Name: 重组逆转录病毒的生产和B细胞的感染 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-18T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: 了解重组逆转录病毒生产与原代B淋巴细胞感染技术，用于稳定表达AID基因并分析类别转换重组机制。该方法通过流式细胞术检测表面抗体，为免疫学研究提供高效且经济的基因功能分析平台。

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C.K. 由哥伦比亚大学研究生项目资助。U.B. 是美国白血病与淋巴瘤协会的研究员，获得白血病研究基金会新研究者奖，并由哥伦比亚大学新教职员工启动资金资助。

1. 脾脏B淋巴细胞的分离与刺激
<ol>
	<li>采集 2 至 3 月龄的 AID 缺陷型小鼠的脾脏12。脾脏的分离操作需在无菌条件下进行，器官暂时保存于含 15% 胎牛血清（FBS）的冷磷酸盐缓冲液（PBS）中。</li>
	<li>将脾脏转移至无菌细胞培养操作台，加入 5 mL 含 2.5% FBS 的 PBS 进行匀浆。将匀浆液转移至 15 mL 离心管中。</li>
	<li>在 4°C 条件下，以 1000 rpm 离心 10 分钟，使匀浆后的脾组织样品中的细胞沉淀。</li>
	<li>离心后弃去上清液。将细胞沉淀重悬于 10 mL 红细胞（RBC）裂解缓冲液中，室温孵育 7 分钟，以去除红细胞污染。</li>
	<li>以 1000 rpm 离心 10 分钟，弃去上清液，将细胞重悬于含 2.5% FBS 的 10 mL PBS 中。</li>
	<li>取 100 μL 细胞悬液，用台盼蓝染色后按 1:1000 稀释，使用标准血细胞计数板进行细胞计数，排除死细胞。每只脾脏可获得约 2000 万至 3000 万个细胞。</li>
	<li>以 1000 rpm 离心 10 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于含 2 mM EDTA 的 0.5% BSA/PBS 溶液中，浓度为每 90 μL 含 107 个细胞。</li>
	<li>向细胞中加入包被抗 CD43 抗体的磁珠，以特异性结合非 B 细胞。每 90 μL（107 个细胞）加入 10 μL 磁珠。充分混匀后，4°C 孵育 20 分钟。</li>
	<li>标记完成后，向离心管中加入含 2.5% FBS 的 PBS 洗涤细胞。以 1000 rpm 离心 10 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞重悬于 0.1% BSA/PBS 中，浓度为每毫升含 10×107 个细胞。</li>
	<li>将磁性分选柱安装于磁力分离器上，在柱下方放置一个锥形管以收集流穿液。先加入 3 mL 0.5% BSA/PBS 对分选柱进行预平衡和洗涤。</li>
	<li>待洗涤液完全流穿后，更换新的收集管。若样品体积小于 1 mL，用 0.5% BSA/PBS/EDTA 将体积调整至 1 mL，然后将样品加载至分选柱中。每根分选柱最多加载 1 mL 细胞悬液，必要时可使用多根分选柱。</li>
	<li>让细胞自然流过分选柱，收集柱下锥形管中的未结合细胞。继续收集流穿液，同时用 3 mL 0.5% BSA/PBS 洗涤分选柱 4 次。</li>
	<li>收集全部流穿液，其中富含 CD43 阴性静息 B 细胞。弃去分选柱。将流穿液以 1000 rpm 离心 10 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，加入 10 mL 培养基（含 15% FCS、谷氨酰胺、青霉素/链霉素、非必需氨基酸和 50 μM β-巯基乙醇）。</li>
	<li>计数细胞，并以每毫升 106 个细胞的密度进行培养。</li>
	<li>为刺激 B 细胞生长与增殖，在培养基中添加重组 IL-4 和抗 CD40 抗体，使其终浓度分别为 20 μg/mL 和 1 μg/mL，然后将细胞转移至培养瓶中。</li>
	<li>培养过夜后，计数细胞并稀释至每毫升 106 个细胞，根据需要补充 IL-4 和抗 CD40 抗体。</li>
