Name: 突触改变老化过程中淀粉样蛋白病理研究从大鼠和转基因小鼠海马急性片的制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-23T14:15:00.000+00:00
Duration: 14 min 57 s
Description: 学习从大鼠和转基因小鼠制备海马急性切片的方法，用于研究衰老和淀粉样蛋白病理相关的突触功能改变。该方案通过优化解剖技术减少组织损伤，为神经退行性疾病研究提供可靠的电生理学评估手段。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目AG027297、肯塔基脊髓与头部损伤研究信托基金的资助、以及克莱伯格基金会的捐赠支持。

<ol><li>Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+the+balance+of+protein+kinase%2Fphosphatase+activities+parallel+reduced+synaptic+strength+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Alterations in the balance of protein kinase/phosphatase activities parallel reduced synaptic strength during aging.</a> J Neurophysiol. 80, 1567-1570 (1998).</li>
<li>Norris, C. M., Korol, D. L., Foster, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+susceptibility+to+induction+of+long-term+depression+and+long-term+potentiation+reversal+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Increased susceptibility to induction of long-term depression and long-term potentiation reversal during aging.</a> J Neurosci. 16, 5382-5392 (1996).</li>
<li>Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+%27zipper%27+slice+studies+reveal+a+necessary+role+for+calcineurin+in+the+increased+activity+of+L-type+Ca%282%2B%29+channels+with+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Hippocampal 'zipper' slice studies reveal a necessary role for calcineurin in the increased activity of L-type Ca(2+) channels with aging.</a> Neurobiol Aging. 31, 328-338 (2010).</li>
<li>Burke, S. N., Barnes, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+synapses+and+hippocampal+circuit+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Senescent synapses and hippocampal circuit dynamics.</a> Trends Neurosci. 33, 153-161 (2010).</li>
<li>Foster, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+homeostasis+and+modulation+of+synaptic+plasticity+in+the+aged+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium homeostasis and modulation of synaptic plasticity in the aged brain.</a> Aging Cell. 6, 319-325 (2007).</li>
<li>Foster, T. C., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+changes+in+Ca%282%2B%29-dependent+processes%3A+relation+to+hippocampal+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Age-associated changes in Ca(2+)-dependent processes: relation to hippocampal synaptic plasticity.</a> Hippocampus. 7, 602-612 (1997).</li>
<li>Thibault, O., Gant, J. C., Landfield, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+the+calcium+hypothesis+of+brain+aging+and+Alzheimer%27s+disease%3A+minding+the+store%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Expansion of the calcium hypothesis of brain aging and Alzheimer's disease: minding the store.</a> Aging Cell. 6, 307-317 (2007).</li>
<li>Demuro, A., Parker, I., Stutzmann, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+and+amyloid+toxicity+in+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling and amyloid toxicity in Alzheimer disease.</a> J Biol Chem. 285, 12463-12468 (2010).</li>
<li>Green, K. N., LaFerla, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+calcium+to+Abeta+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Linking calcium to Abeta and Alzheimer's disease.</a> Neuron. 59, 190-194 (2008).</li>
<li>Kumar, A., Thinschmidt, J. S., Foster, T. C., King, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+effects+on+the+limits+and+stability+of+long-term+synaptic+potentiation+and+depression+in+rat+hippocampal+area+CA1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Aging effects on the limits and stability of long-term synaptic potentiation and depression in rat hippocampal area CA1.</a> J Neurophysiol. 98, 594-601 (2007).</li>
<li>Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+age-related+alterations+in+synaptic+plasticity+by+blockade+of+L-type+Ca2%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reversal of age-related alterations in synaptic plasticity by blockade of L-type Ca2+ channels.</a> J Neurosci. 18, 3171-3179 (1998).</li>
