</td><td>452/45</td><td>选择用于与丙啡啶（proflavine）配合使用 &amp;#8211; 其他荧光染料可能需要不同部件</td></tr><tr><td>发射滤光片</td><td>Semrock</td><td>550/88</td><td>选择用于与丙啡啶（proflavine）配合使用 &amp;#8211; 其他荧光染料可能需要不同部件</td></tr><tr><td>二向色镜</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>485 DCLP</td><td>选择用于与丙啡啶（proflavine）配合使用 &amp;#8211; 其他荧光染料可能需要不同部件</td></tr><tr><td>物镜</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>RMS 10X</td><td></td></tr><tr><td>管镜</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>AC-254-150-A1</td><td>选择适当的焦距以实现 CCD 所需的放大倍率</td></tr><tr><td>聚光镜</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>ACL2520</td><td></td></tr><tr><td>笼式立方体组件</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>C6W, B1C, B3C, B5C, SM1CP2</td><td></td></tr><tr><td>笼杆和连接板</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>ER05 (x4), ER1.5 (x2), ER2 (x2), ER6 (x2), CP02 (x3)</td><td></td></tr><tr><td>折叠反射镜组件</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>KCB1, PF10-03-G01</td><td></td></tr><tr><td>透镜套管</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>SM1L05, SM1L30, SM1V05 (或 SM1Z)</td><td></td></tr><tr><td>转接头 / 耦合器</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>SM1A3, SM1A9, SM1T2 (x2)</td><td></td></tr><tr><td>SMA 接头</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>SM1SMA, 11040A</td><td></td></tr><tr><td>LED 驱动器</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>LEDD1B TPS001</td><td></td></tr><tr><td>光纤束</td><td>住友贝克利特公司（Sumitomo Bakelite Co., Ltd.）</td><td>IGN-08/30</td><td>可提供更大或更小的光纤束（住友 / 藤仓）</td></tr></tbody></table>

高分辨率光纤微内窥镜技术用于 原位 细胞成像

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

许多生物学和临床研究需要在细胞水平分辨率下对形态和功能进行纵向观察与分析。传统上，这些研究通过平行开展多个实验实现，即在不同时间点依次取出单独的样本，利用光学显微镜进行评估。目前已开发出多种活体成像技术，其中共聚焦显微镜、多光子显微镜和二次谐波显微镜均已证明可用于此类成像研究。 原位 1然而，这些系统所需的基础设施复杂且昂贵，涉及扫描激光系统和复杂的光源。本文介绍一种高分辨率显微内窥镜的设计与组装方案，该设备可在一天内使用市售组件以低于5,000美元的成本完成构建。该平台在图像分辨率、视场范围和工作波长方面具有灵活性，我们描述了如何轻松调整这些参数以满足终端用户的特定需求。
我们及其他研究者已探索了高分辨率显微内镜（HRME）在 体外 细胞培养 2-5，离体 6 活体动物组织 2,5，以及在人体组织中 体内 2,7用户已报告使用多种不同的荧光对比剂，包括原黄素 2-4，苯并卟啉衍生物单酸环A（BPD-MA） 5和荧光素 6,7，所有这些设备均已获得美国食品药品监督管理局（FDA）的完全批准或临床试验性批准，可用于人体研究。此处所述的高分辨率显微内镜技术可能吸引广泛从事基础科学与临床科学研究的研究人员。该技术提供了一种高效且经济的方法，可作为传统台式显微镜的有效补充，使用户能够进行高分辨率的纵向成像 原位.

在许多生物学和临床情境中，研究细胞过程在其天然微环境中的动态演变具有显著优势。本文介绍了低成本光纤显微镜的组装及其应用，该显微镜可实现实时成像，适用于细胞培养、动物实验以及临床患者研究。

