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Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

从巨纤维通路的电生理记录 D。果蝇

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12:53 min

January 14, 2011

DOI: 10.3791/2412-v

Hrvoje Augustin¹, Marcus J. Allen², Linda Partridge¹

¹Institute of Healthy Ageing, and GEE,University College London - UCL, ²School of Biosciences,University of Kent

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Summary

巨人的光纤系统是一个简单的成人神经电路

Transcript

该程序的总体目标是通过在巨纤维直接刺激神经元后记录来自背纵肌或 DLM 和 Togo tro 房角肌或 TTM 的突触后电位来监测通过巨纤维通路的突触传递。这是通过首先将麻醉的苍蝇正确固定在含有少许蜡的盘子中来实现的。该程序的下一步是将刺激性接地和记录电极插入飞行中。

该程序的最后一步是刺激大脑并记录跳跃和飞行肌肉的反应。最终，可以获得显示巨纤维通路的功能特性随基因型年龄、温度等而变化的结果。通过记录刺激和响应之间的时间量，并通过计算高频刺激序列之后成功响应的数量。

这种方法可以帮助解决神经生理学领域的一些关键问题，并有助于检查神经元通路的功能特性。该技术既可以作为介绍性实验，然后进行遗传或分子分析，也可以作为评估携带已知突变的动物的生理和功能特性的一种方式。这种方法的视觉演示至关重要。

由于准备和损伤步骤需要一些时间来学习。原因果蝇相对较小，在正确进行实验之前需要获得一定程度的稳定性和协调性。这些实验使用标准的电生理学设置，该装置由一个刺激器、一个刺激隔离单元、两个微电极放大器、一个数据采集系统和一台带有收集软件的计算机组成。

其他设备包括法拉第笼、吊架上的立体显微镜、隔振台、光源和记录平台。使用了五个微型纵器。两个微型机械手需要精细控制来定位记录电极，而其他三个微型机械手只需要粗略控制。

为了定位两个刺激电极和接地电极，将 DLM 记录电极的纵器放置在制剂的尾端。用于 TTM 记录电极的微型纵器放置在实验者和制剂的侧面之间。用于刺激电极的两个微纵器放置在制剂的头部。

用于接地电极的微型纵器放置在制剂的远侧。拉动电阻为 40 至 60 兆欧姆的玻璃记录微电极，并平放在由蜡支撑的培养皿中。使用两个电磁磨尖的钨电极进行刺激。

使用茎丝或第三个电磁制造的电极。作为地面，在实验开始之前将刺激电极和接地电极连接到微型纵器上。在会议期间不需要更换它们。

设备设置好后，就该准备苍蝇了。通过在冰上冷却 10 到 15 分钟来麻醉苍蝇。用镊子通过苍蝇的腿轻轻地将苍蝇转移到一个装有软蜡平台的培养皿中，该平台以大约 45 度的角度倾斜。

下一步是固定飞入蜡。将苍蝇腹侧朝下，使其前部朝上在斜坡上。使用一对细镊子，成对地向外伸展腿，然后将它们推入蜡中。

一旦您熟悉了在开始本实验之前要记录的肌肉的位置，背纵肌或 DLM 以及 turga TRO 房角肌或 TTM，DLMS 的皮下附着部位对应于胸中线和前背毛之间的区域。TTM 附着部位位于鼻翼上后毛和前鼻翼刷毛的背侧，确保翅膀不会阻碍 DLM 或 TTM 纤维的进入，将翅膀向外固定并将它们粘在蜡上。使用一对细镊子，小心地将 psis 向外拉，并浸入蜡中固定。

这是一个关键步骤，需要一些练习，因为长鼻很柔软，很容易与头部的其他部分分离。如果发生这种情况，请丢弃苍蝇并重新开始。未能以这种方式固定头部会导致通过眼睛插入刺激电极时出现问题。

一旦苍蝇锚定在蜡上，将制剂放在立体显微镜下法拉第笼内，将苍蝇的头部侧向实验者的右侧。下一步是插入电极。在微型纵器的帮助下，将电极靠近插入部位，以促进其正确放置和后续记录，而无需通过内窥镜观察，使用微型纵器上的调节轮将接地电极降低到腹部后端，将锋利的钨刺激电极放置在大脑中。