<li>Norris, C. M., Scheff, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+afferent+function+and+synaptic+strength+in+hippocampal+CA1+following+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Recovery of afferent function and synaptic strength in hippocampal CA1 following traumatic brain injury.</a> J Neurotrauma. 26, 2269-2278 (2009).</li>
<li>Sama, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1beta-dependent+signaling+between+astrocytes+and+neurons+depends+critically+on+astrocytic+calcineurin%2FNFAT+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1beta-dependent signaling between astrocytes and neurons depends critically on astrocytic calcineurin/NFAT activity.</a> J Biol Chem. 283, 21953-21964 (2008).</li>
<li>Ye, H., Jalini, S., Mylvaganam, S., Carlen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+large-conductance+Ca%282%2B%29-activated+K%28%2B%29+channels+depresses+basal+synaptic+transmission+in+the+hippocampal+CA1+area+in+APP+%28swe%2Find%29+TgCRND8+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Activation of large-conductance Ca(2+)-activated K(+) channels depresses basal synaptic transmission in the hippocampal CA1 area in APP (swe/ind) TgCRND8 mice.</a> Neurobiol Aging. 31, 591-604 (2010).</li>
<li>Bear, M. F., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity%3A+LTP+and+LTD%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity: LTP and LTD.</a> Curr Opin Neurobiol. 4, 389-399 (1994).</li>
<li>Foster, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+hippocampal+synaptic+plasticity+in+age-related+memory+decline%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Involvement of hippocampal synaptic plasticity in age-related memory decline.</a> Brain Res Brain Res Rev. 30, 236-249 (1999).</li>
<li>Foster, T. C., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+to+induction+of+long-term+depression+is+associated+with+impaired+memory+in+aged+Fischer+344+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Susceptibility to induction of long-term depression is associated with impaired memory in aged Fischer 344 rats.</a> Neurobiol Learn Mem. 87, 522-535 (2007).</li>
<li>Hsu, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+the+balance+of+protein+kinase+and+phosphatase+activities+and+age-related+impairments+of+synaptic+transmission+and+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Alterations in the balance of protein kinase and phosphatase activities and age-related impairments of synaptic transmission and long-term potentiation.</a> Hippocampus. 12, 787-802 (2002).</li>
<li>Vouimba, R. M., Foy, M. R., Foy, J. G., Thompson, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((17beta-estradiol+suppresses+expression+of+long-term+depression+in+aged+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">17beta-estradiol suppresses expression of long-term depression in aged rats.</a> Brain Res Bull. 53, 783-787 (2000).</li>
<li>Abdul, H. M., Furman, J. L., Sama, M. A., Mathis, D. M., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NFATs+and+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">NFATs and Alzheimer's Disease.</a> Mol Cell Pharmacol. 2, 7-14 (2010).</li>
<li>Abdul, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cognitive+decline+in+Alzheimer%27s+disease+is+associated+with+selective+changes+in+calcineurin%2FNFAT+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cognitive decline in Alzheimer's disease is associated with selective changes in calcineurin/NFAT signaling.</a> J Neurosci. 29, 12957-12969 (2009).</li>
<li>Anantharaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-amyloid+mediated+nitration+of+manganese+superoxide+dismutase%3A+implication+for+oxidative+stress+in+a+APPNLH%2FNLH+X+PS-1P264L%2FP264L+double+knock-in+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Beta-amyloid mediated nitration of manganese superoxide dismutase: implication for oxidative stress in a APPNLH/NLH X PS-1P264L/P264L double knock-in mouse model of Alzheimer's disease.</a> Am J Pathol. 168, 1608-1618 (2006).</li>
<li>Gengler, S., Hamilton, A., Holscher, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+in+the+hippocampus+of+a+APP%2FPS1+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease+is+impaired+in+old+but+not+young+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity in the hippocampus of a APP/PS1 mouse model of Alzheimer's disease is impaired in old but not young mice.</a> PLoS One. 5, e9764-e9764 (2010).</li>