许多生物学和临床研究需要以细胞水平分辨率对形态和功能进行纵向观察与分析。

传统上，需要在细胞水平分辨率下进行显微分析的生物学和临床研究通常通过并行开展多个实验来完成，即在不同时间点依次取出单个样本，利用光学显微镜进行评估；而共聚焦显微镜、多光子显微镜和二次谐波显微镜均为适用于原位成像的有效技术。这些技术所需的基础设施复杂且昂贵，涉及扫描激光系统和复杂的光源。本文中，我们将展示如何仅使用市售组件，在一天内以不到5,000美元的费用构建一套高分辨率光纤微内窥镜系统。该平台在图像分辨率、视场范围和工作波长方面具有灵活性。首先，组装一个简单的落射荧光显微镜框架，以容纳光源、光学滤光片、透镜、光纤束和CCD相机。接着，安装成像透镜，将光纤束的放大图像投射到CCD相机上。随后安装带有照明光学元件的LED光源，以向样品提供荧光激发光。最后，利用组装好的微型内窥镜，实时成像可揭示荧光标记样品的细胞级细节，包括体外培养物、活体动物模型以及人体样本。与共聚焦或双光子显微镜等现有方法相比，该技术的主要优势在于其结构足够简单且成本低廉，使得在不同领域工作的研究人员能够快速实施并根据其特定需求进行定制。此处所述的高分辨率微型内窥镜应视为一种基础配置，其组装和应用均可存在多种变体。在为特定应用选择组件时，需考虑荧光显微镜中荧光染料浓度、光漂白照射、光强、相机灵敏度、增益和曝光时间之间的内在关系。该平台设计用于以丙酮酸黄（pro flavin）作为荧光对比剂，但也可配置为适用于其他荧光染料。原黄素是一种明亮的细胞核染料，其最大吸收波长和发射波长分别为445纳米和515纳米。若使用其他对比剂，用户需适当选择激发、发射和二向色滤光片，以组装显微内窥镜系统。首先，将两根6英寸的笼杆连接到两根1.5英寸的笼杆上，形成一对7.5英寸长的杆件。将杆件拧入折叠反射镜单元的一个侧面，然后安装一个直径为1英寸的反射镜。接下来，将四根 0.5 英寸的杆拧入折叠镜组件的对侧表面。通过笼式立方体下方的两个通孔，将其滑入 7.5 英寸的笼杆上。将两英寸的杆拧入笼式立方体的侧面。使用 C 接口转 SM1 适配器，将相机连接至笼式安装板。将笼式安装板固定在 0.5 英寸笼杆上，使其与折叠反射镜单元的端面齐平。选择一个直径为 1 英寸的管镜，以便在相机上形成光纤束的图像。应选择镜头的焦距，使得光纤束端面被至少两个像素采样。将镜头成像至相机时，将镜头插入一段长度为三英寸的镜头筒中，并用卡环固定镜头。使用开口扳手有助于将卡环旋入较长的镜头筒中。将发射滤光片放入三英寸透镜筒内，置于第一个固定环上方，并添加另一个固定环以固定滤光片位置。确保滤光片的朝向符合滤光片制造商所标明的惯例。将透镜筒旋入笼式立方体靠近CCD相机一侧的接口中。此位置在此处也已标示。请注意，在示意图中，该透镜和滤光片未显示三英寸透镜管。为便于观察，将相机连接至计算机并在屏幕上查看图像。将笼式组件对准远处物体，并沿导轨滑动笼式立方体，直至该物体的图像清晰聚焦。使用螺丝刀拧紧位于笼式立方体侧面的四个螺丝，这些螺丝在拧紧时会夹紧导轨，从而将立方体固定在当前位置。这将确保管镜与无限远校正物镜结合时，能在相机上形成光纤束的聚焦图像。接下来，将二向色镜插入镜架中，并以45度角放置于笼式立方体中。通过RMS转SM1螺纹适配器和可调透镜套管，将物镜拧入笼式立方体与管镜镜架相对的端面。然后，将 SMA 连接器拧入一个笼式安装板，并将其固定在杆上，位置大约位于物镜的工作距离处。将底板和端盖安装到笼式立方体的开口侧。接着，将 LED 安装在一块笼式安装板上，并将其滑动至两英寸长杆的末端。将一个透镜安装到直径为0.5英寸的透镜筒中，使得当该透镜筒旋入笼式立方体侧面时，能够形成LED的像，并充满物镜的后孔径。同时，将激发滤光片安装到该透镜筒中。在此阶段，可使用LED驱动器通过环氧树脂来控制照明光的强度。