全肝脱细胞与再细胞化

本实验的总体目标是利用脱细胞肝脏基质制备工程化肝脏移植物。该过程首先对供体肝脏进行插管，随后通过一系列去垢剂溶液灌注，实现器官的脱细胞化。

通过灌注将成年原代肝细胞引入脱细胞肝脏基质，以实现其再血管化。最后，利用体外灌注系统培养细胞化肝脏移植物。最终，可通过检测灌注液中白蛋白、尿素及总胆汁酸的分泌情况，在体外评估经尺寸调整后的移植物的肝功能。

与现有的微型化技术（如使用合成生物材料制备支架和传统组织工程技术）相比，该技术的主要优势在于，据我看来，其具有组织特异性的细胞外基质成分。灌注脱细胞支架还具备组织特异性的微观结构，例如血管结构。血管结构的存在使我们能够更均匀地将细胞重新引入支架中。

它还能使我们以营养物质均匀灌注，以提高细胞存活率。本方案的减速部分将由本实验室的博士后研究员尼玛（Nima）进行演示。再零售化部分将由同样是博士后研究员的加布里埃尔·普赖斯（Gabriel Price）进行演示。

她的研究重点是这些移植物的工业化。进行灌注脱细胞时，首先通过门静脉插管获取大鼠肝脏。使用18号导管，保持下腔静脉和上腔静脉开放。将器官置于含有磷酸盐缓冲液（PBS）的10厘米培养皿中，保持湿润。

接下来，建立一个灌注系统，该系统包括一个八升的储液罐、蠕动泵和一个除泡装置。用磷酸盐缓冲液（PBS）填充灌注系统，并持续运行10分钟。然后，用PBS填充一个直径10厘米的培养皿，并将缓冲液的流速调低至1.2毫升每分钟。

将收获的肝脏小心转移至含有 PBS 的培养皿中，使其在其中灌注过夜。次日，用 0.01% 的 ESAL 硫酸钠或 SDS 溶于蒸馏水中对肝脏灌注五分钟。

然后换回 PBS 灌注 1 小时。重复 SDS 和 PBS 罐注步骤三次，每次将 SDS 灌注时间分别增加至 10、15，最后至 20 分钟。随后用以下系列浓度的 0.01% SDS 灌注肝脏 24 小时。

0.1% SDS 处理 24 小时。0.2% SDS 处理 3 小时，0.5% SDS 处理 3 小时。蒸馏水洗涤 15 分钟，再用含 1% Triton X-100 的蒸馏水处理 30 分钟，以去除所有结合的核酸。

最后，用 PBS 冲洗两小时，可在灌注完成后根据需要清洗脱细胞肝脏基质（DLM）；除保留中叶外，切除所有其他肝叶。将 DLM 置于含有 PBS 的洁净且密封的培养皿中，在 4°C 下保存直至使用。为对 DLM 进行灭菌，用含有 0.1% 过乙酸和 4% 乙醇的无菌 PBS 冲洗，并在 4°C 下孵育三小时。

接下来，用无菌 PBS 清洗 DLM 两次，然后用含有 2% 青霉素-链霉素、10 微克/毫升庆大霉素和 2.5 微克/毫升两性霉素 B 的 PBS 清洗。将脱细胞肝脏置于相同的溶液中，于 4 摄氏度保存，直至用于后续实验。

第二步，在组织培养罩内对脱细胞肝脏基质进行细胞化。使用与脱细胞肝脏时相似的灌注系统。向灌注系统中加入200毫升培养基，例如高糖DMEM，含10%胎牛血清、100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素。

将DLM放入灌注室中，并在泵以5毫升/分钟运行时，通过门静脉插管将其连接至灌注系统。为避免产生气泡，让培养基灌注DLM 30分钟。接着，停止灌注系统的流动，通过除泡阱缓慢注入从成年大鼠分离得到的5000万个肝细胞。

以每分钟10毫升的速度重新启动流动，并使培养基循环10分钟。再次停止培养基的流动。注入额外的5000万个肝细胞。

然后以每分钟10毫升的流速重新启动灌注。重复此操作，直至总共向DLM中引入2亿个肝细胞。所有细胞注入DLM后，收集流出液至50毫升离心管中，于800转/分钟离心5分钟。

弃去上清液，将沉淀合并至一个离心管中。通过台盼蓝排斥法测定细胞数量及其活力，以确定培养的接种效率。

对肝脏移植物进行细胞化。建立一个包含氧合器的无菌灌注系统。用50毫升培养基（如Williams E培养基，含5% PBS和0.5单位/毫升胰岛素）填充灌注系统。

每毫升含20纳克EGF、每毫升含14纳克胰高血糖素、每毫升含7.5微克氢化可的松、每毫升含100单位青霉素以及每毫升含100微克链霉素。将细胞化肝脏移植物放入灌注室中，并在泵以每分钟5毫升的流速运行时，通过门静脉插管将其连接至灌注系统。

为避免产生气泡，需无菌条件下关闭灌注室并严密密封，防止培养过程中发生泄漏。将灌注系统置于37°C、10%二氧化碳环境中孵育，并将灌注流速提高至15毫升/分钟。将氧合器连接至95%氧气和5%二氧化碳的混合气体气源，并将气体流速设定为0.5升/分钟。

这应使氧分压达到约400毫米汞柱。持续培养最多10天，每天更换培养基。每天取样检测培养基中的白蛋白、尿素和总胆汁酸分泌量，以监测移植物在培养结束时的肝功能。

取细胞化肝脏移植物用于分子和组织学分析。大鼠肝脏的完全脱细胞过程大约需要72小时。采用所述方案进行。

所得基质保留了天然肝脏中100%的纤维状胶原、50%的糖胺聚糖以及仅5%的DNA。腐蚀铸型和扫描电子显微镜分析证实，该基质的血管结构得以保存。脱细胞肝脏基质（DLM）中血管微结构的存在，使其细胞再接种效率达到96%，并有利于后续的灌注操作。

对于体外培养，该再细胞化肝脏移植物可在体外培养长达10天，并表现出正常的肝功能，这已通过白蛋白、尿素和总胆汁酸的分泌得到证实。因此，在观看本视频后，您应能够充分理解如何对整个肝脏进行脱细胞和再细胞化处理。