<li>Stringer, J. L., Lothman, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+effects+of+extracellular+calcium+concentrations+on+hippocampal+pyramidal+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">In vitro effects of extracellular calcium concentrations on hippocampal pyramidal cell responses.</a> Exp Neurol. 101, 132-146 (1988).</li>
<li>Landfield, P. W., Pitler, T. A., Applegate, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+high+Mg2%2B-to-Ca2%2B+ratios+on+frequency+potentiation+in+hippocampal+slices+of+young+and+aged+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">The effects of high Mg2+-to-Ca2+ ratios on frequency potentiation in hippocampal slices of young and aged rats.</a> J Neurophysiol. 56, 797-811 (1986).</li>
<li>Ames, A. 3rd, Sakanoue, M., Endo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NA%2C+K%2C+CA%2C+MG%2C+AND+C1+CONCENTRATIONS+IN+CHOROID+PLEXUS+FLUID+AND+CISTERNAL+FLUID+COMPARED+WITH+PLASMA+ULTRAFILTRATE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">NA, K, CA, MG, AND C1 CONCENTRATIONS IN CHOROID PLEXUS FLUID AND CISTERNAL FLUID COMPARED WITH PLASMA ULTRAFILTRATE.</a> J Neurophysiol. 27, 672-681 (1964).</li>
<li>Gant, J. C., Sama, M. M., Landfield, P. W., Thibault, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+and+simultaneous+emergence+of+multiple+hippocampal+biomarkers+of+aging+is+mediated+by+Ca2%2B-induced+Ca2%2B+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Early and simultaneous emergence of multiple hippocampal biomarkers of aging is mediated by Ca2+-induced Ca2+ release.</a> J Neurosci. 26, 3482-3490 (2006).</li>
<li>Thibault, O., Hadley, R., Landfield, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+postsynaptic+%5BCa2%2B%5Di+and+L-type+calcium+channel+activity+in+aged+hippocampal+neurons%3A+relationship+to+impaired+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Elevated postsynaptic [Ca2+]i and L-type calcium channel activity in aged hippocampal neurons: relationship to impaired synaptic plasticity.</a> J Neurosci. 21, 9744-9756 (2001).</li>
<li>Thibault, O., Landfield, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+single+L-type+calcium+channels+in+hippocampal+neurons+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Increase in single L-type calcium channels in hippocampal neurons during aging.</a> Science. 272, 1017-1020 (1996).</li>
<li>Stutzmann, G. E., Caccamo, A., LaFerla, F. M., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulated+IP3+signaling+in+cortical+neurons+of+knock-in+mice+expressing+an+Alzheimer%27s-linked+mutation+in+presenilin1+results+in+exaggerated+Ca2%2B+signals+and+altered+membrane+excitability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dysregulated IP3 signaling in cortical neurons of knock-in mice expressing an Alzheimer's-linked mutation in presenilin1 results in exaggerated Ca2+ signals and altered membrane excitability.</a> J Neurosci. 24, 508-513 (2004).</li>
<li>Stutzmann, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+ryanodine+receptor+recruitment+contributes+to+Ca2%2B+disruptions+in+young%2C+adult%2C+and+aged+Alzheimer%27s+disease+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Enhanced ryanodine receptor recruitment contributes to Ca2+ disruptions in young, adult, and aged Alzheimer's disease mice.</a> J Neurosci. 26, 5180-5189 (2006).</li>
<li>Lee, H. K., Min, S. S., Gallagher, M., Kirkwood, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor-independent+long-term+depression+correlates+with+successful+aging+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor-independent long-term depression correlates with successful aging in rats.</a> Nat Neurosci. 8, 1657-1659 (2005).</li>
<li>McNaughton, B. L., Douglas, R. M., Goddard, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+enhancement+in+fascia+dentata%3A+cooperativity+among+coactive+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Synaptic enhancement in fascia dentata: cooperativity among coactive afferents.</a> Brain Res. 157, 277-293 (1978).</li>
</ol>