	<li>在病毒感染前继续培养细胞 72 小时。</li>
</ol>
2. 生产细胞的转染
使用阳离子脂质或磷酸钙转染方法，采用已建立的转染方案。每种DNA构建体转染一个10 cm3 培养皿，每个培养皿使用100 μg质粒DNA。我们常规采用磷酸钙转染法13, 14，并注意到在添加氯喹后病毒滴度较高。
<ol>
	<li>使用60%-70%汇合度的Phoenix细胞作为待转染的生产细胞。此时每10 cm培养皿中的细胞数量应为500万个。</li>
	<li>转染前1小时，用新鲜的完全培养基替换原有培养基，用于Phoenix细胞的生长。</li>
	<li>在无菌离心管中，加入100 μg包装质粒DNA和250 μL 0.5M CaCl2，再用无菌水将终体积调至500 μL。</li>
	<li>使用1 mL移液器，在15 mL聚丙烯管中将上述溶液与500 μL 2X HEPES缓冲液（HNP）剧烈混合。</li>
	<li>将此混合液在室温下静置8-10分钟，期间会形成沉淀。</li>
	<li>将转染混合液逐滴加入细胞中，同时轻轻旋转培养皿使混合液均匀分布。</li>
	<li>将细胞在37°C培养箱中孵育12小时。</li>
	<li>转染后12小时，将培养基更换为8 mL完全B细胞生长培养基，并将细胞放回37°C培养箱中继续培养。</li>
</ol>
3. 刺激后脾脏B细胞的感染
<ol>
	<li>转染后48小时，从Phoenix细胞中移除上清液，并将上清液通过0.2微米滤膜过滤，以去除任何细胞碎片。</li>
	<li>取3 mL含病毒的上清液与3 mL预先活化的B细胞（如步骤1所述）混合。为增强病毒对细胞的吸附，加入聚凝胺（polybrene），使其终浓度为每毫升16 μg。</li>
	<li>在30°C下以2500 rpm离心90分钟，对细胞进行感染。</li>
	<li>离心结束后立即于37°C继续孵育48–72小时，以促进细胞生长与增殖。</li>
</ol>
4. 流式细胞术分析
<ol>
	<li>使用流式细胞仪分析细胞表面 B220 和表面 IgG1 的表达。细胞表面存在 IgG1 表明已发生类别转换重组，这是通过逆转录病毒对 AID 基因进行互补后成功挽救的结果。</li>
</ol>
5. 典型结果
我们通过逆转录病毒转导成功挽救了AID缺陷型（AID-/-）B淋巴细胞中活化诱导胞苷脱氨酶（Activation Induced Cytidine Deaminase, AID）蛋白因子的缺乏。简言之，我们通过将pMX-mAID-GFP质粒转染至Phoenix细胞，从而产生表达小鼠AID（mAID）蛋白的重组逆转录病毒15-18。收集的病毒随后感染来源于AID缺陷小鼠的B细胞，并在体外（ex vivo）条件下进行类别转换重组（CSR）刺激19。感染后的B细胞在培养72小时后，通过流式细胞术分析其向IgG1的类别转换情况。图2显示，表达AID的B细胞表面可检测到IgG1，而携带空载体的对照组则无IgG1表达，表明AID表达的恢复成功促进了类别转换重组的发生。
<img src="/files/ftp_upload/2371/2371fig1.jpg" alt="基因编辑载体示意图，包含LTR、IRES-GFP序列；病毒组装、蛋白表达。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1： 生产细胞中逆转录病毒包装示意图：如前所述，将目的基因（以Ψ表示）亚克隆至pMX-IRES-GFP载体中15。采用磷酸钙法将该质粒转染至可表达gag-pol和包膜蛋白的嗜鼠性病毒包装细胞系（Phoenix, Orbigen）中13, 14。转染后48小时，收集含有病毒颗粒的上清液，用于感染从小鼠获得的原代B细胞。 
<img src="/files/ftp_upload/2371/2371fig2.jpg" alt="流式细胞术点图；AID突变体中IgG1与GFP表达的关系；基因重建实验数据" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2： 用抗CD40和IL-4刺激的AID缺陷型B细胞，感染含有pMX-mAID-GFP的逆转录病毒或仅表达GFP的逆转录病毒。通过FACS分析评估向IgG1的类别转换重组（CSR）水平。

