0 次观看 • 3:20 分钟 • September 26th, 2025
取一个微孔板，其中含有海藻酸盐样品，该物质是由铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）产生的一种保护性胞外多糖。
制备海藻酸钠衍生标准品的系列稀释液，以定量样品中的海藻酸钠浓度。
加入包被缓冲液并孵育，以促进分子与孔板表面的结合。
洗涤以去除未结合的分子。
使用封闭剂孵育，以封闭非特异性结合位点。
洗涤，然后与特异性针对海藻酸盐的一抗孵育。
再次洗涤，然后加入针对一抗的酶标记二抗进行孵育。
洗涤后，加入显色底物孵育，该底物被酶氧化生成有色产物。
加入酸性溶液以终止反应，并增强颜色，从而实现比色检测。
使用微孔板读数仪测量颜色强度。
根据标准品稀释液的荧光强度绘制标准曲线，并将样品的荧光强度代入标准曲线以确定海藻酸钠浓度。
使用微量移液器，将50微升收集的样品加入未经处理的96孔板中。
然后向孔中加入 50 µL ELISA 包被缓冲液。将酶标板在 37 °C 下孵育 2 小时。使用洗瓶，用 PBS-T 洗涤酶标板孔 2 次，每次将孔注满后翻转酶标板使其排干。
用微量移液器向各孔中加入 200 微升封闭缓冲液，在 4 摄氏度下孵育过夜。次日，用 PBS-T 按前述方法洗涤平板两次。然后向各孔中加入 100 微升稀释的一抗，于 37 摄氏度孵育 1 至 2 小时。
孵育结束后，用 PBS-T 缓冲液按前述方法洗涤酶标板各孔三次。接着，向各孔中加入 100 微升稀释后的二抗溶液，于 37 摄氏度孵育一至两小时。再次洗涤酶标板三次后，使用微量移液器向每孔加入 100 微升 TMB ELISA 溶液。
将酶标板放入抽屉中或用锡箔纸包裹，于室温避光孵育30分钟。然后加入100 µL终止液。使用酶标仪在450 nm波长下测定OD值。
通过测定已知浓度的D-甘露糖醛酸系列稀释液在450 nm处的吸光度（OD450）绘制标准曲线。重复测定两次，并拟合线性方程。利用标准曲线计算各样品中海藻酸盐的浓度，并将线性方程所得海藻酸盐浓度除以OD600，得到每单位OD600的海藻酸盐总量。