本视频文章的制作由徕卡显微系统公司赞助。

本方案中概述的步骤将有助于确保在老年大鼠中进行脑组织解剖的速度和效率至少与年轻成年大鼠相当。我们还提供了足够的细节，以便初学者能够自行建立长时程增强（LTP）和长时程抑制（LTD）的脑片研究。如果您的研究目标之一是进一步探索衰老和阿尔茨海默病（AD）对突触功能和可塑性的改变，那么上文提及的至少还有两个方法学问题值得进一步考虑。首先，已有多个实验室表明，Ca2+记录用人工脑脊液（ACSF）中的 Mg²⁺ 比例可显著影响海马脑片中突触可塑性的诱导2,10,24,25在哺乳动物脑脊液中，Ca2+Mg2+ 比值约为1（例如参见 26）。然而，ACSF Ca2+：在突触功能和可塑性的脑片研究中，通常使用接近2的Mg2+浓度比例。早期研究中，这种做法可能是为了优化长时程增强（LTP）的诱导，随后便成为所有可塑性研究中的常规操作。然而，在衰老和阿尔茨海默病（AD）研究中，这种做法可能存在问题，原因是已明确报道的神经元Ca2+ 调控。具体而言，Ca2+ 内流和/或 Ca2+诱导的 Ca2+-在神经元激活期间，衰老大鼠和/或阿尔茨海默病模型小鼠的释放升高3,27-31LTD的诱导对ACSF中Ca浓度的微小变化特别敏感2+ 水平。我们的方案使用 2 mM Ca2+ 且含有2 mM Mg2+的条件通常会导致老年动物出现LTD，而年轻成年动物则不会2，而使用 Ca 的研究2+：Mg2+ 比值接近2时，在无年龄差异的情况下，已在成年个体中观察到显著的长时程抑制（LTD）2,10 或与老年大鼠LTD减弱同时发生32这些观察结果强调了在考虑ACSF Ca时需格外谨慎2+ 以及在比较 Ca 时的 Mg2+ 水平2+依赖性可塑性在老年与年轻成年动物中的表现。
第二个方法学问题涉及长时程增强（LTP）对突触后去极化的高度依赖性33，以及突触强度在衰老或不同基因型之间可能存在的差异。在典型的LTP实验中，通常将基础状态和LTP诱导的刺激强度调整至产生半最大（或四分之三最大）兴奋性突触后电位（EPSP）幅度。潜在的问题在于，老年大鼠和APP/PS1小鼠通常与其年轻个体和/或野生型对照相比表现出突触强度降低，这意味着老年大鼠和APP/PS1小鼠的基础EPSP值也较小。较小的EPSP可能导致LTP刺激期间去极化程度降低，从而减少诱导LTP的概率33。由于这一潜在的混杂因素，难以确定这些动物存在的是信号传递能力缺陷、可塑性缺陷，还是两者兼有。也就是说，在老年动物和/或APP/PS1小鼠中，LTP的诱导机制本身可能是功能完整的（无可塑性缺陷），但在这些条件下受到的刺激不足（传递能力缺陷）。这一区分至关重要，因为信号传递机制与可塑性机制对特定药理学处理的反应可能截然不同。为尽量减少传递能力下降对LTP诱导的影响，我们在进行LTP刺激前，将所有脑片的EPSP幅度标准化至相同水平（例如1 mV）。其他策略也可能有效（例如在LTP刺激期间使用电压钳或电流钳技术使各组间的膜电位保持一致），在研究这些动物模型的LTP时应予以考虑。