<ol><li>Bartholdy, B., Matthias, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+B+cell+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of B cell development and function.</a> Gene. 327, 1-23 (2004).</li>
<li>Henderson, A., Calame, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+during+B+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation during B cell development.</a> Annu Rev Immunol. 16, 163-200 (1998).</li>
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<li>Delphin, S., Stavnezer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+antibody+class+switching+to+IgE%3A+characterization+of+an+IL-4-responsive+region+in+the+immunoglobulin+heavy-chain+germline+epsilon+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulation of antibody class switching to IgE: characterization of an IL-4-responsive region in the immunoglobulin heavy-chain germline epsilon promoter.</a> Ann N Y Acad Sci. 764, 123-135 (1995).</li>
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</ol>

未声明任何利益冲突。

如图1所示，此处所述的脾脏B细胞逆转录病毒转导是一种在B淋巴细胞研究中具有实用价值的遗传学方法，因为淋巴细胞生成过程中的许多发育事件均由转录调控所控制1, 2。在B细胞成熟的后期阶段，通过CD40L的刺激对于诱导B细胞生长、进入细胞周期以及增殖至关重要11, 20。如图2所示，B细胞可在体外通过抗CD40抗体和IL4刺激而发生显著增殖；逆转录病毒载体是用于过表达可能在B细胞发育这些阶段发挥作用的蛋白的有效工具。在图2所示的示例中，我们证明了无法进行类别转换重组（CSR）（此处为向IgG1转换）的AID缺陷型B细胞，可通过逆转录病毒导入小鼠AID基因而恢复该功能。该方法使我们能够追踪已发生CSR的GFP阳性细胞（见图1）（即IgG1+GFP+细胞）。
与小鼠模型相比，该方法具有优势，因为脾脏收获后不到一周即可完成，而建立转基因小鼠则需要更长时间。分析类型可根据研究者的具体应用进行调整；本文展示了通过流式细胞术分析类别转换重组的方法，如图2...

<table><tbody><tr><td>FCS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>20012</td><td></td></tr><tr><td>红细胞（RBC）裂解缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>CD43 磁珠</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B细胞完全培养基</td><td>多种</td><td>多种组分</td><td>RPMI、15% FCS、1% 非必需氨基酸、1% 丙酮酸钠、1% HEPES、1% 青霉素-链霉素、50&amp;#x03BC;M &amp;#946;-巯基&amp;#8211;乙醇</td></tr><tr><td>IL-4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗-CD40 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>553787</td><td></td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689 &amp;#8232;</td><td></td></tr><tr><td>氯喹二磷酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6628</td><td>使用浓度为 100 mM</td></tr><tr><td>Ph&amp;#8211;nix Eco 细胞（小鼠来源）</td><td>Orbigen</td><td>RVC-10002</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy5-&amp;alpha;-小鼠-CD45R (B220)</td><td>eBioscience</td><td>15-0452-81</td><td></td></tr><tr><td>PE-&amp;alpha;-小鼠-IgG1</td><td>BD Biosciences</td><td>A85-1</td><td></td></tr></tbody></table>

重组逆转录病毒的制备及b细胞感染

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

在真核细胞中进行基因的转基因表达是一种强大的反向遗传学方法，该方法通过异源表达系统调控目的基因的表达，从而便于分析其产生的表型。该方法可用于表达生物体中通常不存在的基因、表达基因产物的突变形式，或过表达基因产物的显性负性形式。该方法在造血系统研究中尤其有用，因为转录调控是B细胞发育与分化过程中的主要调控机制1，相关综述见2-4。
小鼠遗传学是研究人类基因和疾病的一种强大工具。对小鼠和人类基因组的比较分析显示，超过90%的基因组存在同线性保守5。此外，用于小鼠模型的许多技术也可应用于人类基因的研究，例如基因敲除和等位基因替换6。然而，构建转基因小鼠需要大量财力和技术资源。目前已有多个项目致力于建立基因敲除小鼠品系库（KOMP、EUCOMM、NorCOMM）或诱变小鼠品系库（RIKEN），这些工作需要大规模的协作与投入7。因此，在转向小鼠模型之前，最好首先在原代细胞的细胞培养模型中研究目标基因的表型。
逆转录病毒DNA倾向于整合到宿主DNA的转录单元内部或附近，或CpG岛区域，从而在避免转录沉默的同时，实现所包装目的基因的稳定且可遗传的表达89。随后，这些基因在高效逆转录病毒启动子的调控下进行转录，从而实现高效的转录和蛋白质表达。因此，只要细胞处于有丝分裂的活跃状态，逆转录病毒表达系统即可用于那些难以转染的细胞。由于病毒的结构基因存在于包装细胞系中，用于克隆目的基因的表达载体不包含任何病毒结构基因，这不仅消除了病毒回复突变的可能性，也提高了操作病毒上清液的安全性，因为不会产生具有感染性的病毒颗粒10。
本文介绍了一种重组逆转录病毒的制备及其后续感染脾B细胞的实验方案。分离得到的脾细胞经培养后，使用Th细胞来源的淋巴因子和抗CD40抗体进行刺激，可诱导B细胞大量增殖与分化11。该方案适用于研究B细胞发育与分化后期阶段的生物学事件，因为B细胞取自脾脏，处于造血初始事件之后、但尚未接受抗原刺激以诱导浆细胞分化的阶段。