使用微型纵器定位其中一个电极的尖端，使其刚好接触到果蝇的一只眼睛。对另一个电极执行相同的作，使两个电极都刚接触每只眼睛的外侧。然后将电极推入。

穿过每只眼睛约 2 到 3 毫米，使电极的尖端到达位于头囊后部的大脑。正确放置的电极将激活巨大的纤维系统，以测试刺激电极是否放置正确。在刺激电极上施加 30 到 60 伏特的短刺激，观察翅膀的运动和飞行或腿部肌肉的抽搐。

下一步是使用 Hamilton 或热拉塑料注射器用三摩尔氯化钾回填玻璃微电极，并将它们放入精细控制微纵器中。正确插入的微电极可用于多轮实验。第一个记录电极将插入 A DLM 光纤。

有两个双侧对称的 dlm。每根都由六根单独的肌肉纤维组成。可以从六根纤维中的任何一根进行记录，但是，最常用的是 DLM 纤维 45 A 和 45 B，因为它们可以通过胸部角质层的背侧很好地接近，并且两种纤维都是由相同的运动神经元创新的事实。

使用放置在制备插入器尾部的微型纵器，将电极记录到最远的飞行一侧的 DLM 光纤 45 A 或 B 中。平台的坡度允许 DLM 电极以 60 至 90 度角进入背侧角质层，这有助于在示波器模式下使用软件进行穿透。将记录电极插入胸部时，查看计算机显示器。

当电极进入肌肉时，基线下降到接近或负值测试，只需一次刺激，看看您是否可以观察到肌肉反应。将另一个记录电极插入离您最近的门襟一侧的 TTM 中。由于肌肉附着部位的位置，该电极横向插入您面前。

同样，在执行此作时观察显示器。一旦轨迹表明电极在肌肉测试中，只需一次刺激即可引发肌肉反应。要开始刺激大脑并记录腿部和飞行肌肉的反应，请在刺激电极上施加 0.03 毫秒的刺激，从 30 伏开始增加到 60 伏，直到您在计算机显示器上观察到肌肉抽搐和肌肉细胞去极化。

对于实验的其余部分，将电压设置为高于响应阈值的 5 到 10 伏特。测量响应延迟。至少给予 5 次单次刺激，每次刺激之间有 5 秒的休息时间。

通过提供不同速率的刺激序列来确定跟随的频率。通常，以 100 赫兹、200 赫兹和 300 赫兹的速度给出 10 列 10 个刺激，每列刺激之间允许两秒钟的休息时间。该图显示了对大脑的单次刺激后从 TTM 和 dlm 记录的反应。

响应潜伏期是大脑刺激和肌肉去极化之间的时间。G-F-T-T-M 通路的潜伏期在 0.7 到 1.2 毫秒之间，GF DLM 通路的潜伏期在 1.2 到 1.7 毫秒之间，表明健康的准备和正确的记录技术。延迟可能因基因型、遗传背景、温度和年龄而异，如下所示。

与来自大型 DLM 纤维的记录相比，来自 TTM 的记录在突触后电位的振幅和形状方面显示出更大的可变性。这种增加的可变性是由于 TTM 肌肉纤维的小尺寸。然而，这种可变性不会影响 giant fiber 到 TTM 通路的响应延迟值。

该图显示了 100 赫兹的 TTM 和 DLM 刺激，以及 100 赫兹的 200 赫兹刺激。TTM 和 dlms 都对 200 赫兹的所有 10 种刺激做出反应。TTM 响应仍然是一对一的，但是，DLM 响应开始失败。

DLM 在刺激频率高于 100 赫兹时无法跟随的原因是两个神经元间之间的中间化学突触没有足够的时间在刺激之间恢复。一旦掌握，这项技术可以在大约 30 分钟内完成。看完这个视频，你应该对如何通过巨纤维通路监测神经传递有了很好的了解。

这是通过刺激巨纤维进入大脑中的神经元，然后从胸部的跳跃肌和飞行肌进行记录来实现的。

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