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;（单碱基）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379-100G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643-500G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;（二水合物）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;12&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;（葡萄糖）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP350-1</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">表1. 所需试剂</td></tr><tr><td>锥形瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-500-2000 FB-500-1000</td><td></td></tr><tr><td>水族箱气泡发生器</td><td></td><td></td><td>用于培养基的氧合。大多数宠物商店均有售</td></tr><tr><td>50 mL 玻璃烧杯</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-540G</td><td>用于在ACSF中保存脑组织</td></tr><tr><td>Parafilm封口膜</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>小型动物断头器</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>DCAP-M</td><td></td></tr><tr><td>平铺纸巾</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#11 Feather手术刀片</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-916-5B</td><td></td></tr><tr><td>Beebee骨剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>16044-10</td><td></td></tr><tr><td>Lempert咬骨钳</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-8321</td><td>适用于大鼠</td></tr><tr><td>Friedman-Pearson咬骨钳</td><td>Fine Science Tools</td><td>16020-14</td><td>适用于小鼠或大鼠</td></tr><tr><td>海马体取材工具</td><td>Fine Science Tools</td><td>10099-15</td><td></td></tr><tr><td>勺子</td><td></td><td></td><td>塑料茶匙即可</td></tr><tr><td>刮刀</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-25A</td><td>刮刀</td></tr><tr><td>手术虹膜剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td></td></tr><tr><td>塑料移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-43</td><td></td></tr><tr><td>110 mm Whatman滤纸</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-805E</td><td>Whatman货号 1001-110</td></tr><tr><td>玻璃培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.leica-microsystems.com/products/total-histology/sectioning/vibrating-blade-microtomes/">Leica VT1000P 手动振动切片机&lt;/a&gt;</td><td>振动切片机</td><td>VT1000P</td><td></td></tr><tr><td>0.1 mm FA-10 Feather S刀片</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>121-9</td><td>0.1 mm FA-10 Feather S刀片</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃巴斯德移液管（带橡胶吸头）</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td>用于转移脑片：尖端折断并经热抛光以形成较大开口</td></tr><tr><td>35 mm 聚苯乙烯培养皿</td><td>Corning</td><td>430588</td><td>用于解剖后收集脑片</td></tr><tr><td colspan="4">表2. 解剖所需工具和材料</td></tr><tr><td>孵育室</td><td>定制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-97 水平移液管拉制仪</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>防振台</td><td>Technical Manufacturing Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>法拉第笼</td><td>定制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>带底部侧臂的Pyrex抽滤瓶</td><td>Corning</td><td>1220-1L</td><td></td></tr><tr><td>带调节器的重力控制式静脉输液装置</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>2C8891</td><td></td></tr><tr><td>中央真空管线</td><td></td><td></td><td>大多数现代实验室均配备</td></tr><tr><td>95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; / 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 气体混合物</td><td>Scott-Gross Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TygonTM 实验室管路（用于O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;输送）</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>无毒、不氧化，有多种规格可选</td></tr><tr><td>Eclipse E600FN 显微镜</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>配备10倍和40倍物镜、近红外滤光片以及GFP、DS-Red2滤光片</td></tr><tr><td>Cool Snap ES 数字相机</td><td>Photometrics</td><td></td><td>Cool Snap ES 数字相机</td></tr><tr><td>X-Cite 荧光照明系统</td><td>EXFO</td><td></td><td>X-Cite 荧光照明系统</td></tr><tr><td>显微镜平台</td><td>Siskiyou, Inc.</td><td></td><td>定制组装</td></tr><tr><td>RC-22 浸入式记录室</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0228</td><td>需搭配P-1平台和载物台适配器（Warner产品编号64-0277）</td></tr><tr><td>TC2BIP 2/3通道温度控制器</td><td>Cell Microcontrols</td><td></td><td></td></tr><tr><td>四轴手动微型操纵器</td><td>Siskiyou, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>铂铱合金丝（0.002英寸）</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>PTT0203</td><td></td></tr><tr><td>A365 刺激隔离器</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>A365 Stimulus Isolator</td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp 700b 放大器</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1322A 模数转换器</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PClamp软件</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>个人计算机（Pentium 4）</td><td>Dell</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">表3. 电生理实验设备和材料</td></tr></tbody></table>

用于研究衰老和淀粉样蛋白病变期间突触改变的大鼠和转基因小鼠急性海马脑片制备

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

啮齿类动物海马脑片制备可能是研究哺乳动物突触功能和可塑性应用最广泛的工具。海马可从大鼠和小鼠中快速、简便地分离出来，脑片在充氧的人工脑脊液中可维持数小时的活性。此外，基本的电生理技术可轻松应用于海马脑片突触功能的研究，并已提供了一些认知功能障碍的最佳生物标志物。海马脑片尤其适用于研究与学习和记忆相关的突触可塑性机制。海马脑片中突触效能的长时程增强和长时程抑制（LTP 和 LTD）的诱导变化（或缺乏变化）常被用于描述认知障碍动物的神经表型，和/或评估促智化合物的作用机制。本文概述了我们用于制备大鼠和转基因小鼠海马脑片的步骤，以研究与脑衰老和阿尔茨海默病（AD）相关的突触改变1-3。对于习惯使用年轻大鼠和/或小鼠的研究人员而言，使用老龄大鼠和 AD 模型小鼠可能带来一系列独特的挑战。老龄大鼠的颅骨更厚，结缔组织更坚韧，相比年轻大鼠和小鼠，这可能延缓脑组织的取出和/或解剖过程，从而掩盖或夸大突触功能和可塑性的真实年龄差异。衰老和淀粉样蛋白病理也可能加剧解剖过程中对海马造成的损伤，进而使生理评估所得结论的解释更加复杂。本文讨论了在解剖过程中为尽量减少这些问题所采取的步骤。同时提供了来自大鼠和小鼠“健康”与“不健康”脑片的突触反应示例，以及典型的突触可塑性实验。还讨论了其他方法学因素（如记录液成分、刺激参数）对这些动物模型突触功能的可能影响。尽管本文重点在于老龄大鼠和转基因小鼠的应用，但脑片生理学的新手也能从中获得足够的细节，以利用多种啮齿类动物模型开展自己的研究。