本文描述了一种在脾脏B淋巴细胞的ex vivo培养体系中对基因结构与功能进行高效分析的系统。该方法利用无辅助的嗜生态型包装细胞系进行重组逆转录病毒的生产，可在原代淋巴细胞中实现目的基因的稳定且可遗传的表达，从而诱导经历类别转换重组的B细胞产生表面抗体。

重组逆转录病毒的制备及B细胞感染

在真核细胞中进行基因的转基因表达是一种强大的反向遗传学方法，其中目的基因在特定调控序列的控制下得以表达……

本实验的总体目标是实现目的基因的稳定遗传表达。在此案例中，将类别转换调控因子AID导入AID基因缺陷型小鼠的原代B淋巴细胞中。具体步骤为：分离并纯化脾脏B细胞，利用抗CD40抗体和IL-4进行活化；将编码AID的构建体转染至包装细胞系，以产生包含该基因的病毒颗粒；随后，用包装细胞产生的重组逆转录病毒感染预先活化的B细胞。随后将细胞继续培养47至72小时，以使其生长、增殖并表达导入的构建体。最后，通过流式细胞术对细胞进行染色，检测其表面是否存在类别转换抗体。该技术相较于现有方法（如小鼠模型）的主要优势在于，所需的资金和专业技术资源大大减少，同时仍可在严格无菌操作条件下，高效地对目标基因的结构与功能进行分析。取3至6月龄ID缺陷小鼠的脾脏，将器官置于含15%胎牛血清（FBS）的冷磷酸盐缓冲液（PBS）中，冰上保存，直至所有脾脏均采集完毕。将脾组织通过置于6孔板上的滤网研磨，6孔板中预先加入5毫升含2.5% FBS的PBS。将研磨后的细胞悬液转移至15毫升离心管中，在4°C、1000 RPM条件下离心10分钟。弃去上清液，轻轻弹击离心管以重悬细胞沉淀。将细胞沉淀重悬于10毫升红细胞裂解液中，室温孵育7分钟。为避免红细胞污染，离心裂解后的细胞以洗涤并倾倒上清液。将沉淀重悬于10毫升含2.5% FBS的PBS中，用台盼蓝排除死细胞后，按1:1000稀释，使用标准血细胞计数板对细胞进行计数。每个脾脏可获得约 2000 万至 3000 万个细胞，将细胞再次离心，并重悬于含有 2 毫摩尔 EDTA 的 0.5% B-S-A-P-B-S 中，细胞浓度为每 90 微升含 1000 万个细胞。向细胞中加入包被抗 CD43 抗体的磁珠，以特异性结合非 B 细胞。每 1000 万个细胞使用 10 微升磁珠。充分混匀后，将细胞在4°C条件下孵育20分钟以进行标记。细胞标记完成后，用2.5% FBS-PBS补满离心管，离心洗涤细胞。弃去上清液后，将细胞重悬于含EDTA的0.5% BSA-PBS中，浓度为每毫升1亿个细胞，然后将磁性分选柱安装在磁性分离器上。将一个锥形管置于层析柱正下方以收集穿流液，加入 3 毫升冰冷的 0.5% B-S-A-P-B-S 上样，用于预平衡和洗涤层析柱。待洗涤液完全流尽后，将样品加入层析柱中，每根层析柱仅上样 1 毫升细胞悬液，必要时可使用多根层析柱。让细胞自然流经层析柱，并用层析柱下方的锥形管收集未结合的细胞。继续收集流穿液，用 3 毫升 0.5% B-S-A-P-B-S 重复洗涤柱子四次。洗涤完成后，可弃去柱子。保留流穿液，其中将富集 CD43 阴性静息 B 细胞。将流穿液离心，并将沉淀重悬于10毫升完全RPMI培养基中。对细胞进行计数，并调整培养基体积，使细胞浓度达到每毫升100万个细胞，以刺激B细胞的生长与增殖。在培养基中添加重组 IL-4 和抗 CD