将用于1030微米光纤的SMA连接器连接至720微米视场的光纤束。有关光纤连接的具体操作，请参考T Thor Labs公司产品编号为FN nine six的《光纤连接与抛光指南》。将SMA连接器端面束旋入安装在笼式支架上的SMA插座中，并将束的远端朝向宽带光源，荧光照明即可满足要求。然后在CCD相机上观察束近端面的图像。最后，通过将物镜旋入或旋出笼式立方体来调整其位置。直到光纤束图像清晰对焦，单个结构应清晰可见。通过在光纤束远端末端连接一个微透镜或透镜组件，可提高微型内窥镜的空间分辨率。这些光学元件的配置方式使得光纤束末端不直接接触组织，而是以缩小的倍率将末端成像到组织表面。从而提高由光纤束导光效应所决定的空间采样频率。去放大倍数的程度对应于空间分辨率的提升，同时相应地减小视场。根据您的应用需求，选择具有合适放大倍数和工作距离的梯度折射率透镜。确保透镜的直径与您计划使用的光纤束直径相匹配。将光纤束和梯度折射率透镜分别安装在低倍显微镜或体视显微镜下的三轴手动定位平台上，以实现精确对准。接下来，在透镜或光纤束端面滴加一滴光学胶。使用手动调节装置，使两个部件相互接触。根据胶粘剂制造商推荐的剂量，用紫外光照射界面以固化胶粘剂。为了保护梯度折射率透镜及其粘接界面，使用一段短铝质毛细管套住连接处。将毛细管推至连接处，并在毛细管两端各滴一滴环氧树脂固定，再使用热缩管完成组件封装。在进行微型内窥成像之前，需将对比剂施加于待成像的细胞或组织，以实现对细胞和培养物的成像。首先，用移液器吸出培养基。然后轻轻将原黄素溶液加入孔中。短暂孵育最多一分钟后，用移液器吸出原黄素溶液并弃去。通过向孔中加入并移除新鲜的 PBS 溶液来冲洗细胞。将光纤束的远端固定在带有 X、Y、Z 轴手动定位装置的稳固夹具中以保持稳定。在向细胞或组织施加染料后进行成像时，将光纤束轻轻接触样品。在计算机屏幕上观察光纤束的图像，可使用相机制造商提供的软件，或任何您希望开发的自定义软件。调整相机的曝光时间和增益设置，以获得亮度合适的图像。当正确组装后，微型内窥镜将通过相干光纤束传递，作为倒置荧光显微镜运行。为了获得最佳成像效果，需注意确保满足以下三个关键条件。首先，应将光纤束的近端面无离焦地成像到CCD相机上，以实现系统的最高分辨率。此处展示了光纤束的一部分在焦距不佳、略微聚焦和良好聚焦条件下的成像效果。通过调节物镜相对于光纤束端面的实际位置，可找到最佳焦距。其次，光纤束的近端面应在整个直径范围内被均匀照射。如前所述，这可通过将照明光学系统配置为科勒照明来实现。此处显示的图像是在采用这种优选配置照射均匀荧光样品时获取的。临界照明条件下的相应结果如图所示。LED 的结构被成像到光纤束端面，导致这种不希望出现的图案叠加在真实样品结构上。第三，必须确保光纤束的近端和远端端面清洁，无划痕和破损。在此示例中，成像束端面上附着有碎屑，并且在光纤周缘五点钟位置可见小碎片形式的损伤。可通过与清洁传统光纤连接器相同的方式，使用镜头纸和异丙醇或标准光纤清洁工具清洁束端面以去除碎屑。1483 个细胞用原黄素标记，并将裸露的光纤束轻轻放置在样品上。当将一个2.5倍的梯度折射率透镜连接到光纤束末端时，实现了空间分辨率的提高和视场范围的减小，如本图所示。在体内成像中，使用外径为0.5毫米的光纤束，通过21号针头插入小鼠乳腺脂肪垫组织，如本视频所示，可清晰观察到由于心动周期引起的运动的脂肪细胞。在本示例中，使用外径为1.5毫米的较大光纤束对一名健康人类志愿者的口腔黏膜进行了成像。在所有示例中，均使用了黄素原（pro flavin）作为细胞核标记的荧光对比剂。观看本视频后，您应能够充分理解如何设计和组装用于活体细胞与组织荧光成像的光纤显微内窥镜。

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