本文概述了制备大鼠和转基因小鼠海马脑片的实验步骤，用于研究与脑衰老及年龄相关性神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）相关的突触改变。

啮齿类动物海马脑片制备可能是研究哺乳动物突触功能与可塑性应用最广泛的工具。

啮齿类动物海马脑片常用于研究哺乳动物突触功能与可塑性。本文介绍了一种从老龄大鼠和小鼠获取和研究脑片的方案，这些动物的颅骨较厚，结缔组织较坚韧，与年轻动物相比更难处理。这些特点可能导致脑组织提取或解剖过程延迟，从而掩盖或夸大突触功能与可塑性方面真实存在的年龄差异。此外，衰老和淀粉样病变可能会加剧在解剖过程中对海马体造成的损伤，从而进一步增加从生理学评估中得出推论的复杂性。在本演示中，我们将讨论在提取和解剖过程中所采取的步骤，以尽量减少这些问题。首先，迅速取出脑组织并置于冰上，使用低温、低钙的人工脑脊液。随后在冰冷的解剖台上轻柔地取出海马体，并使用振动切片机制备海马脑片，置于含钙且充氧的人工脑脊液（ACSF）中孵育。最后，在海马体的多个亚区诱发突触电位和电流并进行记录，所得结果揭示了衰老和/或类似阿尔茨海默病的病理对突触功能和可塑性的影响。正确应用该技术对于研究阿尔茨海默病相关的年龄相关性认知衰退和痴呆具有重要意义。这是因为突触功能障碍是这些临床症状最早期的生物标志物之一，本实验流程可对此进行演示。今天由实验室的首席研究员克里斯·诺里斯博士（Dr. Chris Norris）进行操作。实验准备区域应靠近一个大型水槽。准备好用于脑组织取出和海马体分离的解剖区域。准备一张折叠的纸巾、11号手术刀片、BB剪刀、骨钳和海马体工具（一种来自精细外科工具的专用双头解剖刀）。同时放置小型手术剪、薄塑料解剖刀、移液器、沃特曼滤纸、一个盛有冰块的100毫米玻璃培养皿、一把塑料勺以及一杯部分解冻的无钙溶液。该脑脊液（CSF）表面覆盖有帕拉膜（parafilm）。大鼠断头后，应尽快取出脑组织。将头部置于纸巾上，用手术刀迅速从鼻骨至枕骨沿头皮中线做一切口。务必完全切断皮肌，充分暴露颅骨缝。牢固固定头部，并沿中线颅缝切开枕骨、顶骨和额骨骨板。注意保持下部剪刀紧贴颅骨内表面，远离脑组织。这一步骤对于防止意外刮伤至关重要。下一张幻灯片。将罗恩持针器置于左侧顶骨板下方，合拢钳口，同时向上前方滚动，以牵拉顶骨和枕骨骨板分离。如有必要，使用罗恩持针器将左侧额骨板一并移除。另一侧半球重复上述操作。待骨板移开后，使用罗恩持针器或剪刀轻轻牵拉或剪除可能附着在颞骨板上并延展于脑表面的任何硬脑膜组织。现在将Ron咬骨钳插入脑组织与右侧颞骨板之间，施加朝向颅骨且远离脑组织的压力。挤压并扭转颞骨板直至听到或感觉到咔嚓声。左侧同样重复此操作。将宽铲子置于海马体工具前方，在脑腹面与颅底骨板之间滑动，直至完全位于脑下方。使用海马体工具，将铲子左右及前后移动数次，以切断仍保持完整的脑神经。舀出脑组织，浸入无钙人工脑脊液（A CSF）中，用Parfum覆盖，并静置冷却约一分钟。为提取海马体，使用勺子将脑组织从脑脊液（CSF）中取出，放置于冰冻培养皿盖内已用脑脊液润湿的沃特曼滤纸上。使用手术刀片切除小脑以及约四分之一的前额叶前端部分。随后沿大脑半球间裂切开，完全分离两个大脑半球。将一个半球放回A型脑脊液冰沙中，另一个则直立放置在解剖台上，使额叶的冠状面朝下。白色的脑干和中脑应能轻易与粉红色或灰白色的覆盖皮层区分开来。