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

重组逆转录病毒的生产和B细胞的感染

该技术展示了一种高效制备编码人癌基因的复制缺陷型逆转录病毒储备液的方法，并可用于在小鼠模型中诱导骨髓增殖性疾病。...

通过瞬时转染293T细胞生产复制缺陷型逆转录病毒

一种制备昆虫细胞并用杆状病毒感染以生产重组mCD1d蛋白及生成mCD1d四聚体的方法。...

一种在昆虫细胞中生产重组mCD1d蛋白的方法

一种快速、简便且经济高效的方案，用于制备供体来源的多病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞（rCTL），以输注给存在CMV、Adv或EBV感染风险的异基因造血干细胞移植（HSCT）受者。该制备工艺符合GMP标准，有助于推动T细胞免疫治疗在专科中心以外的更广泛应用。...

多病毒特异性T细胞的制备用于预防和治疗异基因造血干细胞移植后病毒感染

来源： Zjablovskaja, P., 等小鼠髓系前体32D/G-CSF-R细胞的增殖与分化 J. Vis. Exp.

用于基因转移的逆转录病毒颗粒的制备

我们描述了一种从感染细胞的基因组DNA中扩增逆转录病毒整合位点、对扩增的病毒-宿主连接区域进行测序，并将这些序列比对至参考基因组的实验方案。此外，我们还介绍了利用BEDTools量化整合位点在不同基因组注释区域相对分布的技术。...

逆转录病毒整合位点的扩增、下一代测序与基因组DNA定位

本文介绍一种通过将具有目标抗原特异性的现有T细胞受体（TCR）的TCRα或TCRβ链，与外周T细胞受体库中的互补半链配对，从而生成抗原特异性T细胞受体（TCR）的新方法。de...

生成中 从头合成 通过逆转录病毒转导中心半链获得抗原特异性人T细胞受体

为了理解调控T细胞发育及其在免疫应答中功能的机制，人们已采用多种实验系统。本文介绍一种使用逆转录病毒转导的遗传学方法，该方法经济、高效，且最重要的是，能够高度有效地识别调控通路。...

逆转录病毒感染辅助性T细胞作为一种研究调控其分化与功能机制的遗传学方法

本文提供了一种在小鼠骨髓来源的树突状细胞和巨噬细胞中表达荧光融合蛋白的详细实验方案。该方法基于利用逆转录病毒载体转导骨髓前体细胞，随后将其分化为巨噬细胞和树突状细胞。 体外.

小鼠骨髓来源树突状细胞和巨噬细胞中荧光融合蛋白的表达

我们概述了一项为期9天的实验方案，用于转导并扩增恒河猴外周血单个核细胞，可获得数量充足、目的基因共表达效果优良的细胞，适用于细胞疗效输注研究。...

九天内实现原代T细胞的转导与扩增并维持中央记忆表型

本文介绍了一种用于逆转录病毒过表达及小鼠B-1a细胞过继转移的方法，以研究B-1a细胞在体内的迁移与定位。该方案可进一步扩展用于多种下游功能检测，包括定量分析供体B-1a细胞的定位，或在过继转移后检测供体细胞衍生的分泌因子。...

在小鼠B-1a细胞中通过逆转录病毒过表达CXCR4并进行过继转移，以实现B-1a细胞向骨髓的靶向迁移及IgM的产生

了解重组逆转录病毒生产与原代B淋巴细胞感染技术，用于稳定表达AID基因并分析类别转换重组机制。该方法通过流式细胞术检测表面抗体，为免疫学研究提供高效且经济的基因功能分析平台。

重组逆转录病毒的制备及B细胞感染

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