找到中脑上的四叠体。它们看起来像两个白色的突起，位于大脑的顶部。在此位置，用剪刀轻轻固定中脑，将解剖刀片插入四叠体与皮层之间。然后轻柔地将脑干、中脑和丘脑拉离。如有必要，可用剪刀剪断结缔组织或血管组织。使用解剖刀的锋利边缘切断穹窿，即位于海马前背侧区域的白色纤维束。用剪刀轻轻牵拉脑干、中脑和丘脑，使其与脑的其余部分分离，但不要完全切断。此时在此方向下，应可见海马底部由纤维构成的呈浅层双曲线形状的白色纤维束。使用移液管，轻轻将一些 aCSF 注入 FIA 下方的间隙中，以帮助分离海马与皮层。将解剖刀轻轻插入该间隙，同时用镊子牢固夹住脑干、中脑和丘脑，轻轻滚动海马，分离其组织，并小心修剪掉残留的皮层、血管和白质。用几毫升人工脑脊液冲洗。使用移液管，用人工脑脊液冰沙保持组织湿润和低温。接下来，取出另一侧半球，并重复解剖步骤以切片大鼠海马体。用冰冷的无钙人工脑脊液（A CSF）填充振动切片机的储液槽，确保切片平台和刀片完全浸没。使用解剖刀切除每个海马体的头端和尾端，然后将它们头端朝下放置，使每个海马体的齿状回相对朝向。将脑组织粘附到固定块上，并转移至振动切片机的切片平台。对于突触生理学实验，建议使用 400 微米的切片。使用宽口移液管将切片转移至含有冰冷无钙人工脑脊液的小培养皿中。切片完成后，将切片转移至盛有含钙且充氧的A型人工脑脊液（A CSF）的孵育室中。逐渐将孵育室温度从27摄氏度升至32摄氏度，以进行基础的细胞外记录。在急性切片实验中，记录室置于显微镜载物台上，预加热的A型人工脑脊液通过重力经流量调节器流入记录室，并由中央真空管线排出。使用小型画笔将脑片转移至记录室中，使其浸没于人工脑脊液（A CSF）内，并置于插入的网状支架上。让脑片适应环境 10 到 15 分钟。在脑片适应期间，打开刺激器或刺激隔离器，并将输出调节至零。然后将刺激电极置于切片上靠近CA3边界的CA2区域的辐射层（stratum radiatum）处。将记录电极缓慢下降至CA1区的辐射层，刚好穿透切片表面即可。将刺激器的输出调节至中等强度。刺激隔离器设置为约150微安。以小幅度间隔缓慢降低刺激电极，直至记录到刺激伪迹。在记录CA1反应的同时，继续以小间隔缓慢降低刺激电极和记录电极。使用类似 Clampex（Clamp X）的软件采集程序，建立突触强度曲线，直至记录到的纤维锋电位和兴奋性突触后电位的幅度达到最大水平。然后利用该软件以不同强度的刺激进行刺激，并记录细胞内相应的活动。所使用的刺激强度范围和强度水平的数量应足够充分，以便在将数据相对于纤维锋电位（FV）或兴奋性突触后电位（EPSP）值作图时，能够生成一条S形（Sigmoidal）曲线。接下来研究突触可塑性时，重置每片脑片的刺激强度，使诱发出的反应幅度为一毫伏。以0.033赫兹的频率开始兴奋性突触后电位（EPSP）的基线刺激。在诱导长时程增强（LTP）或长时程抑制（LTD）之前，斜率值应至少稳定20分钟。为记录基线期，使用钳制X参数文件，每30秒进行一次刺激和记录。接下来为诱导LTP，打开一个单独的参数文件，使用持续1秒、频率为100赫兹的刺激串进行LTP诱导；或为诱导LTD，每200毫秒给予一次200赫兹的短暂刺激串。以每秒1次的频率递送900个刺激脉冲。在刺激序列切换回基线参数文件后，继续采集突触反应至少60分钟。比较高频或低频刺激前与刺激后60分钟的EPSP斜率值，以确定是否存在长时程增强（LTP）——表现为突触强度增加，或长时程抑制（LTD）——表现为突触强度降低。这两种过程被广泛认为反映了学习与记忆的关键机制。此处展示了来自两只 A PP PS1 小鼠的两个不同海马脑片的代表性突触强度曲线。其中一只小鼠接受了新型抗炎性腺相关病毒试剂处理，另一只小鼠则接受了对照病毒试剂处理。当在不同处理条件下激活相似数量的突触前纤维时，可以观察到这一现象。当各组的FV波幅（如横轴所示）相近时，经试剂a处理的脑片曲线向左偏移，表明其EPSP波幅更大。这些数据表明，经试剂a处理的脑片其基础突触强度更高。以下是针对相同脑片进行的LTP实验结果。请注意，在给予100赫兹刺激后的一小时基线期内，试剂A处理组脑片的EPSP斜率值明显高于对照组脑片，表明试剂A处理组脑片存在LTP，而对照组脑片则无此现象。该图显示了试剂A组和对照组小鼠脑片在给予100赫兹刺激前以及刺激后60分钟时EPSP波形的表现。在给予100赫兹刺激后的时期，试剂A处理的脑片中EPSP斜率的增加非常明显，提示存在长时程增强（LTP）。迄今为止图中所示的实验结果表明，试剂A可增强突触强度，并改善LTP缺陷。在PP PS一型小鼠中，类似实验在老龄大鼠的海马LACS上进行。此处展示了经新型抗炎药物处理的大鼠和经对照载体试剂处理的另一只大鼠的两个不同海马脑片的突触强度曲线。请注意，这两条曲线非常相似，表明药物A对基础突触强度几乎没有影响。该图显示了在同一脑片上进行的长时程抑制（LTD）实验的结果。需要注意的是，与老年大鼠的典型情况一致，给予载体处理的脑片在1赫兹刺激后一小时的基线期内，EPSP斜率值出现抑制。然而，给予药物A处理的脑片中EPSP斜率值几乎未见抑制，表明缺乏长时程抑制（LTD）。此处展示的是药物A组和载体组大鼠脑片在1赫兹刺激前以及刺激后60分钟时的EPSP波形。在刺激后的1赫兹阶段，载体组脑片的EPSP斜率下降非常明显，而在药物A组脑片中则不明显。这些图中的结果显示，药物A通过阻断长时程抑制（LTD）的诱导，改善了老年大鼠的突触可塑性差异，但并不影响基础突触功能。这些数据表明，老年大鼠和阿尔茨海默病模型小鼠突触功能与可塑性的多个参数均可通过实验性处理进行调节，并凸显了急性海马脑片在研究新型实验药物和试剂的促智或神经保护潜力方面的实用性。在进行该操作时，重要的是要记住，在快速取出脑组织的同时，还需在解剖、切片及处理海马以进行电生理测量的过程中保持操作的精确性与轻柔性。

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突触改变老化过程中淀粉样蛋白病理研究从大鼠和转基因小鼠海马急性片的制备

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制备寡聚态β-淀粉样蛋白1-42并诱导海马脑片突触可塑性损伤

来源：McLeod, F., 等. 海马啮齿类脑切片中突触密度的评估. J. Vis. Exp.

使用免疫荧光法对小鼠海马脑片中突触进行显微分析

本文介绍了一种完整的方法，用于制备和保存 体外...

海马体小鼠脑片的改良制备与保存方法以实现长期增强作用的非常稳定且可重复的记录

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